急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞不同死亡方式與細(xì)胞內(nèi)酶釋放的關(guān)系

薛東波 呂明 路廣海 張偉輝 潘尚哈

·論著·

急性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞不同死亡方式與細(xì)胞內(nèi)酶釋放的關(guān)系

薛東波 呂明 路廣海 張偉輝 潘尚哈

目的觀察輕重程度不同的體外急性胰腺炎(AP)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生凋亡、脹亡的狀況及細(xì)胞內(nèi)酶的釋放情況，探討兩者的關(guān)系。方法以兩步酶消化法分離胰腺腺泡細(xì)胞，分為4組。AP組加入雨蛙素0.1 μg/ml，細(xì)菌脂多糖(LPS)組加入雨蛙素及LPS(10 mg/L)，奧曲肽(OCT)組加入雨蛙素及OCT(100 ng/ml)，對(duì)照組加培養(yǎng)液。應(yīng)用丫碇橙(AO)和溴乙錠(EB)雙染色法檢測(cè)腺泡細(xì)胞的凋亡及脹亡，采用比色法檢測(cè)培養(yǎng)上清中淀粉酶及乳酸脫氫酶(LDH)含量。結(jié)果對(duì)照組、AP組、LPS組、OCT組的細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為2.2±0.4、6.4±0.6、4.6±0.4、11.2±1.2；脹亡指數(shù)分別為3.0±0.4、17.2±1.6、23.0±2.2、12.8±1.4；LDH的分泌量分別為(2180±240)、(8060±930)、(9460±920)、(6860±740)U/dl；淀粉酶的分泌量分別為(1750±190)、(3820±460)、(4420±480)、(2260±260)U/L。AP組、LPS組、OCT組的上述4項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)；LPS組的脹亡指數(shù)及LDH和淀粉酶分泌量均較AP組顯著增加(P值均<0.05)，而凋亡指數(shù)則較AP組顯著減少(P<0.05)；OCT組的凋亡指數(shù)較AP組顯著增多(P<0.05)，而脹亡指數(shù)及LDH、淀粉酶分泌均較AP組顯著減少(P值均<0.05)。結(jié)論誘導(dǎo)AP胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，并減少細(xì)胞脹亡的發(fā)生，可減少腺泡細(xì)胞內(nèi)酶的釋放。

胰腺炎； 細(xì)胞死亡； 細(xì)胞凋亡； 淀粉酶類

急性胰腺炎(AP)的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。目前認(rèn)為，炎癥性細(xì)胞因子在其中起著重要作用，而受損的胰腺腺泡細(xì)胞所釋放的細(xì)胞內(nèi)酶及炎癥介質(zhì)等是此后細(xì)胞因子級(jí)鏈反應(yīng)的觸發(fā)劑，因此，如何抑制炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)成為減輕AP病變的關(guān)鍵。已知胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)容物的釋放是影響炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素，那么，影響胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)容物釋放的因素又是什么呢？本研究以不同藥物制備輕重程度不同的AP模型，通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)觀察胰腺腺泡細(xì)胞凋亡、脹亡狀況及細(xì)胞內(nèi)酶的釋放情況。

材料與方法

一、胰腺腺泡細(xì)胞的分離及分組

取體重(200±20)g雄性Wistar大鼠(清潔級(jí)，黑龍江省藥品檢驗(yàn)所提供)的胰腺組織，剪碎至1.0 mm3大小，浸于消化液[10 mmol/L HEPES(Amresco, USA)、0.5 mg/ml膠原酶V(Sigma,USA),0.5 mg/ml BSA, 0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(Amresco, USA),Eagle′s MEM (Gibco, USA)林格液]中，37℃水浴振蕩孵育20 min，同時(shí)充以純氧。更換消化液后再次消化20 min，用250 μm不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，HEPES-林格液洗滌，200×g離心3 min，共2次。將沉淀的腺泡細(xì)胞混懸于培養(yǎng)液中(以10%FBS代替膠原酶V,余同消化液)培養(yǎng)2 h，鏡下觀察。

調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml個(gè)，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔 2 ml。AP組加入終濃度為0.1 μg/ml的雨蛙素(Sigma，USA)；細(xì)菌脂多糖(LPS)組加入終濃度為10 mg/L的LPS(Sigma，USA)及雨蛙素(0.1 μg/ml)；奧曲肽(OCT)組加入終濃度為100 ng/ml的OCT(Novartis，Swiss)及雨蛙素(0.1 μg/ml)；對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，分別收集腺泡細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。

二、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞脹亡的檢測(cè)

