食管鱗狀細胞癌中SFRP基因家族啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測*

郭艷麗， 郭 煒， 鄺 鋼， 楊植彬， 董稚明

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011)

食管鱗狀細胞癌中SFRP基因家族啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測*

郭艷麗， 郭 煒， 鄺 鋼， 楊植彬， 董稚明△

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北 石家莊 050011)

目的檢測食管鱗狀細胞癌(ESCC)中Wnt通路拮抗基因家族分泌型卷曲相關蛋白(SFRP)基因的甲基化狀態(tài)，探討其與食管鱗癌發(fā)生的關系。方法應用甲基化特異性PCR(MS-PCR)及RT-PCR的方法檢測78例食管鱗癌及相應癌旁非腫瘤組織中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化狀態(tài)及mRNA表達情況，并分析其與Wnt通路中心因子β-catenin蛋白表達的關系。結果在食管鱗癌組織中，SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化率分別為65.4%(51/78)、69.2%(54/78)、62.8%(49/78)和52.6%(41/78)，均明顯高于癌旁非腫瘤組織(P<0.01)。這4個基因的甲基化率與腫瘤患者的組織學分級及臨床分期均無關,但它們共同發(fā)生甲基化的頻率則與臨床分期顯著相關(P<0.05)。這4個基因mRNA的陽性表達率分別為42.3%(33/78)、46.2%(36/78)、50.0%(39/78)和39.7%(31/78)，均明顯低于癌旁非腫瘤組織(P<0.01)。在發(fā)生甲基化的食管癌組織中這4個基因的mRNA表達陽性率及β-catenin蛋白的異質表達率均明顯低于未發(fā)生甲基化的癌組織，且差異顯著(P<0.05)。結論食管鱗癌組織中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因均呈高甲基化狀態(tài)，并有可能通過Wnt/β-catenin信號轉導通路參與了食管癌的發(fā)生。聯(lián)合檢測SFRP基因家族甲基化狀態(tài)對于食管癌的預后判斷有一定指導意義。

食管腫瘤; 甲基化; 分泌型卷曲相關蛋白; Wnt通路

分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRP)基因家族作為腫瘤抑制基因，是Wnt/β-catenin信號轉導通路的拮抗基因，其表達的下調可減弱對通路的抑制作用，促使通路活化，被激活的Wnt信號轉導通路可參與人類多種腫瘤的發(fā)生[1,2]。有研究表明，基因啟動子區(qū)5′端 CpG島甲基化可能是引起基因表達下調的重要機制。本研究檢測了中國食管癌高發(fā)區(qū)78例食管癌患者的癌及癌旁組織中SFRP基因家族的甲基化狀態(tài)及其mRNA表達情況，探討其與食管癌發(fā)生的關系及可能的作用機制，以期從分子水平揭示食管癌的病因。

材 料 和 方 法

1主要試劑

蛋白酶K(Merck)；氫醌(Sigma)；亞硫酸氫鈉(Sigma)；Wizard DNA 純化試劑盒(Promega)；Trizol(Invitrogen)，引物(北京賽百勝公司合成)。即用型免疫組織化學SP試劑盒(SP-9000，中衫金橋)，鼠抗人單克隆抗體β-catenin(CAT-5H10, Zymed Laboratories，1∶100稀釋)。

2研究對象和標本來源

研究對象選擇河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科及河北省磁縣腫瘤醫(yī)院2004年-2006年收治的食管癌患者78例，并確定患者均來自河北省太行山區(qū)的食管癌高發(fā)區(qū)，其中男性57例，女性21例，年齡范圍26-78歲，平均年齡57.9歲。全部患者術前均未經(jīng)化療和放療。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及距癌組織2-5 cm處的癌旁組織，手術切除標本一部分-80 ℃低溫冰箱保存提取DNA及RNA，另一部分標本進行石蠟包埋，常規(guī)HE染色，證實癌旁均為非腫瘤組織，并確定標本的組織學類型均為食管鱗狀細胞癌?；颊叩呐R床分期及組織學分級情況見表2。本研究經(jīng)所有患者知情同意。

