急性心肌梗死患者抗心肌肌球蛋白重鏈抗體誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡*

邵 靚， 劉 坤， 汪 莉， 丁艷萍， 廖玉華， 王朝暉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,湖北 武漢 430022)

·論著·

急性心肌梗死患者抗心肌肌球蛋白重鏈抗體誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡*

邵 靚， 劉 坤， 汪 莉， 丁艷萍， 廖玉華， 王朝暉△

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,湖北 武漢 430022)

目的探討抗心肌肌球蛋白重鏈抗體(AMHCA)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法從急性心肌梗死患者血清中提取AMHCA，研究其對(duì)成年大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。DNA末端標(biāo)記膜聯(lián)蛋白-V/PI復(fù)染色法觀察和測(cè)量心肌細(xì)胞凋亡。分別用免疫印跡、膜片鉗和激光共聚焦法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白P53和Bcl-2以及第二信使鈣離子的表達(dá)和濃度。結(jié)果AMHCA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有劑量依賴性。在此過(guò)程中，促凋亡的核蛋白P53促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，而抑凋亡的胞質(zhì)蛋白Bcl-2 抑制心肌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，胞內(nèi)鈣離子濃度升高，而L型鈣通道則沒(méi)有影響。結(jié)論急性心肌梗死患者體內(nèi)的AMHCA可能是一種新的起動(dòng)因子，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。

心肌梗死; 心肌球蛋白重鏈; 細(xì)胞凋亡; 蛋白質(zhì)P53; 蛋白質(zhì)Bcl-2; 鈣

急性心肌梗死是危害人類健康的重要疾病，也是導(dǎo)致心力衰竭的主要因素[1,2]。由急性心肌梗死向心衰的演變的過(guò)程中，神經(jīng)體液因子發(fā)揮著重要的作用。血管緊張素Ⅱ、醛固酮、腎上腺素和去甲腎上腺素能夠誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大和凋亡，而這種不可逆的改變則是導(dǎo)致心力衰竭中心室重塑的重要原因[3]。在過(guò)去的十?dāng)?shù)年里，越來(lái)越多的證據(jù)表明炎癥和免疫反應(yīng)在心室重塑的過(guò)程中扮演著重要的角色。一些致炎細(xì)胞因子對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生各種病理學(xué)作用。例如，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)能直接誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[4]。

促凋亡基因或抑凋亡基因在心肌中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)決定了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。心肌細(xì)胞的凋亡也和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加密切相關(guān)。鈣離子是一種與促凋亡基因和抑凋亡基因有關(guān)聯(lián)的重要的第二信使，它們共同構(gòu)成了細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑[5]。

臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，擴(kuò)張型心肌病中心肌細(xì)胞自身抗體能對(duì)心功能和心臟結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害[6]。既往的研究顯示，抗β1腎上腺素能受體、抗ADP/ATP 載體抗體和抗心肌肌球蛋白重鏈抗體(anti-cardiac myosin heavy chain antibodies, AMHCA)能夠促使心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子超負(fù)荷[7]。我們和其他的研究者先后報(bào)道了針對(duì)心肌肌球蛋白的自身抗體在急性心肌梗死的患者中具有較高的檢出率[8]。我們又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者中AMHCA陽(yáng)性患者的動(dòng)脈瘤發(fā)生率和病死率較高。因此，心肌肌球蛋白重鏈抗體可能與急性心肌梗死的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而AMHCA可能在此過(guò)程中起到了重要作用。但AMHCA在急性心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中僅僅是一旁觀者，還是發(fā)揮病理效應(yīng)仍需進(jìn)一步闡明。

本實(shí)驗(yàn)擬驗(yàn)證從急性心肌梗死患者血清中提取的AMHCA能否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，并研究凋亡相關(guān)的信號(hào)分子包括細(xì)胞核蛋白53(protein 53，P53)和胞漿蛋白B細(xì)胞瘤基因2(B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2)的表達(dá)以及L-型鈣離子通道和胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。

