納濾技術(shù)用于玉米降血壓肽的脫鹽研究

杜 璟 何 慧 林閩麗 李江濤 張文君

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

納濾技術(shù)用于玉米降血壓肽的脫鹽研究

杜 璟 何 慧 林閩麗 李江濤 張文君

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，武漢 430070)

為了使經(jīng)超濾分級(jí)分離的玉米降血壓肽水解液的鹽分脫除，本研究采用納濾技術(shù)對(duì)水解液進(jìn)行了脫鹽處理，通過測(cè)定料液的肽截留率、鹽(Na+)截留率，經(jīng)綜合比較，首先確定了最佳操作壓力;并考察了3種滲濾模型的脫鹽效果。結(jié)果顯示最佳操作壓力為8 bar;3種模型一般經(jīng)過1 h處理，其肽截留率均可達(dá)96%以上，其中以連續(xù)恒容滲濾模型脫鹽效果最佳，在初始條件下(約pH8.0)，經(jīng)90 min處理后，脫鹽率可達(dá)到76.82%;之后比較了玉米肽在不同酸度條件下的脫鹽率。研究表明:在8 bar的壓力下，采用連續(xù)恒容滲濾模型，于pH 7條件下脫鹽效果最好，90 min處理后，脫鹽率可達(dá)到87.80%。

玉米降壓肽 納濾 脫鹽 滲濾模型

玉米肽一般是以玉米蛋白為原料，經(jīng)蛋白酶的催化水解、經(jīng)一系列手段分離純化和低溫冷凍干燥，最終得分子質(zhì)量在10 ku以下的寡肽混合物［1］。近年來(lái)，已有一些關(guān)于玉米肽具有良好降血壓活性的報(bào)道［2－3］，因此，建立一套適宜的分離提取技術(shù)工藝是將玉米降血壓肽推向商業(yè)化生產(chǎn)的必要條件，而分離純化的效率將直接影響到其應(yīng)用前景。

由于在玉米濃縮蛋白制備過程中，需要進(jìn)行醇沉和鹽析等步驟，加入了一定量的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液和氯化鈉溶液［4］;并且在酶解過程中，隨著肽的不斷釋放，酸度不斷提高，在本研究中為了將玉米蛋白的酶解維持在pH 8，需要不斷加入NaOH溶液，以中和過量的H+，直到水解結(jié)束。上述步驟產(chǎn)生的鹽對(duì)高血壓病人是不利的，因此，有必要對(duì)玉米蛋白水解物進(jìn)行脫鹽處理。

目前，針對(duì)食物源的短肽脫鹽技術(shù)主要包括離子交換層析法、凝膠過濾法、膜技術(shù)等［5］。納濾(Nanofiltration，NF)是以壓力差為推動(dòng)力的一種膜分離過程，由于納濾膜具有納米級(jí)的孔徑，截留分子質(zhì)量在100～1 000 u之間，并且其表面分離層由聚電解質(zhì)所構(gòu)成，所以其分離過程包括了篩分效應(yīng)和道南(Donnan)效應(yīng)兩種機(jī)理。道南效應(yīng)是電荷效應(yīng)，納濾膜帶有靜電官能團(tuán)，基于靜電相互作用，對(duì)離子有一定的截留率［6－7］。肽帶有可離子化的官能團(tuán)如羧基或氨基，偏離等電點(diǎn)時(shí)帶電荷，而鹽是帶電荷的電解質(zhì)。在納濾脫鹽過程中，當(dāng)?shù)鞍姿馕锝?jīng)過納濾膜時(shí)，由于納濾膜對(duì)蛋白水解物中的鹽和其他組分的透過是有選擇性的，即納濾膜允許低分子質(zhì)量的小肽、氨基酸和帶單電荷的鹽分透過，而其他分子質(zhì)量較大的組分則被截留。這樣，鹽分就隨著滲濾溶劑透過納濾膜而被不斷去除，從而達(dá)到對(duì)物料的除鹽目的。納濾分離過程具有無(wú)化學(xué)反應(yīng)、無(wú)需加熱、無(wú)相轉(zhuǎn)變、不會(huì)破壞生物活性等特征，因而越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥工業(yè)中的各種分離、濃縮和除鹽過程中。將超濾和納濾技術(shù)聯(lián)用對(duì)蛋白水解液進(jìn)行分離，利用超濾的篩分原理，首先用截留分子質(zhì)量較大的超濾膜，除去無(wú)生理活性的未水解的蛋白和其他大分子物質(zhì)，或通過超濾膜先對(duì)活性肽進(jìn)行分級(jí)分離;然后利用納濾膜進(jìn)行脫鹽。

