MiR-590-3p在胰腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)

宮偉強(qiáng) 秦仁義 王敏 田銳 朱峰 石程劍 張志發(fā) 李旭 洪曉泉

·論著·

MiR-590-3p在胰腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)

宮偉強(qiáng) 秦仁義 王敏 田銳 朱峰 石程劍 張志發(fā) 李旭 洪曉泉

目的應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基分離胰腺癌干細(xì)胞，檢測(cè)其miR-590-3p的表達(dá)。方法運(yùn)用無(wú)血清培養(yǎng)基克隆培養(yǎng)ASPC-1、PANC1細(xì)胞，檢測(cè)其單克隆形成、分化及細(xì)胞周期、半數(shù)抑制濃度(IC50)和表面標(biāo)記物CD24+、CD44+表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞miR-590-3p的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，(0.94±0.53)%的ASPC-1細(xì)胞和(0.57±0.12)%的PANC1細(xì)胞能存活，呈克隆球樣懸浮生長(zhǎng)，并可以在體外連續(xù)傳代。加入血清后細(xì)胞球又重新貼壁生長(zhǎng)。ASPC-1細(xì)胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24+CD44+的細(xì)胞比例及IC50分別為(75.3±5.4)%、0.96%～2.01%、27.52%～34.47%、0.35%～0.44%和(224.37±5.71)μg/ml，均顯著高于親本細(xì)胞的(43.7±3.8)%、0.38%～0.42%、17.65%～18.25%、0.05%～0.08%、(11.43±2.10)μg/ml(P值均<0.05)。PANC1細(xì)胞球G0/G1期比例和CD24+、CD44+、CD24+CD44+的細(xì)胞比例及IC50分別為(80.1±4.7)%、5.31%～9.84%、72.05%～93.06%、4.91%～5.21%、(296.58±4.27)μg/ml，均顯著高于親本細(xì)胞的(46.1±5.3)%、4.09%～4.97%、47.71%～55.66%、1.48%～2.63%、(26.17±3.81)μg/ml(P值均<0.05)。ASPC-1、PANC1細(xì)胞球miR-590-3p表達(dá)分別是親本細(xì)胞的4.67和4.52倍。結(jié)論應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基可以從ASPC-1、PANC1細(xì)胞系中分離出具有干細(xì)胞特性的胰腺癌細(xì)胞球，其miR-590-3p表達(dá)上調(diào)，該基因可能是胰腺癌干細(xì)胞特性維持的關(guān)鍵基因。

胰腺腫瘤； 腫瘤干細(xì)胞； 微RNAs； 細(xì)胞球； 無(wú)血清培養(yǎng)基

研究表明，胰腺癌干細(xì)胞是胰腺癌中的惡性核心細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)法能有效地分離到胰腺癌干細(xì)胞。microRNA是正常胚胎干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞自我更新和分化特性維持的關(guān)鍵基因。我們的前期研究表明，miR-590-3p在原代胰腺癌CD24+CD44+ESA+亞群細(xì)胞中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1和PANC1中干細(xì)胞的miR-590-3p的表達(dá)。

材料和方法

一、細(xì)胞球的培養(yǎng)分離和傳代

胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)SPC-1、PANC1由本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)保存。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×103個(gè)/ml密度重懸于無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，并添加20 μg/L EGF(PeproTech公司)、10 μg/L bFGF(PeproTech公司)、2% B27(Invitrogen公司)、1 mg/L胰島素、1×10-7mol/L地塞米松、0.4% BSA、105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素。常規(guī)培養(yǎng)3～4 d后收集形成的細(xì)胞球，機(jī)械吹打成單細(xì)胞，重懸于上述培養(yǎng)基，按1∶4的比例傳代。