材 料 和 方 法

1病例、抗體檢測(cè)和純化

根據(jù)2008年ACC/AHA急性心肌梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，采集40例患者診斷為急性心肌梗死。其中男25例，女15例，平均年齡(60±10)歲。經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)AMHCA，測(cè)定特定的抗原肽序列，如下：Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-Asp;Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val;Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu。40例患者外周血中AMHCA為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)方案符合1963年《赫爾辛基宣言》所申明的原則和條款(1983年于威尼斯修改)。AMHCA陽(yáng)性的血清(約10 mL全血)經(jīng)親和層析的方法提純后備用(純度約為98.8%)。

AMHCA的特異性經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，并已為為其他研究的者所證實(shí)[9]。而AMHCA的純度是經(jīng)親和層析的方法提純所得，此方法是目前普遍采用的方法。

2成年大鼠心肌細(xì)胞的分離和實(shí)驗(yàn)分組

2.1試劑 (1)臺(tái)氏液(mmo/L):NaCl 135, KCl 5.4, MgCl21.0, NaH2PO40.33, CaCl21.8, Hepes 10, 葡萄糖 10(NaOH調(diào) pH 7.4)；(2)無(wú)鈣液(mmo/L): 臺(tái)氏液去掉CaCl2；(3)KB液(mmo/L): MgCl25, KCl 40, KH2PO420,?；撬?0, 谷氨酸50, EGTA 0.5, Hepes 10, 葡萄糖 10(KOH調(diào) pH 7.4)。

2.2方法 于無(wú)菌條件下，酶解法分離250-300 g成年大鼠心肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)大鼠均依照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》(NIH publication No. 23-85, 1996年修改)受到良好對(duì)待。快速游離大鼠心臟置于4 ℃臺(tái)氏液中，稍作修飾后主動(dòng)脈逆行插管, 通過(guò)Langendorff 37 ℃恒溫灌流裝置逆行灌流心臟。即先用無(wú)鈣液沖洗5 min,再用含有0.2 g/L Ⅱ型膠原酶(Worthington), 0.02 g/L蛋白酶E(Sigma), 0.2 g/L牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)的酶液循環(huán)灌流5 min, 最后用KB液沖洗3 min, 剪碎心室肌, 放入KB液溫孵, 反復(fù)傾出上清液, 靜置1 h備用。將新鮮分離的心肌細(xì)胞置含有10%胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的AMHCA，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。未加AMHCA的心肌細(xì)胞作為對(duì)照組。

3抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)AMHCA與心肌肌球重鏈蛋白的結(jié)合。作為Ⅰ抗的AMHCA稀釋度為1∶10 000，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗人IgG作為Ⅱ抗，稀釋度1∶7 500。通過(guò)免疫熒光法觀察AMHCA與心肌細(xì)胞的結(jié)合。將新鮮分離的大鼠心肌細(xì)胞凃片后常規(guī)固定、封閉。繼而將涂片與1∶100AMHCA 4 ℃孵育過(guò)夜。再加入1∶80 000異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗人IgG(Sigma)37 ℃溫育1 h。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV500)觀察心肌細(xì)胞上熒光結(jié)合的情況。

Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣量20-30 μg,用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)NC膜。5%脫脂奶封閉后,分別加入1∶1 000小鼠抗大鼠p53單克隆抗體(Abcam)和1∶1 000兔抗大鼠Bcl-2多克隆(PharMingen)抗體, 4 ℃孵育過(guò)夜,用含0.05%Tween-Tris緩沖鹽溶液洗3次,加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗。顯色后,采用Gelwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描,以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和半定量分析。

實(shí)驗(yàn)中，分別設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。將與抗原肽預(yù)孵后的AMHCA液和PBS液分別作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)的Ⅰ抗。

4凋亡檢測(cè)

4.1TUNEL 應(yīng)用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察單個(gè)心肌細(xì)胞的凋亡。TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

4.2Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法標(biāo)測(cè)凋亡的心肌細(xì)胞。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Becton Dickinson，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和相應(yīng)的軟件，檢測(cè)和計(jì)算凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)。