在優(yōu)化超濾法制備玉米降血壓肽條件的基礎(chǔ)上［8］，進(jìn)一步采用截留分子質(zhì)量為160 u的納濾膜，考察了3種滲濾條件下對(duì)玉米蛋白酶解液的脫鹽效果，旨在確定具有最佳的脫鹽效果的模型，為今后進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)玉米降血壓肽的脫鹽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

玉米黃粉(含粗蛋白64.94%):正大集團(tuán)武漢分公司?；瘜W(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

PB－10型精密pH計(jì):賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;UV－2000紫外可見分光光度計(jì):尤尼柯(上海)儀器有限公司;LNG－NF－101納濾膜分離設(shè)備，US16/1812型納濾膜(截留分子質(zhì)量160 u):上海朗極化工科技有限公司;Model 410火焰光度計(jì):英國(guó)Sherwood科學(xué)儀器有限公司。

圖1 納濾試驗(yàn)裝置示意圖

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 濃縮玉米蛋白的制備

按文獻(xiàn)［4］的方法制備濃縮玉米蛋白，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)得其含粗蛋白83.91%。

1.3.2 玉米蛋白酶解液的制備［8］

適量濃縮玉米蛋白→按料液比1∶25(體積比)加蒸餾水→100℃預(yù)處理30 min→冷卻→調(diào)節(jié)溫度到55℃、pH8.0→按酶底比1∶100加入Alcalase堿性蛋白酶→反應(yīng)4 h，并保持溫度為55℃，pH8.0→沸水浴10 min滅酶→冷卻后抽濾→通過3 ku超濾膜→得到分子質(zhì)量＜3 ku玉米蛋白酶解液，收集備用。

1.3.3 納濾膜處理的脫鹽過程［9－11］

圖1為納濾裝置的示意圖，操作過程中利用流動(dòng)水的冷凝作用將溫度保持在20℃。首先是確定操作壓力，然后比較3種納濾滲透模型對(duì)料液中肽的截留和脫鹽效率。

1.3.3.1 模型1(M1):稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾過程

如圖2所示V0為酶解液的初始體積，取Vd=2V0或3V0，即將原酶解液稀釋至原體積的2倍或3倍，當(dāng)透過液體積濃縮為初始體積V0時(shí)為一次循環(huán)過程，第一次的濃縮階段稱為預(yù)濃縮階段。每輪濃縮前，進(jìn)行3 min的全回流操作。每一輪結(jié)束后加水使體系體積為Vd，不斷循環(huán)，直至達(dá)到脫鹽目的，過程中不時(shí)取樣測(cè)定肽和鹽(Na+)的截留率。

圖2 稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾過程

1.3.3.2 模型2(M2):濃縮 －稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾過程

如圖3所示，初始酶解液體積為V0，進(jìn)行全循環(huán)3 min后，經(jīng)納濾膜處理濃縮至Vr。Vr=1/2 V0或1/3 V0，再加水稀釋至V0，即每次加水與透過液的體積相同。與模型1相同，第一次的濃縮階段稱為預(yù)濃縮階段。每輪濃縮前，進(jìn)行3 min的全回流操作。不斷循環(huán)，直至達(dá)到脫鹽目的，過程中不時(shí)取樣測(cè)定肽和鹽(Na+)的截留率。