二、克隆細(xì)胞的形成

取ASPC-1和PANC1單細(xì)胞懸液，按160、80、40、20、10、5個(gè)細(xì)胞梯度接種于96孔板中，每2 d添加25 μl 無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)8 d后計(jì)克隆數(shù)。每孔接種的細(xì)胞數(shù)作為自變量，以每個(gè)濃度未形成細(xì)胞球的百分比作為應(yīng)變量，按Bellows等[1]和Tropepe等[2]法求出胰腺癌干細(xì)胞在胰腺癌細(xì)胞系中的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

三、細(xì)胞球的分化誘導(dǎo)

取ASPC-1、PANC1細(xì)胞球，培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM中，觀察細(xì)胞球的生長(zhǎng)。取培養(yǎng)1、7、14 d 的細(xì)胞，三去污裂解液法提取細(xì)胞蛋白，常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CK18的表達(dá)。鼠抗人CK18抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，1∶200稀釋。最后ECL試劑盒顯影，掃描測(cè)定條帶吸光度(A)值。

四、細(xì)胞周期檢測(cè)

取培養(yǎng)7 d的胰腺癌細(xì)胞球及普通培養(yǎng)的癌細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml。加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過(guò)夜。加入RNase(終濃度50 μg/ml)及PI染液(終濃度50 μg/ml)37℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

五、細(xì)胞耐藥性檢測(cè)

取培養(yǎng)7 d的胰腺癌細(xì)胞球及普通培養(yǎng)的癌細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/200 μl。加入吉西他濱，終濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320、640、1200 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。靜止培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A450值。

六、細(xì)胞表面標(biāo)記物CD24+、CD44+檢測(cè)

取培養(yǎng)7 d的胰腺癌細(xì)胞球及普通培養(yǎng)的癌細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為106/100 μl，加入鼠抗人CD24-FITC、CD44-APC抗體，以不加抗體作為對(duì)照，冰上避光孵育30 min， PBS洗滌兩遍，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

七、MiR-590-3p表達(dá)檢測(cè)

取培養(yǎng)7 d的胰腺癌細(xì)胞球及普通培養(yǎng)的癌細(xì)胞，Triol法抽提細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-590-3p的表達(dá)。miR-590-3p引物上游：5′-ACACTCCAGCTGGGAATTTTATGTATAA-3′；下游：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為72 bp。內(nèi)參U6引物上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為65 bp。引物購(gòu)自廣州銳博生物公司。PCR反應(yīng)條件：95℃ 20 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 1 s，40個(gè)循環(huán)，采用ABI 7300軟件，應(yīng)用2-ΔΔCT方法[3]計(jì)算miR-590-3p的表達(dá)，以普通培養(yǎng)的癌細(xì)胞的表達(dá)量為1，計(jì)算細(xì)胞球的表達(dá)倍數(shù)。同時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞球的形成、傳代及分化誘導(dǎo)

ASPC-1、PANC1細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24～36 h形成少量體積較小的懸浮細(xì)胞，形態(tài)不規(guī)則，折光性較差(圖1a)，以后細(xì)胞球體積增大，形態(tài)更為致密，折光性強(qiáng)(圖1b)，14～ 20 d形成致密的形態(tài)一致的細(xì)胞球(圖1c)。細(xì)胞球細(xì)胞傳代后7～9 d仍可形成懸浮細(xì)胞球。

圖1培養(yǎng)24 h(a)、72 h(b)、7 d(c)的ASPC-1(上)及PANC1(下)細(xì)胞球形態(tài)變化(×200)

絕大多數(shù)細(xì)胞球于3 h后開(kāi)始貼壁，12 h后細(xì)胞球變扁，形狀不規(guī)則(圖2a)；24 h貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，遷移出的細(xì)胞呈放射狀分布(圖2b)；72 h細(xì)胞球形態(tài)消失，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)(圖2c)，與正常含血清培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)相似。同時(shí)，上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白CK18表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(圖3)。

圖2加入FBS誘導(dǎo)12(a)、24(b)、72 h(c)的ASPC-1細(xì)胞球(上)及PANC1(下)細(xì)胞球形態(tài)變化(×200)