3方法

3.1甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MS-PCR)法 采用酚/氯仿抽提法，提取組織DNA，進行定量后，取適量DNA標本用亞硫酸氫鹽處理。單鏈DNA的未甲基化胞嘧啶可被亞硫酸氫鹽脫去氨基而轉變成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不能被修飾。根據(jù)此原理設計該基因的甲基化及非甲基化引物，分別進行擴增。PCR反應體系為20 μL,其中模板DNA 100 ng，10×PCR緩沖液2 μL，MgCl23.0mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U，dNTPs 200 μmol/L；反應條件為95 ℃預變性10 min后，94 ℃變性45 s，退火50 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)后，72 ℃ 10 min。引物及退火溫度見表1。用經(jīng)甲基化酶(Sss I)處理以后的基因組DNA作為甲基化的陽性對照，用無消化系統(tǒng)腫瘤及其它系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化的陽性對照，陰性對照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR。另隨機選取10%標本進行重復實驗以驗證結果的可靠性。

3.2DNA亞硫酸氫鹽修飾完整性及結果的判定 同一樣品DNA在亞硫酸氫鹽修飾前與修飾后均用甲基化特異性引物和非甲基化特異引物擴增，如修飾前無任何目的條帶擴增而修飾后有目的條帶擴增，則亞硫酸氫鹽修飾完全。擴增后，若甲基化引物擴增出了特異性條帶，而非甲基化引物未擴增出條帶，則為完全甲基化；若甲基化引物和非甲基化引物均擴增出了條帶，則為不完全甲基化；若只有非甲基化引物擴增出了條帶，則為非甲基化。

3.3RT-PCR檢測 按Trizol試劑說明書提取組織總RNA，并參照逆轉錄試劑盒(reverse transcription system A3500，Promega)說明將 RNA逆轉錄成cDNA。PCR反應體系為20 μL,其中模板 cDNA 100 ng,10×PCR緩沖液2 μL,MgCl21.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U,dNTPs 200 μmol/L；反應條件為：95 ℃預變性3 min后，94 ℃ 45 s，退火45 s，72 ℃ 45 s,30個循環(huán)后，72 ℃ 5 min。PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH作為內參照，其引物及退火溫度見表1。

3.4免疫組化檢測β-catenin的表達 應用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用pH8.5的EDTA高壓修復3 min，羊血清封閉，再依次加入Ⅰ抗、Ⅱ抗和Ⅲ抗，DAB顯色，蘇木精復染。以PBS代替Ⅰ抗作空白對照。β-catenin蛋白免疫組化染色鏡下觀察為胞漿/胞膜著色。將胞質的異常積聚(胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒)定義為異質表達，將胞膜著色或無著色定義為陰性表達,見圖1。

4統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS軟件包(11.5版)進行。各組間的差異用2檢驗及連續(xù)性校正進行分析，雙側檢驗。

結 果

1食管鱗狀細胞癌組織中SFRP基因甲基化狀態(tài)分析

78例食管鱗癌及相應癌旁組織均成功進行了MS-PCR檢測，結果共有4種情況：(1)腫瘤組織特異性甲基化，即僅腫瘤組織出現(xiàn)了甲基化條帶；(2)腫瘤組織發(fā)生完全甲基化，非腫瘤組織發(fā)生不完全甲基化；(3)腫瘤組織及非腫瘤組織均發(fā)生了不完全甲基化；(4)腫瘤組織及非腫瘤組織均未發(fā)生甲基化,見圖2。將不完全甲基化計入甲基化進行統(tǒng)計，則食管癌組織中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化率分別為65.4%(51/78)、69.2%(54/78)、62.8%(49/78)和52.6%(41/78)，明顯高于癌旁非腫瘤組織，差異顯著(P<0.05)，見表2。同時，實驗觀察到在發(fā)生甲基化的癌旁組織中其甲基化條帶均表現(xiàn)為不完全甲基化，而相對應的腫瘤組織則表現(xiàn)為強甲基化狀態(tài)。

表1 SFRP基因家族引物序列及PCR條件

Figure 1. The expression of β-catenin in ESCC(DAB ×400).A: the ectopic expression of β-catenin in ESCC; B: the negative expression of β-catenin in ESCC.

