脂酶非均相催化反應(yīng)生物傳感器的研究

齊 穎 陳曉慧 關(guān) 茵 常云鶴 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

脂酶非均相催化反應(yīng)生物傳感器的研究

齊 穎 陳曉慧 關(guān) 茵 常云鶴 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

研究固定化脂肪酶在生物傳感器上的響應(yīng)，研制了能將脂肪酶催化底物所產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移過程轉(zhuǎn)換為電流信號輸出的電化學(xué)生物傳感器，酯酶非均相反應(yīng)體系溫度為65℃，pH為7.7時驗證脂酶活性的變化規(guī)律。測定反應(yīng)體系電流強(qiáng)度的變化趨勢為首先是平穩(wěn)，反應(yīng)開始電流逐漸增大，隨著甘二酯逐漸增多，電流變化緩慢;當(dāng)甘一酯的量逐漸增多電流也變大，反應(yīng)結(jié)束電流趨于平穩(wěn)。用液相色譜儀跟蹤測定反應(yīng)過程中底物的含量，結(jié)果顯示測量相對誤差僅為4.9%。證明利用脂酶非均相催化反應(yīng)生物傳感器測定酶催化底物反應(yīng)的程度是可行的，為實現(xiàn)計算機(jī)連續(xù)在線檢測提供了理論基礎(chǔ)。

生物傳感器 脂肪酶 非均相 電流 相對誤差

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生物傳感器已經(jīng)成為生物質(zhì)技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測方法與監(jiān)控方法，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法，具有較高的選擇性和靈敏度［1］。

生物傳感器是一種特殊的器件或裝置［2］，應(yīng)用的是生物機(jī)理，與傳統(tǒng)的化學(xué)傳感器和離線分析技術(shù)相比，具有高選擇性、高靈敏度、較好的穩(wěn)定性、能在復(fù)雜體系中進(jìn)行快速在線監(jiān)測等優(yōu)點［3］。基本工作原理是:當(dāng)?shù)孜锏姆肿淤|(zhì)量發(fā)生變化時，會有相應(yīng)的陰陽離子生成，將生物敏感元件發(fā)生的特異性反應(yīng)及信號經(jīng)由物理元件——換能器，轉(zhuǎn)變?yōu)楣?、電、聲等易檢測信號，從而可將反應(yīng)程度用離散或連續(xù)的數(shù)字信號表達(dá)出來［4］，間接地獲知待測物的有關(guān)信息?，F(xiàn)在所用的生物元件包括抗原或抗體、酶或基質(zhì)、各種酶的混合體、整個細(xì)胞或部分細(xì)胞、植物或動物組織和神經(jīng)受體［5］。目前生物傳感器主要應(yīng)用于食物、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)、藥物和軍事領(lǐng)域［6］。

研究以固定化脂肪酶Novozym 435作為生物元件，以一級稻米油為反應(yīng)底物的非均相反應(yīng)，研制了能將脂肪酶催化底物所產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)換為電流輸出的電化學(xué)生物傳感器。

固定化脂肪酶生物傳感器能夠?qū)⒅久傅膶Ｒ恍?、靈敏性和電學(xué)的簡便、迅速巧妙地結(jié)合起來，可以在一個復(fù)雜的體系中，不受其他物質(zhì)干擾，快速準(zhǔn)確測出某些物質(zhì)的含量，并可監(jiān)測酶與底物反應(yīng)的程度。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

磷酸二氫鉀(分析純):天津市化學(xué)試劑三廠;磷酸氫二鈉(分析純):天津市鑫鉑特化工有限公司;氫氧化鈉(分析純):天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;鐵氰化鉀(分析純):上海江萊生物科技有限公司;去離子水:娃哈哈集團(tuán)有限公司。

ML 54電子分析天平、FE20 pH計:梅特勒－托利多儀器有限公司;DK－2000－IIIL恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;C655－μA電流表:哈爾濱三達(dá)德電力技術(shù)有限公司;YHW1104遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱:天津北華儀器廠;L535－1低速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;圓柱形石墨(底面半徑×高=0.5 cm×7 cm):中銀(寧波)電池有限公司;1100液相色譜儀:安捷倫科技有限公司;離子交換膜:凱瑞化工有限責(zé)任公司;敞口玻璃容器(長×寬×高×厚度=20 cm×10 cm×10 cm×1 cm):訂制;鉑片(長 ×寬=5 cm ×2 cm)、鉑絲:市售。