圖3 濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾過程

1.3.3.3 模型3(M3):連續(xù)恒容滲濾過程

在該過程中，將去離子水連續(xù)加入至體系中，其加入的體積與經(jīng)納濾膜透過液的量相等，從而使體系總體積保持不變，同樣在過程中不時(shí)取樣測(cè)定肽和鹽(Na+)的截留率。

1.3.4 肽截留率的測(cè)定

采用微量雙縮脲法測(cè)定肽濃度［12］。根據(jù)物料平衡定律，肽截留率按下式計(jì)算:

式中:C0為初始料液的肽濃度，V0為初始料液的體積，Ci和Vi分別為透過液的肽濃度和相應(yīng)的體積。

1.3.5 料液中 Na+含量的測(cè)定［13－14］

標(biāo)準(zhǔn)鈉溶液的配制:稱取已于500～600℃下灼燒至恒重的1.271 g光譜純氯化鈉于1 000 mL容量瓶中，定容、搖勻?yàn)殁c標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mL相當(dāng)于0.5 mg鈉)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:在數(shù)只50 mL的容量瓶中，分別加入 0.0、0.4、1.2、1.6、2.4、2.8、4.0、6.4、8.0 mL鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋至刻度、搖勻(溶液的鈉質(zhì)量濃度分別為 0、4、12、16、24、28、40、64、80 μg/mL)。用火焰光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。以鈉含量為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的特征譜線強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

鹽截留率按下式計(jì)算:

鹽(Na+)截留率%=C'i× V'i/C0'× V0'

式中:C0'為初始料液的Na+濃度，V0'為初始料液的體積，C'i和V'i分別為截留濃縮液的Na+濃度和相應(yīng)的體積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

文中所有測(cè)得數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳納濾溫度及壓力的確定

首先要確定操作溫度，一般來(lái)說，溫度越高，料液體系的溶解度越高，對(duì)膜污染造成的壓力越小，但是過高的溫度不但會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且設(shè)備本身也有一定的耐受溫度上限，綜合考慮本研究將操作溫度控制在20℃。

操作壓力是納濾過程最重要的運(yùn)行參數(shù)之一。圖4為不同操作壓力下，納濾膜對(duì)肽和鹽的截留率。由于納濾膜分離設(shè)備的壓力極限為14 bar，而壓力過低無(wú)法達(dá)到良好的納濾脫鹽效果，因此選擇4～12 bar作為考察范圍。從圖4可以看出，壓力在4～8 bar范圍內(nèi)，隨著操作壓力的增加，膜對(duì)肽的截留率在小幅下降后呈上升趨勢(shì)，對(duì)鹽截留率逐漸下降，脫鹽效果即已顯現(xiàn);而繼續(xù)增加壓力，則肽損失率增加，并且脫鹽能力基本不再增加。因此綜合考慮，選擇8 bar作為納濾的操作壓力。

圖4 不同壓力下的肽及鹽的截留率

2.2 間歇恒容滲濾過程預(yù)濃縮階段肽截留率及鹽截留率的變化

由前述方法可知，間歇恒容滲濾過程共采用了兩種模型，每種模型又分別通過兩個(gè)體積濃縮倍數(shù)(VCR)進(jìn)行考察(即VCR=2或3)。

圖5 不同納濾過程預(yù)濃縮階段的肽/鹽截留率

由圖5可知，在間歇滲濾過程中，無(wú)論是模型1還是模型2，僅僅經(jīng)過第一輪的預(yù)濃縮階段，其結(jié)果均不理想，因?yàn)殡慕亓袈示^低，大約在64% ～78%之間，同時(shí)鹽濃度反而有所上升，即經(jīng)過預(yù)濃縮階段鹽分反而被濃縮了。導(dǎo)致此現(xiàn)象產(chǎn)生的原因主要是在設(shè)備運(yùn)行初期納濾膜對(duì)肽的較強(qiáng)的吸附作用，導(dǎo)致截留液中肽濃度有所降低，同時(shí)料液被迅速濃縮，也使鹽分被濃縮至截留液中。因此，納濾的進(jìn)行需要加入大量的滲濾溶劑，即去離子水，對(duì)料液進(jìn)行多輪循環(huán)操作，才能達(dá)到良好的脫鹽效果。