2SFRP基因甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)的關系

SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因的甲基化頻率與食管癌患者的組織學分級及TNM分期均無關(P>0.05)。在這4個基因的聯(lián)合分析中發(fā)現(xiàn)，這些基因共同發(fā)生甲基化的頻率在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者中明顯高于Ⅰ、Ⅱ期腫瘤患者，差異顯著(P<0.05)，但與腫瘤組織的組織學分級無關,見表3。

表2 食管鱗癌及癌旁非腫瘤組織中SFRP基因家族甲基化狀態(tài)及mRNA表達情況

表3 食管鱗癌中SFRP基因家族甲基化狀態(tài)與臨床病理參數(shù)的關系

Figure 2. Methylation analysis of SFRP genes.MS-PCR results of the SFRP genes in 4 matched pairs(case 1-case 4) of tumor tissue(T) and non-cancer tissue(N). M: methylated genes; U: unmethylated genes. The tumor is fully methylated and the non-cancer tissue is incompletely methylated: case 3 of SFRP1, case 3 of SFRP4 and case 1 of SFRP5.Both tumor and non-cancer tissue are incompletely methylated: case 2,4 of SFRP1, case 1,2 of SFRP2 and case 2 of SFRP4.Both tumor and non-cancer tissue are unmethylated: case 2 of SFRP5.Other cases showed tumor-specific methylation.

3食管鱗癌SFRPmRNA表達情況及其與基因甲基化的關系

食管鱗癌中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5的mRNA表達陽性率分別為42.3%(33/78)、46.2%(36/78)、50.0%(39/78)和39.7%(31/78)，明顯低于癌旁非腫瘤組織(P<0.01)，見表2、圖3;在發(fā)生甲基化的食管癌組織中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因mRNA表達水平均明顯低于未發(fā)生甲基化的癌組織，SFRP基因家族啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)和該基因在mRNA水平上的表達缺失有明顯的相關性(P<0.05)，見表4。

4食管鱗癌中SFRP基因家族甲基化狀態(tài)與β-catenin蛋白表達的相關性分析

食管癌組織中β-catenin蛋白的異質表達率為69.2%(54/78), 而相應癌旁非腫瘤組織中其異質表達率僅為12.8%(10/78)，差異顯著(2=51.293，P<0.01)；SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因在高甲基化的食管癌組織中β-catenin蛋白的異質表達率均明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織，該拮抗基因家族啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)和β-catenin蛋白的異質表達均有明顯的相關性(P<0.05)，見表4。

表4 食管鱗癌中SFRP基因在高甲基化及未甲基化組中mRNA及β-catenin表達情況

Figure 3. The mRNA expression of SFRP genes.RT-PCR results of the SFRP genes in 4 matched pairs(case 1-case 4) of tumor tissues(T) and non-cancer tissues(N). GAPDH is shown as a control. Most of the mRNA expression of SFRP genes was lower in ESCC tissues than those in non-cancer tissues.

討 論

Wnt信號通路調節(jié)控制著細胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等許多生命過程[3]，研究發(fā)現(xiàn)該通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生密切相關[1]。SFRP基因家族作為腫瘤候選抑癌基因，可通過捆綁Wnt信號蛋白，抑制通路的活化。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中均伴有SFRP基因的表達下調[2,4]，但引起基因表達下調的機制仍未完全闡明。Nojima等[5]及齊健等[6]在對胃癌及結直腸癌細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，SFRP基因的啟動子區(qū)存在高密度的甲基化，有效去除甲基化后能恢復基因轉錄。Takagi 等[7]在對肝細胞癌的研究中也發(fā)現(xiàn)SFRP基因的高甲基化與其表達的缺失有明顯的相關性，提示SFRP基因的高甲基化可能是基因轉錄抑制的關鍵因素。此次實驗也觀察了食管鱗狀細胞癌組織SFRP基因家族甲基化狀態(tài)與轉錄水平表達的關系，發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因均呈高甲基化狀態(tài)，并且，其甲基化發(fā)生率與該拮抗基因家族mRNA表達的缺失有明顯相關性，提示SFRP基因的高甲基化導致的轉錄沉默可能是食管癌發(fā)生的機制之一。 實驗中還觀察到在部分發(fā)生甲基化的腫瘤組織中，其mRNA也呈陽性表達，分析原因，可能是由于腫瘤組織發(fā)生甲基化的程度不夠，有研究報道CpG島甲基化的程度與轉錄的抑制程度有關[8]，當腫瘤組織中基因甲基化程度不足以完全抑制其轉錄時，即可出現(xiàn)上述情況。同時，研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)樣本中腫瘤組織的甲基化現(xiàn)象占有主導地位，具有特異性，但仍有部分癌旁非腫瘤組織中出現(xiàn)了SFRP基因的甲基化現(xiàn)象，但均表現(xiàn)為不完全甲基化，并且相應的腫瘤組織也同時存在該基因的高甲基化。究其原因，一是可能由于癌旁組織中混有微量的光學顯微鏡下難以觀察到的腫瘤組織，或是由于這種檢測出甲基化的癌旁組織具有癌變潛能，對Barrett’s食管的研究中發(fā)現(xiàn)，在正常組織中檢測到p16基因高甲基化的患者隨后出現(xiàn)了惡性轉化[9]。因此，這種腫瘤相關基因的表觀遺傳學失活可能是腫瘤發(fā)生的早期事件。