5免疫印跡

收集心肌細(xì)胞、裂解,提取胞漿蛋白和核蛋白。 Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣量20-30 μg,用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)NC膜。5%脫脂奶封閉后,分別加入1∶1 000小鼠抗大鼠p53單克隆抗體(Abcam)和1∶1 000兔抗大鼠Bcl-2多克隆(PharMingen)抗體, 4 ℃孵育過(guò)夜,用含0.05%Tween-Tris緩沖鹽溶液洗3次,加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗。用ECL顯色并曝光于X膠片。采用Gelwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描,以對(duì)照組的面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較和半定量分析。

6膜片鉗記錄

心肌細(xì)胞臺(tái)氏液復(fù)鈣后通過(guò)EPC-9膜片鉗放大器(HEKA)在全細(xì)胞模式下記錄ICa-L。電極經(jīng)兩步法拉制后，充以ICa-L電極內(nèi)液(mmo/L): CsCl 120, CaCl21.0, MgCl25, MgATP5,EGTA 11, Hepes 10，葡萄糖 11(CsOH調(diào) pH 7.3)。保持電位-80 mV，先給予100 ms，-40 mV的去極化脈沖滅活鈉通道和T型鈣通道，再給予300 ms、0 mV的去極化脈沖可記錄到ICa-L。給予階躍10 mV，-40～+60 mV系列去極化脈沖，可記錄不同鉗制電壓下的ICa-L。數(shù)據(jù)采集及分析處理由Pulse 和Pulsefit軟件(HEKA)完成。

7胞內(nèi)Ca2+濃度測(cè)定

新鮮分離的心肌細(xì)胞用10 mg/L Fluo-3AM和0.03% pluronic F-127(Sigma)37 ℃避光負(fù)載30 min。與Ca2+結(jié)合的Fluo-3可被488 nm的氬離子激光激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(fluorescent intensity,FI)變化可指示加入AMHCA前后細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度[Ca2+]i的相對(duì)變化。于激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV500)下連續(xù)動(dòng)態(tài)掃描。

8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1AMHCA與心肌細(xì)胞的結(jié)合

免疫印跡結(jié)果顯示，急性心肌梗死患者外周血中純化的AMHCA能識(shí)別心肌細(xì)胞200 kD的蛋白質(zhì)分子，見(jiàn)圖1A。免疫熒光結(jié)果顯示，加入AMHCA的玻片上能觀察到沿桿狀心肌細(xì)胞分布的綠色熒光，見(jiàn)圖1B。而對(duì)照組觀察不到綠色熒光和蛋白條帶。

Figure 1. AMHCA binding to cardiomyocytes.A: A1, 200 kD protein band recognized by the purified AMHCA in sera from patients with AMI;A2, 200 kD protein band didn’t recognize by AMHCA which was pre-incubated with peptide(negative control experiment);A3, 200 kD protein band didn’t recognize by PBS(control experiment).B: cardiomyocyte membrane stained by immunofluorescence(×400).

2AMHCA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡

通過(guò)TUNEL法(圖2)和Annexin V-FITC/PI雙染法(圖3)觀察AMHCA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。與1.0×1010mmol/L AMHCA孵育24 h后，觀察到TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡心肌細(xì)胞，見(jiàn)圖2B。Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)可定量測(cè)定心肌細(xì)胞凋亡比例。AnnexinV+/PI-染色的凋亡心肌細(xì)胞位于右下象限，見(jiàn)圖3B。AMHCA誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡比例顯著增加(P<0.01)。AMHCA誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡比例呈濃度依賴性。1.0×102mmol/L、 1.0×106mmol/L和1.0×1010mmol/L的AMHCA分別致心肌細(xì)胞凋亡比例為3.57%±0.13%、14.96%±4.60%和19.49%±3.27%。

3P53蛋白表達(dá)上調(diào)和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)

與對(duì)照組相比，1.0×1010mmol/L AMHCA顯著增加P53核蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2胞漿蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖4。

Figure 2. Cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL(×400).A: cardiomyocytes in the absence of AMHCA as a control; B: apoptotic cardiomyocytes in the the presence of AMHCA. The nuclei of apoptotic cardiomyocytes were stained with brown color.