2.3 3種納濾模型的全過程比較

2.3.1 稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾過程

圖6顯示了不同濃縮倍數(shù)的料液在稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾模型(模型1)下的肽及鹽分截留率的變化趨勢(shì)。在預(yù)濃縮階段，肽截留率大幅下降，此后隨著滲濾溶劑(去離子水)的不斷加入，肽截留率出現(xiàn)回升，經(jīng)過5輪循環(huán)，約經(jīng)過80 min，M1(VCR=2)和M1(VCR=3)出現(xiàn)重合點(diǎn)，且此后再經(jīng)過幾輪循環(huán)，肽的截留率均無(wú)大的變化，較平穩(wěn)地保持在98%左右。鹽的截留率在經(jīng)過了預(yù)濃縮階段的濃縮之后，在第一輪的循環(huán)中即出現(xiàn)大幅的下降。此后，在60 min時(shí)M1(VCR=3)的鹽截留率為(61.45±2.86)%，在經(jīng)過多輪循環(huán)后亦無(wú)太大變化。而M1(VCR=2)鹽截留率一直呈下降趨勢(shì)，即脫鹽率在不斷提高，在運(yùn)行至133.5 min時(shí)，鹽截留率為(45.5±3.79)%，即脫鹽率可以達(dá)到54.5%。

2.3.2 濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾過程

圖7顯示了不同濃縮倍數(shù)的料液在濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾模型下(模型2)肽和鹽分截留率的變化趨勢(shì)。同樣在預(yù)濃縮階段，肽截留率大幅下降，但隨著滲濾溶劑(去離子水)的加入，經(jīng)過3輪循環(huán)，約62 min，M2(VCR=2)和 M2(VCR=3)的肽截留率均可達(dá)到96.00%以上。就鹽截留率而言，M2(VCR=3)隨著循環(huán)次數(shù)的增加穩(wěn)步下降，即脫鹽率穩(wěn)步提高;而M2(VCR=2)在70 min時(shí)出現(xiàn)大幅的降低，到76 min時(shí)，脫鹽效果達(dá)到最佳，截留率為(44.00 ±3.27)%，即脫鹽率達(dá)56.00%。

圖7 模型2全過程不同時(shí)間肽及鹽截留率的變化

2.3.3 連續(xù)恒容滲濾過程

連續(xù)恒容滲濾過程是一個(gè)特殊的模型，此模型沒有經(jīng)過前期的預(yù)濃縮。同樣先經(jīng)過5 min的循環(huán)，使料液與設(shè)備和納濾膜充分接觸。之后，在開始納濾操作時(shí)，就不斷向料液中加水，始終保持加入的水的體積與透過液體積相當(dāng)。

由圖8可知，納濾初期，此模型下的肽和鹽分截留率總體趨勢(shì)和前兩個(gè)模型類似。但由于純水不斷加入，減小了大分子物質(zhì)對(duì)膜的污染，所以肽截留率可以迅速回升，并保持在較高的水平。而對(duì)鹽分的截留率在70 min后即可達(dá)到40.00%以下，在90 min時(shí)可以達(dá)到(23.18 ± 2.12)%(脫鹽率為76.82%)。在這3種模型中，其脫鹽效果是最佳的。