研究表明，在多種腫瘤組織和細胞株中SFRP基因存在高頻率的啟動子區(qū)甲基化情況，但不同腫瘤中基因的甲基化頻率與腫瘤分期及組織學類型之間的關系卻存在分歧。Veeck等[10]指出，在乳腺癌中SFRP1基因的高甲基化與腫瘤組織的臨床分期相關，但與組織的病理學分級及淋巴結轉移無關；而此次實驗與 Sogabe等[11]在對口腔鱗狀細胞癌的研究結果類似，均顯示SFRP1、2、4、5基因的甲基化頻率與腫瘤患者的TNM分期及組織學分級無明顯相關性。究其原因，腫瘤類型不同，尤其是腫瘤的病理學類型不同(如鱗癌或腺癌)，可能造成基因甲基化頻率的差異，再者研究對象人種的差異也可能對研究結果造成一定的影響，此外，由于抽樣誤差造成的研究樣本中腫瘤組織的分期和組織學分級的比例不同，也可能造成研究結果的差異。在對這4個基因的聯(lián)合檢測中發(fā)現(xiàn)，它們共同發(fā)生甲基化的頻率與腫瘤患者的臨床分期明顯相關。提示對SFRP基因家族的聯(lián)合檢測較單一指標的檢測對于食管鱗狀細胞癌的惡性生物學行為及預后的判斷更有意義。

Wnt信號轉導通路的激活取決于細胞內β-catenin的水平。正常情況下，β-catenin可與E-鈣黏蛋白形成復合體固定于細胞膜參與調節(jié)細胞的黏附，細胞質內的β-catenin可通過由Axin、APC、GSK-3β形成的降解復合體磷酸化而降解，使胞漿內β-catenin含量保持在較低水平；但當通路激活時，Wnt 蛋白與受體結合以某種方式激活Dvl 蛋白，它可使降解復合物中GSK-3β失活，從而抑制了β-catenin的降解，導致其在胞質內穩(wěn)定的累積。這種累積打破了細胞內原有的β-catenin出入核平衡，使β-catenin易位于細胞核，與LEF1/TCF轉錄復合體結合，調節(jié)下游靶基因的轉錄[12]。Urakami等[13]在對膀胱腫瘤細胞株的研究中發(fā)現(xiàn)，在用去甲基化藥物5-Aza-dC處理后，β-catenin表達衰減，并進一步用siRNA沉默拮抗基因時，可觀察到β-catenin表達的恢復，提示拮抗基因的下調表達可能增加β-catenin的胞漿積聚及經(jīng)典Wnt信號通路的激活。本研究也觀察了SFRP基因家族甲基化狀態(tài)與β-catenin蛋白異質表達的關系，發(fā)現(xiàn)食管癌組織中β-catenin蛋白的異質表達明顯高于癌旁組織，提示該通路在食管癌中可能處于激活狀態(tài)；同時在發(fā)生SFRP基因甲基化的食管癌組織中其β-catenin的異質表達率明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織，提示SFRP基因的高甲基化可能是引起β-catenin蛋白異質表達的機制之一，并可能通過Wnt/β-catenin信號轉導通路的活化參與了食管癌的發(fā)生。

本研究結果揭示在食管鱗狀細胞癌中SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5基因均呈高甲基化狀態(tài)，并在轉錄水平引起其表達下調，且有可能通過Wnt/β-catenin信號轉導通路參與了食管癌的發(fā)生，同時，結果提示了聯(lián)合檢測SFRP基因家族甲基化狀態(tài)對于食管癌的預后判斷有一定指導意義。

[1] Yamamoto H. Regulation of Wnt signaling pathway and its relationship with tumorigenesis[J]. Seikagaku, 2008, 80(12):1079-1093.

[2] Urakami S, Shiina H, Enokida H, et al. Combination analysis of hypermethylated Wnt-antagonist family genes as a novel epigenetic biomarker panel for bladder cancer detection[J]. Clin Cancer Res, 2006,12(7 Pt 1):2109-2116.