Figure 3. The percentage of apoptotic cardiomyocytes assayed by Annexin-V/PI double-staining flow cytometry.A and B: the number of AnnexinV+/PI- staining cells at lower right quadrant represents the percentages of apoptotic cardiomyocytes in the absence(A) or presence(B) of 1.0×1010 mmol/L AMHCA; C: the percentages of apoptotic cardiomyocytes in the presence of AMHCA increased in a concentration-dependent manner.±sE.n=4.**P<0.01 vs control.

Figure 4. Effects of AMHCA on the expression of P53 nucleoprotein and cytoplasmic protein Bcl-2 in cardiomyocytes.A: P53 nucleoprotein expression of cardiomyocytes in the presence(1) and the absence(2) of 1.0×1010 mmol/L AMHCA; B:cytoplasmic protein Bcl-2 expression of cardiomyocytes in the presence(1) and the absence(2) of 1.0×1010 mmol/L AMHCA. ±sE. n=4.**P<0.01 vs control.

4AMHCA對(duì)ICa-L的影響

比較AMHCA對(duì)-40 mV～+60 mV測(cè)試電壓下心肌細(xì)胞ICa-L電流密度的影響。如圖5所示，1.0×1010mmol/L AMHCA不增加或減少I(mǎi)Ca-L的電流密度(n=6,P>0.05)。這提示AMHCA對(duì)細(xì)胞上L-型鈣通道沒(méi)有影響，不是通過(guò)該途徑對(duì)胞內(nèi)鈣濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

Figure 5. Effect of AMHCA on I-V relationship of ICa-L.Circle dot and triangle mark respectively represent current densities of ICa-L before and after the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA.

5AMHCA對(duì)[Ca2+]i的影響

通過(guò)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)FI，觀察AMHCA對(duì)心肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響。加入1.0×1010mmol/L AMHCA后，F(xiàn)I增加141.0%±10.56%(n=7,P<0.01)，提示AMHCA能增加心肌細(xì)胞[Ca2+]i，見(jiàn)圖6。

討 論

本研究顯示，AMHCA在急性心肌梗死的患者中不僅僅作為免疫標(biāo)志物，且還能發(fā)揮病理學(xué)效應(yīng)。AMHCA可以通過(guò)上調(diào)核蛋白P53、下調(diào)胞漿蛋白Bcl-2的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)AMHCA也可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，針對(duì)心肌肌球蛋白的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答與自身免疫性心肌病及擴(kuò)張型心肌病密切相關(guān)[10]。心肌炎時(shí)，由于病毒感染致心肌肌球蛋白暴露，從而使其成為一種自身抗原啟動(dòng)免疫應(yīng)答。細(xì)胞免疫是自身免疫性心肌病及擴(kuò)張型心肌病的一種重要的致病因素，而抗心肌肌球蛋白抗體也發(fā)揮了重要的作用。業(yè)已證明，抗心肌肌球蛋白抗體與慢性心肌炎和心肌病患者心功能的惡化相關(guān)[11]。此外，免疫吸附這些患者循環(huán)中的自身抗體可以改善擴(kuò)張型心肌病患者的心功能。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)闡明了抗心肌球蛋白自身抗體在自身免疫性心臟病和擴(kuò)張型心肌病中的作用。將抗心肌球蛋白單克隆抗體轉(zhuǎn)輸給特定品系的小鼠可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生[12]。同時(shí)也觀察到循環(huán)中抗心肌肌球蛋白自身抗體和IgG在心肌組織中沉積。抗心肌肌球蛋白單克隆抗體可以和β腎上腺素能受體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，并激動(dòng)β腎上腺素能受體致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷[13]。

Figure 6. Effect of AMHCA on fluorescent intensity.A1: fluorescent imaging before the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA; A2-A4: fluorescent imaging after the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA with a scanning interval of 10 s;B: fluorescent intensity alteration curve before and after the addition of 1.0×1010 mmol/L AMHCA.