二、單克隆細(xì)胞的形成

經(jīng)培養(yǎng)，ASPC-1、PANC1細(xì)胞形成一個(gè)腫瘤細(xì)胞球所需的細(xì)胞數(shù)分別為107.8±21.6、184.0±13.5，表明ASPC-1和PANC1僅有(0.94±0.53)%和(0.57±0.12)%的細(xì)胞具有克隆形成能力。

圖3 ASPC-1(a)及PANC1(b)的細(xì)胞球CK18的表達(dá)

三、細(xì)胞周期的變化

ASPC-1、PANC1細(xì)胞球的G0/G1期比例分別為(75.3±5.4)%和(80.1±4.7)%(圖4)，均顯著高于親本細(xì)胞的(43.7±3.8)%和(46.1±5.3)%(P值均<0.05)。

圖4ASPC-1(a)、PANC1(b)、ASPC-1細(xì)胞球(c)、PANC1細(xì)胞球(d)的細(xì)胞周期分布

四、癌細(xì)胞耐藥性的變化

吉西他濱干預(yù)72 h后， ASPC-1、PANC1細(xì)胞球的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(224.37±5.71)、(296.58±4.27)μg/ml，均顯著高于親本細(xì)胞的(11.43±2.10)、(26.17±3.81)μg/ml(P值均<0.05)。

五、CD24+、CD44+細(xì)胞的比例

ASPC-1細(xì)胞中CD24+、CD44+和CD24+CD44+的比例分別為0.38%～0.42%、17.65%～18.25%和0.05%～0.08%；ASPC-1細(xì)胞球中分別為0.96%～2.01%、27.52%～34.47%和0.35%～0.44%。PANC1細(xì)胞中CD24+、CD44+和CD24+CD44+比例分別為4.09%～4.97%、47.71%～55.66%和1.48%～2.63%；PANC1細(xì)胞球中分別為5.31%～9.84%、72.05%～93.06%和4.91%～5.21%(圖5)。細(xì)胞球均顯著高于親本細(xì)胞(P值均<0.05)。

圖5ASPC-1(a)、PANC1(b)、ASPC-1細(xì)胞球(c)、PANC1細(xì)胞球(d)中CD24+(上)、CD44+(中)和CD24+CD44+(下)的細(xì)胞

六、胰腺癌細(xì)胞球miR-590-3p的表達(dá)

ASPC-1、PANC1細(xì)胞球miR-590-3p表達(dá)分別是親本細(xì)胞的4.67(4.21～5.15)和4.52(4.18～5.09)倍(圖6，P值均<0.05)。

圖6 癌細(xì)胞及其細(xì)胞球中miR-590-3p的表達(dá)(RT-PCR)

腫瘤干細(xì)胞的分選有干細(xì)胞標(biāo)記物法、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法和側(cè)群細(xì)胞分選法。本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法從ASPC-1和PANC1細(xì)胞系中成功培養(yǎng)出胰腺癌細(xì)胞球，并能連續(xù)傳代。細(xì)胞球在分化過(guò)程中，導(dǎo)管上皮細(xì)胞的相關(guān)蛋白——CK18的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加；而在含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，細(xì)胞球細(xì)胞又重新貼壁生長(zhǎng)，恢復(fù)其親本細(xì)胞系形態(tài)。

吉西他濱是細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，主要?dú)鸖期的細(xì)胞，同時(shí)也阻斷細(xì)胞由G1向S期過(guò)渡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰腺癌球細(xì)胞多處于G0/G1期，吉西他濱對(duì)ASPC-1、PANC1細(xì)胞球的IC50明顯高于親本細(xì)胞的IC50，提示胰腺癌細(xì)胞球具有更高的耐藥性。