1.2 原料

Novozym 435:北京高瑞森科技有限公司;一級稻米油:黑龍江省北大荒米業(yè)有限公司。

圖1 脂肪酶催化三酰甘油水解的反應(yīng)過程

1.3 試驗方法

2、制作講課文字底稿。語言應(yīng)當(dāng)口語化、專業(yè)化，描述問題準(zhǔn)、讓授課對象聽得懂，盡量避免書面語言，并對稿件熟讀記憶。在授課中，教師講到理論性的內(nèi)容時，以及使用過于理論化的語言講授課程時，課程內(nèi)容變得枯燥，學(xué)員聽課難度加大。盡量使用口語化的表述、接地氣的表述，學(xué)員聽課的障礙就會小很多。但是，這不意味著詞語的濫用，機(jī)具的專業(yè)術(shù)語仍應(yīng)該規(guī)范地使用，體現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度。特別是PPT課件，在突出圖片、減少文字的背景下，更要注意語言的精煉。

1.3.1 磷酸緩沖溶液(PBS)的制備

分別精確稱取磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉1.36 g和1.42 g，用200.0 mL 去離子水配制成濃度為 0.1 mol/L的緩沖液，配制3組，再用氫氧化鈉將緩沖液pH調(diào)到7.7，用pH計測試;用去離子水將鐵氰化鉀配成過飽和溶液，待用。

1.3.2 測試樣品的制備

量取稻米油3 mL，再精確稱取固定化脂肪酶Novozym 4 350.09 g，待用。

1.3.3 固定化脂肪酶Novozym 435生物傳感器裝置的設(shè)計及試驗方法

脂肪酶催化三酰甘油水解的反應(yīng)過程如圖1。固定化脂肪酶生物傳感器裝置的原理框圖如圖2。

圖2 固定化脂肪酶生物傳感器原理框圖

首先不加任何測試樣品，測量裝置中的電流強(qiáng)度;然后將測試樣品稻米油3 mL和固定化脂肪酶Novozym 4 350.09 g快速混勻，置于陰極室內(nèi)進(jìn)行測試。測量溶液pH為7.7時的電流強(qiáng)度，每隔1 h記錄1次電流表示數(shù)。反應(yīng)結(jié)束后，將酶、底物和緩沖溶液的混合液放入低速離心機(jī)內(nèi)離心，離心后將酶置于恒溫干燥箱內(nèi)干燥，進(jìn)行回收再利用。

在試驗進(jìn)行到7 h和16 h的時候分別取樣20次，用液相色譜儀測定樣品中的成分，并通過液相色譜驗證試驗的準(zhǔn)確性［7］。

2 結(jié)果與分析

不加任何測試樣品時的電流強(qiáng)度為8.12 μA。酶與底物比3%，反應(yīng)溫度65℃，緩沖溶液pH 7.7，反應(yīng)時間25 h的電流輸出結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出:電流強(qiáng)度隨著時間的變化而變化，在溫度為65℃，驗證脂酶在pH為7.7時活性的反應(yīng)過程變化規(guī)律。測定反應(yīng)體系電流強(qiáng)度的變化趨勢為首先是平穩(wěn)，隨著反應(yīng)進(jìn)行，電流逐漸增大，甘二酯逐漸增多，電流變成平穩(wěn)，隨著甘一酯的增加電流再增大，然后平穩(wěn)。用液相色譜儀跟蹤測定反應(yīng)過程中底物的含量，結(jié)果顯示測量相對誤差僅為4.9%。這可能是因為固定化脂肪酶Novozym 435與底物反應(yīng)，首先是催化三酰甘油生成甘二酯，在達(dá)到平衡的時候反應(yīng)停止一段時間，然后酶繼續(xù)催化甘二酯生成甘一酯，最后達(dá)到平衡。