如同心肌炎和擴(kuò)張型心肌病患者抗心肌肌球蛋白自身抗體的產(chǎn)生，急性心肌梗死的患者心肌壞死后，心肌球蛋白重鏈暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生AMHCA。由于心肌球蛋白重鏈和β1-腎上腺素能受體分子氨基酸序列具有相似性，因此AMHCA能與β1-腎上腺素能受體結(jié)合。

心肌細(xì)胞凋亡是急性心肌梗死、心室重塑的重要病理改變，是導(dǎo)致心肌細(xì)胞減少的主要原因，從而造成心肌功能和結(jié)構(gòu)的損害。而促凋亡基因p53表達(dá)和抑凋亡基因bcl-2表達(dá)的平衡則決定了細(xì)胞凋亡與否[14]。多種細(xì)胞內(nèi)由P53激活的信號(hào)途徑可以闡明依賴于P53的細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)錄因子P53調(diào)節(jié)它的靶基因通過(guò)結(jié)合DNA共有序列和激活共有序列下游基因(包括c-myc、ICE、fas和bax)啟動(dòng)因子。新生大鼠心肌細(xì)胞受缺氧干預(yù)時(shí), P53激活的p21/WAF-1/CIP-1的表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡[15]。P53的表達(dá)也有促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加的趨勢(shì)。因此p53基因及其蛋白能加速心肌細(xì)胞凋亡。與此相反,bcl-2基因及其蛋白則有可能通過(guò)抑制P53的表達(dá)而減緩心肌細(xì)胞凋亡。大量證據(jù)表明bcl-2基因及其蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣溢出和細(xì)胞內(nèi)cGMP的濃度從而實(shí)現(xiàn)它的抗凋亡作用[16]。而胞漿內(nèi)鈣離子濃度也可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，AMHCA可以增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究提示了AMHCA引起心肌細(xì)胞凋亡的一種可能機(jī)制。

總之，急性心肌梗死患者體內(nèi)的AMHCA作為一種新的觸發(fā)因素，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。該研究合理地闡明了AMHCA在急性心肌梗死后的心肌凋亡中的作用和機(jī)制。這有助于闡釋AMHCA陽(yáng)性的急性心肌梗死患者的臨床癥狀較重，也為在急性心肌梗死患者中檢測(cè)AMHCA及以AMHCA為干預(yù)的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Anti-cardiacmyosinheavychainantibodiesisolatedfrompatientswithacutemyocardialinfarctioninduceratcardiomyocyteapoptosis

SHAO Liang, LIU Kun, WANG Li, DING Yan-ping, LIAO Yu-hua, WANG Zhao-hui

(DepartmentofCardiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China.E-mail:wwwzh@public.wh.hb.cn)

AIM: To study the effect of human anti-cardiac myosin heavy chain antibodies(AMHCA) on rat cardiomyocyte apoptosis.METHODSRat cardiomyocytes were isolated by the method of enzymolysis. Apoptosis of the cardiomyocytes was observed and measured by DNA end labelling and Annexin-V/PI double-staining assay. The proteins levels of apoptosis related P53 and Bcl-2 and the second messenger calcium were measured by Western blotting, patch clamp and confocal calcium imaging, respectively.RESULTSAMHCA was able to induce cardiomyocyte apoptosis in a dose dependent manner. In the presence of AMHCA, apoptosis-accelerating nucleoprotein P53 promoted myocardial apoptosis, while apoptosis-inhibiting cytoplasmic protein Bcl-2 inhibited myocardial apoptosis. Meanwhile, the concentration of cytoplasmic calcium was elevated. No effect of AMHCA on L-type calcium currents was observed.CONCLUSIONAs a novel triggering factor, AMHCA isolated from the patients with AMI induces cardiomyocyte apoptosis.

Myocardial infarction; Cardiac myosin heavy chain; Apoptosis; Protein P53; Protein Bcl-2; Calcium

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-001

1000-4718(2011)02-0209-06

2010-08-27

2010-10-21

國(guó)家973重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃基金資助項(xiàng)目(No.2007CB512000；子課題No.2007CB512005)

△通訊作者 Tel：027-85726209；E-mail: wwwzh@public.wh.hb.cn