圖8 模型3全過程不同時(shí)間肽及鹽截留率的變化

2.4 不同pH對(duì)脫鹽效果的影響

就脫鹽效果而言，模型3即連續(xù)恒容滲濾模型最好，故選擇在此模型下比較不同pH對(duì)脫鹽效果的影響。鑒于納濾膜有一定的耐受pH范圍，所以選擇了 pH 5、6、7、8、9 這5 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行考察。在這 5 種 pH條件下，鹽分截留率變化的趨勢(shì)均是前10 min鹽分被濃縮，隨著滲濾溶劑的加入，鹽分不斷被脫除。如圖9a所示，在酸性條件下，特別是pH 5時(shí)，直到80 min脫鹽率才會(huì)達(dá)到(54.87 ±3.09)%，95 min 時(shí)達(dá)到最低，為(71.34 ±2.52)%;而 pH 6 在70 min即可到達(dá)(69.67±2.78)%，在 90 min時(shí)效果最好，為(75.48±5.02)%。但由于 pH 5和 pH 6已經(jīng)接近玉米肽的等電點(diǎn)，料液的溶解性變低，會(huì)導(dǎo)致更多的顆粒吸附在膜上，使分離效果變差。

如圖9b所示，在堿性條件下，pH 8時(shí)直到30 min脫鹽率都無(wú)明顯變化，但后期降幅很大，90 min時(shí)，脫鹽率到達(dá)(76.82±2.12)%。pH 9呈緩慢下降趨勢(shì)，但效果并不佳，到95 min時(shí)脫鹽率才達(dá)(67.64±2.98)%。由圖9b可知在中性條件下，即pH 7時(shí)的脫鹽效果最好，在20 min時(shí)，鹽分截留率就有了明顯的下降，之后更是一路降低，90 min到達(dá)最低，此時(shí)脫鹽率達(dá)(87.80±4.98)%。

3 討論

3.1 納濾面臨的問題及解決方法

納濾過程中最為常見的問題是膜的濃差極化和污染，為了減少這些問題的影響，本研究采用了滲濾(diafiltration)的方法，即將截留物用滲濾溶劑(如水)不斷稀釋而將低分子質(zhì)量溶質(zhì)逐漸沖走，并透過膜;使大分子質(zhì)量的溶質(zhì)稀釋后沖離膜表面，減少對(duì)膜的污染，從而增大膜通量，因而提高了被截組分和透過組分的分離度。滲濾可以彌補(bǔ)膜分離方法中的一些不足之處，如克服高濃度料液分離時(shí)透過通量低的缺點(diǎn)，它能使目標(biāo)分子被截留，而雜質(zhì)小分子可以順利通過濾膜［15］。

3.2 不同模型的最佳參數(shù)點(diǎn)比較

滲濾過程可分為間歇恒容與連續(xù)恒容。在本研究中又因?yàn)轭A(yù)濃縮階段的稀釋/濃縮倍數(shù)的不同，將間歇恒容分為了4種形式進(jìn)行了考察。

圖6和圖7顯示了間歇恒容滲濾過程的肽以及鹽分截留率隨時(shí)間變化的情況——整個(gè)過程中肽截留率隨時(shí)間發(fā)生往復(fù)變化。每一輪濃縮操作中，由于納濾膜的篩分效應(yīng)和道南效應(yīng)，肽截留率隨過程時(shí)間延長(zhǎng)先下降，加水稀釋后，肽截留率又上升到一個(gè)峰值，接著又開始新一輪的濃縮操作，如此不斷往復(fù)，但整個(gè)過程中肽截留率整體的變化趨勢(shì)是循環(huán)往復(fù)上升的。同樣的，鹽截留率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也出現(xiàn)了往復(fù)的變化，即在每一輪納濾濃縮操作階段，隨著滲濾溶劑(水)的加入，膜對(duì)鹽分的截留率是逐漸減小的，這是因?yàn)榻亓粢褐宣}的分子質(zhì)量小，通過篩分效應(yīng)可除去;對(duì)于160 u的納濾膜，是以篩分效應(yīng)起主要作用的，只有極少數(shù)的二肽及大部分的游離氨基酸可以透過膜，故該膜表現(xiàn)為對(duì)肽類高的截留率和對(duì)鹽分的較高的脫除率。