圖3 緩沖溶液pH為7.7時的電流強(qiáng)度

從圖4～圖6可以看出，在反應(yīng)分別為7 h和16 h的時候，經(jīng)液相色譜儀測得樣品中甘一酯和甘二酯的含量，證明7 h時，樣品中基本上只含有甘二酯，而在16 h時，樣品中基本上只含有甘一酯。經(jīng)過重復(fù)試驗20次，測得的相對誤差僅為4.9%，從而驗證了試驗的準(zhǔn)確性。

圖6 反應(yīng)16 h時測得樣品的液相色譜圖

3 結(jié)論

固定化脂肪酶Novozym 435生物傳感器裝置可以將固定化脂肪酶Novozym 435催化底物反應(yīng)所發(fā)生離子濃度變化轉(zhuǎn)換為電流強(qiáng)度進(jìn)行輸出，通過在不同pH條件下脂酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的電流不同，驗證了脂酶活性的變化規(guī)律。此裝置能夠?qū)⒐潭ɑ久窷ovozym 435的專一性、靈敏性和電學(xué)迅速、巧妙地結(jié)合起來，并可監(jiān)測酶與底物反應(yīng)的程度，判斷反應(yīng)終點，液相色譜儀測得樣品中甘一酯和甘二酯的含量，經(jīng)重復(fù)試驗20次，相對誤差僅為4.9%。

本生物傳感器裝置的設(shè)計為實現(xiàn)連續(xù)在線檢測提供了基礎(chǔ)前提，通過優(yōu)化反應(yīng)體系工藝參數(shù)并確定參數(shù)采集方法，將采集的電信號放大并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，可實現(xiàn)反應(yīng)中各關(guān)鍵控制點的動態(tài)設(shè)置和顯示、數(shù)據(jù)修改、故障診斷與自動報警，實現(xiàn)計算機(jī)在線優(yōu)化控制，評價生物傳感器可用信度。

［1］周祖新，郭曉明，王根禮，等.乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研究［J］.農(nóng)藥，2008，47(8):577 －579

［2］何星月，劉之景.生物傳感器的應(yīng)用［J］.物理學(xué)和高新技術(shù)，2003，32(4):249 －252

［3］陳儉霖.生物傳感器在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用及發(fā)展前景［J］.污染防治技術(shù)，2006，19(3):59 －62

［4］何東海.利用乙酰膽堿酯酶生物傳感器監(jiān)測海水中有機(jī)磷農(nóng)藥［D］.青島:中國海洋大學(xué)，2004

［5］胡小艷.新型酪氨酸酶生物傳感器研制［D］.無錫:江南大學(xué)，2008

［6］Roe J N.Biosensor development.Pharmaceutical Research.1992，9(7):835 －844

［7］孟祥河，章銀軍，毛忠貴.甘油酯的分析方法［J］.中國油脂，2004，29(1):44 －46.

Study on Biosensor of Heterogeneous Reaction Conjugated by Lipase

Qi Ying Chen XiaohuiGuan Yin Chang Yunhe Yu Dianyu
(School of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)

In order to study immobilized lipase responded in biosensor，it had developed an electrochemical biosensor which could transform the electron metastasis processes produced by lipase－conjugated substrate to current signal output，and the electron metastasis of the lipase in the lipase heterogeneous reaction system was verified at 65 ℃，pH 7.7.The trends in current intensity of reaction was determined as follows:it was stable firstly，then gradually increased with the reaction starting，and then changed slowly along with the increase of monoglyceride;when monoglyceride gradually increased，current also became greater，and the current became stable when reaction was to the end.Liquid chromatography was used to determine the content of the substrate of the reaction.The results showed that the relative error was only 4.9%.It proved that it was feasible to determine the extent of the reaction conjugated by enzyme with the biosensor of lipase heterogeneous conjugating reaction，so as to provide a basic premise for realizing the continuous detection on－line by a computer.

biosensor，lipase，heterogeneous，electric current，relative error

TP212.3

A

1003－0174(2011)11－0102－04

863計劃(2010AA101503)

2011－01－17

齊穎，女，1985年出生，碩士，糧食、油脂及植物蛋白工程

于殿宇，男，1964年出生，教授，大豆油脂加工技術(shù)