Li等[4]通過(guò)表面標(biāo)記物CD24、CD44和ESA分別從胰腺癌組織和PANC1細(xì)胞系中分選得到胰腺癌干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明，CD24+CD44+ESA+胰腺癌細(xì)胞是陰性細(xì)胞成瘤能力的100倍，且具有自我更新和分化的特性，可能是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移的核心細(xì)胞[5]。本實(shí)驗(yàn)獲取的ASPC-1、PANC1細(xì)胞球中，CD24+CD44+細(xì)胞比例明顯高于親本細(xì)胞，表明細(xì)胞球具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群。

MicroRNA是一類普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼小分子RNA，是正常胚胎干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞自我更新和分化特性維持的關(guān)鍵基因[6]。如let-7家族成員表達(dá)下降或缺失在乳腺癌干細(xì)胞的“干性”成瘤能力的維持中起至關(guān)重要的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-590-3p在ASPC-1、PANC1細(xì)胞球細(xì)胞高表達(dá)，提示我們可以利用miR-590-3p作為一種新的分選胰腺癌干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。

[1] Bellows CG, Aubin JE. Determination of numbers of osteoprogenitors present in isolated fetal rat calvaria cells in vitro. Dev Biol,1989,133:8-13.

[2] Tropepe V, Sibilia M, Ciruna BG, et al. Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol,1999,208:166-188.

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2010-08-27)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofmiR-590-3pinpancreaticcancerstemcells

GONGWei-qiang,QINRen-yi,WANGMin,TIANRui,ZHUFeng,SHICheng-jian,ZHANGZhi-fa,LIXu,HONGXiao-quan.

DepartmentofPancreatic-BiliarySurgery,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

QINRen-yi,Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

ObjectivesTo isolate cancer stem cells (CSCs) in pancreatic cancer cell lines PANC1 and ASPC-1 with serum-free medium(SFM), and to detect the expression of miR-590-3p in CSCs.MethodsPANC1 and ASPC-1 cells was cultured in serum-free medium. The monoclonal formation, differentiation and cell cycle, half inhibitory concentration (IC50), and the expression of the surface markers CD24+, CD44+were detected. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-590-3p.ResultsAfter SFM culture, (0.94±0.53)% of ASPC-1 and (0.57±0.12)% PANC1 survived, and they formed spheres, and could continuously passage in vitro. Cell spheres differentiation recurred when serum was supplemented in SFM. The G0/G1stage proportion, CD24+, CD44+, CD24+CD44+cells proportion, IC50in ASPC-1 cell were (75.3±5.4)%, 0.96%～2.01%, 27.52%～34.47%, 0.35%～0.44% and (224.37±5.71)μg/ml, which were significantly higher than that those in parent cell [(43.7±3.8)%, 0.38%～0.42%, 17.65%～18.25%, 0.05%～0.08%, (11.43±2.10)μg/ml,P<0.05]. The G0/G1stage proportion, CD24+,CD44+,CD24+CD44+cells proportion, IC50in PANC1 cell were (80.1±4.7)%,5.31%～9.84%,72.05%～93.06%,4.91%～5.21%,(296.58±4.27)μg/ml, which were significantly higher than that those in parent cell [(46.1±5.3)%, 4.09%～4.97%, 47.71%～55.66%, 1.48%～2.63%, (26.17±3.81)μg/ml,P<0.05]. The expression of miR-590-3p in ASPC-1, PANC1 spheres was 4.67 and 4.52 times higher than the expression in parent cell lines.ConclusionsPancreatic cancer cell spheres can be isolated from ASPC-1, PANC1 by culture with SFM. miR-590-3p is up-regulated and may play an important role in regulating biological characteristics of pancreatic cancer stem cells.

Pancreatic neoplasms; Tumor stem cells; MicroRNAs; Cell spheres; Serum-free medium

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.006

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30772127)

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科(宮偉強(qiáng)、秦仁義、王敏、田銳、朱峰、石程劍、張志發(fā)、李旭、洪曉泉)；濰坊市人民醫(yī)院肝膽外科(宮偉強(qiáng))

秦仁義，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn