大孔樹(shù)脂純化枸骨葉總皂苷及其油脂抗氧化活性研究

曾超珍 劉志祥 李軍龍

(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004)

大孔樹(shù)脂純化枸骨葉總皂苷及其油脂抗氧化活性研究

曾超珍 劉志祥 李軍龍

(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004)

探討枸骨葉總皂苷分離純化的最佳工藝條件及其油脂抗氧化作用，采用6因素5水平正交設(shè)計(jì)法考察洗脫液濃度、洗脫時(shí)間、pH值等因素對(duì)純化的影響。用紫外分光光度法測(cè)定總皂苷的含量，計(jì)算吸附量、解吸率和枸骨總皂苷的含量，最后確定最佳工藝條件;通過(guò)碘量法檢測(cè)枸骨葉總皂苷抗氧化活性。結(jié)果表明，AB－8樹(shù)脂純化枸骨葉總皂苷的最佳工藝為吸附時(shí)間5 h，藥液pH值為4、洗脫液固比為10∶1、洗脫液pH值為5、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、解吸振蕩時(shí)間3 h。枸骨葉總皂苷對(duì)豬油具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系。

枸骨葉 總皂苷 大孔樹(shù)脂 分離純化 抗氧化

枸骨葉為冬青科植物枸骨(Ilex Cornuta Lindl)的葉，主產(chǎn)于河南、湖北、湖南、安徽、江蘇、浙江、江西、福建等地，具有涼血、退虛熱、強(qiáng)腰膝等功效。枸骨葉主要含冬青苷I甲酯(ilexoside I methyl ester)、冬青苷Ⅱ(ilesosideⅡ)、苦丁茶苷(comutaside)甲、乙、丙、丁等皂苷類(lèi)成分［1－3］?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抗生育、抗氧化、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、降血壓、抗菌等作用。

大孔樹(shù)脂是一類(lèi)有機(jī)高分子聚合物吸附劑，主要通過(guò)物理作用從溶液中有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的，它具有孔徑大、比表面積高、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、吸附選擇性強(qiáng)、處理量大、再生簡(jiǎn)便、價(jià)廉、溶劑易回收、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境、食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［4－9］。AB－8型大孔樹(shù)脂為聚苯乙烯型、弱極性聚合物吸附劑，研究表明其對(duì)皂苷類(lèi)物質(zhì)的分離、富集能力較好［10］。

本文主要探討AB－8型大孔樹(shù)脂分離純化枸骨葉總皂苷的最佳工藝條件，并以食用油脂過(guò)氧化值(POV)為測(cè)定指標(biāo)，研究枸骨葉總皂苷的抗氧化作用，同時(shí)通過(guò)選擇添加合適的增效劑用于增加其抗氧化活性，以期為合理利用枸骨葉資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸骨葉:采于中南林業(yè)科技大學(xué)，除去雜質(zhì)，干燥粉碎，過(guò)100目篩，備用。

AB－8型大孔吸附樹(shù)脂:南開(kāi)大學(xué)化工廠;人參皂苷Re對(duì)照品:上海醫(yī)藥化學(xué)試劑公司;豬油:市售;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722型光柵分光光度計(jì):北京中興偉業(yè)儀器有限公司;R201D－Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HS.2型電熱恒溫水浴鍋:上海精密科學(xué)儀器有限公司;B135－S型電子分析天平:梅特勒－托利多儀器有限公司;FD－1A型冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)實(shí)驗(yàn)儀器公司;FW177型中草藥粉碎機(jī):天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密稱(chēng)取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，加甲醇溶解，于10 mL容量瓶中定容，備用。分別移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mL，分別加入 5 支干燥具塞試管中，水浴揮干溶劑，各加入新鮮配制的5%香草醛—冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃恒溫水浴加熱15 min，取出，流水冷卻2 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，在554 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，人參皂苷Re(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程:Y=2.463X－0.010 8，r=0.999 7，結(jié)果表明，人參皂苷 Re在 0.03 ～0.09 mg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.3.2 樣品液的制備

稱(chēng)取枸骨葉粉20 g→80%乙醇浸提(按m∶V=1∶10)→浸提液加熱蒸發(fā)濃縮(將乙醇蒸干)→石油醚萃取→加水定容到200 mL即得皂苷供試液→冷藏備用。(石油醚萃取:取濃縮液用石油醚充分萃取，去除脂類(lèi)、色素等雜質(zhì)。)

1.3.3 總皂苷含量的測(cè)定

將提取液用80%的乙醇定容至200 mL，取樣在波長(zhǎng)554 nm，按照1.3.1方法測(cè)定其吸光度，代入回歸方程得出樣品中總皂苷的濃度。

1.4 AB－8樹(shù)脂純化工藝研究

1.4.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

95%乙醇浸泡24 h→用95%乙醇清洗樹(shù)脂至流出液與水混合(體積比為1∶5)不呈白色渾濁→用水洗至無(wú)醇味→5%HCl溶液通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2～4 h→水洗至中性→0.5 mol/L NaOH溶液通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2 ～4 h→水洗至中性，備用［11］。

1.4.2 正交試驗(yàn)

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明吸附時(shí)間、原藥液pH值、洗脫時(shí)的液固比例、洗脫液pH值、洗脫液(乙醇)體積分?jǐn)?shù)、洗脫時(shí)間等6個(gè)因素對(duì)AB－8大孔樹(shù)脂純化總皂苷的吸附解吸影響比較顯著，所以靜態(tài)試驗(yàn)主要考察以上6因素對(duì)工藝的影響，設(shè)計(jì)6因素5水平的正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

1.4.3 結(jié)果計(jì)算

按表2［L25(56)正交表］進(jìn)行試驗(yàn)，每次稱(chēng)取1 g預(yù)處理好的樹(shù)脂置于200 mL具塞錐形瓶中，精密移取備用藥液20 mL，加到錐形瓶中，于室溫水浴恒溫振蕩箱中振搖24 h進(jìn)行充分吸附，按1.3.3方法測(cè)溶液總皂苷濃度;按下述公式(1)(2)計(jì)算吸附量及解吸率。

式中:C0為母液質(zhì)量濃度/mg/mL;C1為吸附后剩余溶液質(zhì)量濃度/mg/mL;C2為解吸液質(zhì)量濃度/mg/mL;V1為所加入藥液體積/mL;V2為洗脫液體積/mL;m為樹(shù)脂質(zhì)量/g。解吸后得總皂苷量按下式計(jì)算:

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

1.5 總皂苷油脂抗氧化試驗(yàn)

為了考察不同濃度枸骨葉總皂苷以及與VC、VE、檸檬酸的協(xié)同抗油脂氧化性能，本試驗(yàn)選用豬油為材料進(jìn)行油脂抗氧化試驗(yàn)。

稱(chēng)取2～3 g油樣(稱(chēng)準(zhǔn)至0.000 2 g)于碘量瓶中(對(duì)于固態(tài)樣品應(yīng)先用索氏提取器將樣品中油脂提取出來(lái))，加30 mL三氯甲烷－冰乙酸混合液，使樣品完全溶解。加入1mL飽和碘化鉀溶液，緊密塞好瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，然后在暗處放置3min，取出加100 mL水，搖勻，立即用0.01 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至淡黃色時(shí)，加1 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。取同量三氯甲烷－冰乙酸溶液、碘化鉀溶液、水，按同一做法，做試劑空白試驗(yàn)。過(guò)氧化值計(jì)算公式:

POV值=(A－B)×N×0.126 9×100/M (4)

式中:A為樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL;B為試劑空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL;N為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度/mol/L;M為樣品質(zhì)量/g;0.126 9為1 mol/L硫代硫酸鈉1 mL相當(dāng)于碘的克數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB－8大孔樹(shù)脂純化枸骨葉總皂苷的工藝條件確定

以總皂苷量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析，見(jiàn)表2。

由正交試驗(yàn)結(jié)果表2的直觀分析可以看出，R值越大，因素的影響越顯著，A、B、C、D、E、F這6個(gè)因素的影響作用大小順序?yàn)?E＞A＞F＞D＞B ＞C。即洗脫液濃度＞吸附時(shí)間＞洗脫時(shí)間＞洗脫液pH＞原藥液pH ＞洗脫時(shí)的液固比;純化的最佳工藝組合是:A4B1C4D1E5F3，即吸附時(shí)間5 h、原藥液pH 4、洗脫時(shí)的液固比20∶1、洗脫液pH 5、洗脫液(乙醇)體積分?jǐn)?shù)為80%、洗脫時(shí)間3 h。

2.2 方差分析

將表2正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析表

以總皂苷量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行方差分析表明，因素E(洗脫液的濃度)對(duì)純化工藝影響最大，具有顯著性差異。其他因素對(duì)純化工藝的影響較小，無(wú)顯著性差異。這與正交試驗(yàn)的極差直觀分析的結(jié)果相吻合。其中因素B、C(原藥液pH、洗脫液的液固比)對(duì)工藝影響最小，從節(jié)省試劑用量的角度考慮，采用液固比為10∶1，即因素C的2水平。綜合考慮可以得出最佳工藝組A4B1C2D1E5F3。AB－8樹(shù)脂純化枸骨葉總皂苷的最佳工藝為:即吸附時(shí)間5 h、藥液pH值為4、洗脫液固比為10∶1、洗脫液pH值為5、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、解吸振蕩時(shí)間3 h。

2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由于優(yōu)選的純化工藝A4B1C2D1E5F3未包括在正交設(shè)計(jì)的25次試驗(yàn)中，故對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，按照確定的最佳工藝進(jìn)行，其他條件與正交試驗(yàn)相同，結(jié)果在最佳工藝組合的條件下，AB－8樹(shù)脂的吸附量的平均值為6.11 mg/g，解吸率的平均值為91%，每使用1 g樹(shù)脂進(jìn)行處理藥物，可得總皂苷量的平均值為 5.5 mg(n=6，RSD=0.65%)表明經(jīng)該純化工藝可使AB－8樹(shù)脂吸附量大，解吸率比較高，皂苷量較多，且工藝的穩(wěn)定性良好。

2.4 大孔樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)

由表4可以看出:試驗(yàn)確定的最佳條件下，AB－8樹(shù)脂的重復(fù)使用性能較好，重復(fù)使用5次后，對(duì)總皂苷的吸附率下降4.2%，還可以繼續(xù)使用。

表4 樹(shù)脂重復(fù)使用次數(shù)對(duì)吸附效果的影響

2.5 分離的枸骨葉總皂苷的純度考察

取枸骨葉樣品液(總皂苷含量為15.7 mg/mL)20 mL平行3份稀釋5倍，按照最佳的分離工藝，在AB－8樹(shù)脂上純化枸骨葉總皂苷，收集洗液，定容，按照1.3.3方法測(cè)定總皂苷的含量，取10 mL，水浴蒸干后于105℃干燥至恒重，測(cè)定干膏收率，計(jì)算總皂苷的純度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 總皂苷純度測(cè)定結(jié)果

從表5可以看出，經(jīng)AB－8大孔樹(shù)脂處理后的總皂苷純度可達(dá)25%以上，且具有良好的重現(xiàn)性。

2.6 枸骨葉皂苷油脂抗氧化試驗(yàn)