[3] 肖楚呤，潘云峰，郭興華，等.氯化鋰對人滑膜成纖維細胞增殖影響[J].中國病理生理雜志，2010，26(8)：1640-1642.

[4] 趙成海,卜獻民, 張 寧, 等. Wnt拮抗因子SFRP2在胃癌中的甲基化和異常表達[J]. 中國病理生理雜志，2009,25(8):1617-1620.

[5] Nojima M, Suzuki H, Toyota M, et al. Frequent epigenetic inactivation ofSFRPgenes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer[J]. Oncogene, 2007,26(32):4699-4713.

[6] 齊 健, 朱尤慶, 羅 峻, 等. 結直腸腫瘤中SFRP基因的甲基化及表達調控[J]. 中華腫瘤雜志,2007,29(11):842-845.

[7] Takagi H, Sasaki S, Suzuki H, et al. Frequent epigenetic inactivation ofSFRPgenes in hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2008,43(5):378-389.

[8] Bird A. Molecular biology. Methylation talk between histones and DNA[J]. Science, 2001,294(5549):2113-2115.

[9] Guo W, Dong Z, He M, et al. Aberrant methylation of thrombospondin-1 and its association with reduced expression in gastric cardia adenocarcinoma[J]. J Biomed Biotechnol, 2010,2010:721485.

[10]Veeck J, Niederacher D, An H, et al. Aberrant methylation of the Wnt antagonistSFRP1 in breast cancer is associated with unfavourable prognosis[J]. Oncogene, 2006,25(24): 3479-3488.

[11]Sogabe Y, Suzuki H, Toyota M, et al. Epigenetic inactivation ofSFRPgenes in oral squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2008,32(6):1253-1261.

[12]Nelson WJ, Nusse R. Convergence of Wnt, β-catenin, and cadherin pathways[J]. Science, 2004,303(5663):1483-1487.

[13]Urakami S, Shiina H, Enokida H, et al. Epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 plays an important role in bladder cancer through aberrant canonical Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Clin Cancer Res, 2006,12(2):383-391.

HypermethylationofSFRPgenesinesophagealsquamouscellcancer

GUO Yan-li, GUO Wei, KUANG Gang, YANG Zhi-bin, DONG Zhi-ming

(PathologyLaboratoryofHebeiCancerInstitute,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China.E-mail:dddzzzmmm@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the promoter methylation of secreted frizzled-related protein(SFRP) genes in esophageal squamous cell cancer(ESCC).METHODSThe methods of methylation-specific PCR(MS-PCR) and RT-PCR were applied to examine the CpG methylation of theSFRPpromoter and the mRNA expression ofSFRPgenes,respectively, in 78 samples of ESCC and corresponding adjacent non-cancer tissues. The protein expression of β-catenin was determined by immunohistochemistry.RESULTSIn the ESCC tissues, the frequencies of promoter methylation inSFRP1,SFRP2,SFRP4 andSFRP5 genes were 65.4%(51/78), 69.2%(54/78), 62.8%(49/78) and 52.6%(41/78),respectively, significantly higher than those in the adjacent tissues(P<0.01). The hypermethylation of these genes had no correlation with clinical stage and pathological classification in ESCC tissues(P>0.05). The frequency of simultaneous methylation of the 4 genes was correlated with the clinical stage(P<0.05). The positive rates of mRNA expression of the 4 genes in ESCC tissues were 42.3%(33/78), 46.2%(36/78), 50.0%(39/78) and 39.7%(31/78), respectively lower than those in the adjacent tissues(P<0.01). The mRNA expression ofSFRPgenes and the ectopic expression of β-catenin were correlated with the methylation frequency ofSFRPgenes(P<0.01).CONCLUSIONPromoter methylation ofSFRP1,SFRP2,SFRP4 andSFRP5 genes was a frequent event in ESCC, indicating a contribution to the pathogenesis of ESCC through aberrant canonical Wnt/β-catenin signaling pathway. Combination analysis of methylation status inSFRPgenes may has definite value on estimating prognosis of ESCC.

Esophageal neoplasms; Methylation; Secreted frizzled-related protein; Wnt pathway

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-013

1000-4718(2011)02-0278-06

2010-08-16

2010-10-18

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃資助項目(No.20090466)

△通訊作者 Tel: 0311-86095337; E-mail：dddzzzmmm@yahoo.com.cn