收集各組胰腺腺泡細(xì)胞，分別采用丫碇橙(AO，10 μg/ml，Sigma，USA)和溴乙錠(EB，10 μg/ml，Sigma，USA)染色10 min。甩片后在熒光顯微鏡(Nikon, Japan)下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)及脹亡指數(shù)。

三、培養(yǎng)上清中淀粉酶及乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)

分別離心收集各組培養(yǎng)上清液，應(yīng)用胰淀粉酶檢測(cè)試劑盒及LDH檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)淀粉酶及LDH含量，按說(shuō)明書操作。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺腺泡細(xì)胞的死亡方式

AO染色后，正常細(xì)胞胞核被綠染，形態(tài)正常；凋亡細(xì)胞胞核也被綠染，但核皺縮、濃集、分裂。EB染色后，正常及凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜拒染；脹亡細(xì)胞的胞核被染為桔紅色(圖1)。對(duì)照組、AP組、LPS組、OCT組的細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為2.2±0.4、6.4±0.6、4.6±0.4、11.2±1.2；脹亡指數(shù)分別為3.0±0.4、17.2±1.6、23.0±2.2、12.8±1.4。AP組、LPS組、OCT組細(xì)胞的凋亡指數(shù)及脹亡指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)；LPS組的脹亡細(xì)胞數(shù)較AP組顯著增多(P<0.05)，而凋亡細(xì)胞數(shù)則顯著減少(P<0.05)；OCT組的凋亡細(xì)胞數(shù)較AP組顯著增多(P<0.05)，而脹亡細(xì)胞數(shù)則顯著減少(P<0.05)。

二、離體胰腺腺泡細(xì)胞LDH及淀粉酶的分泌量

對(duì)照組、AP組、LPS組、OCT組細(xì)胞LDH的分泌量分別為(2180±240)、(8060±930)、(9460±920)、(6860±740)U/dl；淀粉酶的分泌量分別為(1750±190)、(3820±460)、(4420±480)、(2260±260)U/L。AP組細(xì)胞LDH及淀粉酶的分泌量顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)；LPS組細(xì)胞LDH及淀粉酶的分泌量又顯著高于AP組(P值均<0.05)；而OCT組細(xì)胞的LDH及淀粉酶分泌量均顯著低于AP組(P值均<0.05)。

圖1脹亡(紅箭頭)和凋亡(綠箭頭)的胰腺腺泡細(xì)胞(AO和EB雙染色 ×40)

討 論

凋亡和脹亡代表了兩種不同的細(xì)胞死亡方式[1]。自從1972年Kerr提出細(xì)胞凋亡的概念以來(lái)，學(xué)術(shù)界對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了較深入的研究。近幾年人們才開(kāi)始關(guān)注脹亡，并逐漸認(rèn)識(shí)到脹亡的意義并不亞于凋亡。細(xì)胞脹亡是細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜完整性破壞，DNA裂解為非特異性片段，最后細(xì)胞溶解并伴有炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡過(guò)程。在某些生理或病理過(guò)程中，兩種死亡方式同時(shí)存在，并在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)換。Andersson等[2]認(rèn)為，AP時(shí)細(xì)胞脹亡的發(fā)生和程度決定了AP的病變嚴(yán)重程度。腺泡細(xì)胞若以脹亡方式死亡則會(huì)釋放各種胰酶、炎癥介質(zhì),并由此引起多種炎癥細(xì)胞聚集，誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)；若以凋亡方式死亡，因?yàn)榧?xì)胞膜保持完整，不伴炎癥介質(zhì)、胰酶釋放，故炎癥反應(yīng)較輕[3]。因此，如果我們能夠誘導(dǎo)AP時(shí)的胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生凋亡，并減少脹亡，則有可能抑制超強(qiáng)炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)及其引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)及多器官功能不全綜合征(MODS)。

LPS(又稱為脂多糖)是革蘭陰性桿菌(G-)外膜的主要成分。有研究表明，腸源性內(nèi)毒素血癥可以促使急性水腫型胰腺炎向急性壞死型胰腺炎發(fā)展[4]，其可能的作用機(jī)制是內(nèi)毒素上調(diào)細(xì)胞黏附分子，促進(jìn)中性粒細(xì)胞大量聚集，并釋放許多細(xì)胞因子造成組織損傷。OCT是人工合成的生長(zhǎng)抑素八肽，被廣泛用于AP的治療[5]，其主要作用是抑制胰酶分泌，但近來(lái)人們發(fā)現(xiàn)其有誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用雨蛙肽制備體外AP模型。在此基礎(chǔ)上，再以LPS刺激制備重度AP模型，以O(shè)CT刺激制備輕度AP模型。結(jié)果顯示，以雨蛙肽刺激制備的AP模型用LPS處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)減少，脹亡細(xì)胞數(shù)增加；而用OCT處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)增加，脹亡細(xì)胞數(shù)減少。