圖8顯示了連續(xù)恒容滲濾過程的肽和鹽分截留率的變化情況，初始階段同樣是一定程度的濃縮，在后期一直加水的過程中，肽不斷地被濃縮，鹽分也逐漸被脫除。

隨著操作的不斷進(jìn)行，納濾膜表面上的肽濃度會(huì)增加，導(dǎo)致膜面上凝膠層的形成，加水后的循環(huán)沖刷也并不能完全消除，致使凝膠層逐漸積累增厚。由試驗(yàn)可知，通常在50 min之后，肽截留率即可達(dá)到95%以上。而要達(dá)到良好的脫鹽效果，則所需較長(zhǎng)的時(shí)間。就脫鹽率而言，模型3，即連續(xù)恒容滲濾過程最佳。但是此模型需要在納濾過程中不斷加水，耗水量增加，故增加了生產(chǎn)成本。因此，要根據(jù)實(shí)際情況，即對(duì)想要達(dá)到的目的和成本進(jìn)行綜合考慮，選擇適合的納濾模型。當(dāng)選擇模型2中VCR=2時(shí)，脫鹽率雖有所降低，但節(jié)省了時(shí)間和能源，與最佳模型相比，可節(jié)省時(shí)間20%，用水量也可降低54.54%，是一種較經(jīng)濟(jì)的脫鹽方式。

3.3 pH對(duì)納濾過程的影響

圖12是在不同pH時(shí)料液的鹽分截留率的變化圖。由圖9可知，在酸性條件下濃縮液中截留的鹽分較高，脫鹽效果較差。因?yàn)榇藭r(shí)的pH接近玉米肽的等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)附近的酶解液已經(jīng)開始有少許渾濁，溶解度下降，肽聚集，易在膜面形成凝膠層，造成濃差極化甚至膜污染，這同時(shí)也阻礙了鹽分的脫除。而在堿性條件下，體系中的游離氨基在分子內(nèi)部或分子間形成氫鍵，使溶液黏度變大。pH越高，分子越易在膜面聚集，從而增大了Na+離子的透過阻力。相比較而言，pH 6的酸性條件下，納濾膜對(duì)酶解液的脫鹽性能與pH 8的堿性條件下基本相當(dāng)。只有當(dāng)酶解液在中性條件下進(jìn)行納濾脫鹽時(shí)，其脫鹽效果才是最佳的。

4 結(jié)論

納濾最佳的操作壓力為8 bar，3種工藝操作模型(稀釋－濃縮－稀釋的間歇恒容滲濾、濃縮－稀釋－濃縮的間歇恒容滲濾和連續(xù)變?nèi)轁B濾)中，以連續(xù)變?nèi)轁B濾模型脫鹽效果最佳，90 min后，肽截留率為98.49%，脫鹽率為 76.82%;在 pH 7 時(shí)，經(jīng)過 90 min，脫鹽率可達(dá)到87.80%。

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Study on Desalination of Corn Antihypertensive Peptides by Nanfiltration Technology

Du Jing He Hui Lin Minli Li Jiangtao Zhang Wenjun
(College of Food Science ＆ Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

In order to prepare antihypertensive corn peptides desalted and separated by ultrafiltration，the hydrolysate solution was treated by nanofiltration membrane.Then，the best operating pressure and diafiltration models were chosen by comparing the retention rate of peptides/salt(Na+).The results showed that the optimal operating pressure was 8 bars;the retention rates of peptides in three diafiltration models could all reach 96%after 1h.The model 3(namely continuous volume － constant diafiltration model)was the best，of which desalination rate was 67.64%after 95min.Then，the desalination effects of peptides were compared under different pH and optimal parameters.Conclusion:Under 8 bars and pH 7，the continuous volume － constant diafiltration model was the best choice for desalination and the desalination rate was 87.80%after 90min treatment.

antihypertensive corn peptides，nanofiltration，desalination，diafiltration models

Q514

A

1003－0174(2011)11－0088－06

863計(jì)劃(2008AA10Z314)

2010－12－07

杜璟，女，1985年出生，碩士，食品化學(xué)

何慧，女，1960年出生，教授，食品化學(xué)和天然產(chǎn)物化學(xué)