脹亡細(xì)胞由于存在細(xì)胞膜缺陷，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可釋放到細(xì)胞外；正常及凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞膜完整，無(wú)此現(xiàn)象[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以雨蛙肽刺激制備的AP模型的腺泡細(xì)胞用LPS處理后LDH及淀粉酶釋放量增高；而用OCT處理后LDH及胰淀粉酶釋放量明顯下降，表明誘導(dǎo)凋亡、抑制脹亡后，減少了細(xì)胞內(nèi)酶的釋放。故抑制細(xì)胞脹亡、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能成為治療AP的新的思路。

[1] Cao X,Zhang Y,Zou L,et al.Persistent oxygen-glucose deprivation induces astrocytic death through two different pathways and calpain-mediated proteolysis of cytoskeletal proteins during astrocytic oncosis.Neurosci Lett,2010,479:118-122.

[2] Andersson R,Wang X.Patterns of pancreatic cell death:apoptosis versus oncosis.Pancreas,1998,17:281-288.

[3] Chen P,Huang L,Zhang Y,et al.SiRNA-mediated PIAS1 silencing promotes inflammatory response and leads to injury of cerulein-stimulated pancreatic acinar cells via regulation of the P38MAPK signaling pathway.Int J Mol Med,2010,26:619-626.

[4] Li YY,Ochs S,Gao ZR,et al.Regulation of HSP60 and the role of MK2 in a new model of severe experimental pancreatitis.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2009,297:G981-G989.

[5] Kisli E,Baser M,Aydin M,et al.The role of octreotide versus placebo in the prevention of post-ERCP pancreatitis.Hepatogastroenterology,2007,54:250-253.

[6] Zhang XP,Zhang L,He JX,et al.Experimental study of therapeutic efficacy of Baicalin in rats with severe acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2007,13:717-724.

[7] 袁耀宗,龔自華,樓愷嫻,等.生長(zhǎng)抑素及Octreotide對(duì)急性胰腺炎胰腺細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2000,12:402-404.

[8] Willems L,Zatta A,Holmgren K,et al.Age-related changes in ischemic tolerance in male and female mouse hearts.J Mol Cell Cardiol,2005,8:245-256.

2010-10-15)

(本文編輯：屠振興)

ObjectiveTo observe the apoptosis or oncosis of pancreatic acinar cells of different severity of acute pancreatitis (AP) and the release level of enzymes in vitro, and to investigate the relationship between them.MethodsTwo-step enzymatic digestion method was used to separate pancreatic acinar cells into 4 groups. 0.1 μg/ml of the caerulein was added in the AP group. Caerulein and LPS (bacterial lipopolysaccharide, 10 mg/L) were added in LPS group. Caerulein and OCT (octreotide, 100 ng/ml) were added in OCT group. Medium was added in the control group. AO (acridine orange) and EB (ethidium bromide) double staining method was used to detect the incidence of apoptosis or oncosis of acinar cell. The release of intracellular enzyme was detected by measuring the concentrations of amylase and LDH in cell culture media by colorimetry method.ResultsThe apoptosis index was 2.2±0.4, 6.4±0.6, 4.6±0.4, 11.2±1.2 in the control group, AP group, LPS group, OCT group; while the oncosis index was 3.0±0.4, 17.2±1.6, 23.0±2.2, 12.8±1.4 in the control group, AP group, LPS group, OCT group; the release of LDH was (2180±240), (8060±930), (9460±920), (6860±740)U/dl, the level of amylase was (1750±190), (3820±460), (4420±480), (2260±260)U/L. All the values in the experiment groups were significantly higher than that in control group (P<0.05). The oncosis index, LDH, amylase in LPS group was significantly higher than that in AP group (P<0.05), but the apoptosis index in LPS group was significantly lower than that in AP group (P<0.05). The apoptosis index in OCT group was significantly higher than that in AP group (P<0.05), but the oncosis index, LDH, amylase was significantly lower than that in AP group (P<0.05).ConclusionsInduction of apoptosis and reduction of oncosis in AP pancreatic acinar cells can reduce the release of enzyme in acinar cells.

Pancreatitis; Cell death; Apoptosis; Amylases

RelationshipbetweendifferentdeathwaysofpancreaticacinarcellsandreleaseofintracellularenzymesinacutepancreatitisXUEDong-bo,LüMing,LUGuang-hai,ZHANGWei-hui，PANShang-ha.DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.016

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(11531157)

150001 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科(薛東波、路廣海、張偉輝、潘尚哈)；美國(guó)加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校David Geffen醫(yī)學(xué)院外科系(呂明)