2.6.1 不同添加量枸骨葉皂苷對(duì)油脂過(guò)氧化值的影響

油脂暴露在空氣中易氧化形成自由基，自由基繼續(xù)與氧反應(yīng)生成自由基和過(guò)氧化物，自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)再使油脂繼續(xù)氧化?？梢詼y(cè)定油脂的POV值來(lái)評(píng)價(jià)其氧化程度。POV越高，氧化程度越高。由圖1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，POV值不斷增大，與對(duì)照相比，添加枸骨葉總皂苷的POV值增加的速度較為緩慢，其中以0.08%枸骨葉總皂苷的增加速度最慢，達(dá)12 d時(shí)POV值為30.5 mmol/kg，即對(duì)油脂抗氧化活性效果最強(qiáng)。同時(shí)抗氧化能力有劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著劑量的增大，延緩豬油的過(guò)氧化反應(yīng)，隨著枸骨葉總皂苷加入量的增大，其抑制豬油生成氫過(guò)氧化物的能力也加強(qiáng)，亦即其抗氧化效果增強(qiáng)。枸骨葉總皂苷的這種抗氧化性與其他的一些天然抗氧化提取物相同。

圖1 不同添加量枸骨葉總皂苷對(duì)油脂抗氧化作用

2.6.2 枸骨葉總皂苷與其他物質(zhì)的協(xié)同抗氧化作用

由于復(fù)合抗氧化劑在發(fā)揮抗氧化作用時(shí)，各組分間可能發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，可表現(xiàn)協(xié)同增效的作用。從圖2可知，檸檬酸、抗壞血酸、VE對(duì)枸骨葉總皂苷的抗氧化作用均有協(xié)同增效作用，并且抗壞血酸的增效作用最強(qiáng)。協(xié)同增效的強(qiáng)弱順序?yàn)?VC＞VE＞檸檬酸。同時(shí)，從試驗(yàn)中還可以看出，其抗氧化能力強(qiáng)于單獨(dú)使用時(shí)的枸骨葉總皂苷。

圖2 枸骨葉總皂苷與檸檬酸、VC、VE混合使用抗氧化性能的比較

3 結(jié)論

大孔樹(shù)脂純化原理為吸附作用和分子篩作用，吸附的產(chǎn)生是由于范德華力或氫鍵，分子篩作用是由于其多孔結(jié)構(gòu)，故吸附力較弱，有機(jī)溶劑容易洗脫;大孔吸附樹(shù)脂具有工藝操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高，樹(shù)脂可再生等優(yōu)點(diǎn)。AB－8型樹(shù)脂對(duì)枸骨葉總皂苷有較好的吸附和洗脫效果，用其純化枸骨葉皂苷是可行的;AB－8樹(shù)脂純化枸骨葉總皂苷的最佳工藝為:吸附時(shí)間5 h、藥液 pH值為4、洗脫液固比為10∶1、洗脫液 pH值為5、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、解吸振蕩時(shí)間3 h。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)AB－8樹(shù)脂處理純化的枸骨葉總皂苷純度達(dá)25%以上，并且該樹(shù)脂的重復(fù)使用性能較好。

枸骨葉總皂苷對(duì)油脂抗氧化試驗(yàn)表明，它對(duì)豬油有較強(qiáng)的抗氧化效果，總皂苷與豬油的抗氧化能力有劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著劑量的增大，延緩豬油的過(guò)氧化反應(yīng)，其抑制豬油生成氫過(guò)氧化物也加強(qiáng)，即其抗氧化效果增強(qiáng)。VC、VE、檸檬酸對(duì)枸骨葉總皂苷油脂抗氧化均具有協(xié)同增效作用。

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Research on Purification Technology of Saponins from Folium Ilicis Cornutae by Macroporous Resin and Its Antioxidative Activity on Oil

Zeng Chaozhen Liu Zhixiang Li Junlong
(College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004)

In this paper，the optimal formula and conditions on separation and purification of saponins from Folium Ilicis Cornutae by macroporous resin and its antioxidative activity on oil were studied.An orthogonal experiment of 6 factors and 5 levels was used to study the effects on separation and purification including eluent concentration，elution time，pH value，etc.The content of saponins in Folium Ilicis Cornutae was determined by ultraviolet spectrophotometry.Then，the adsorption capacity，the rate of desorption and the concentration of saponins were calculated to determine the suitable conditions.Antioxidation activity of saponins from Folium Ilicis Cornutae was studied by the iodine method.The results showed that the optimized separation and purification technology of saponins from Folium Ilicis Cornutae by AB －8 was as follows:time of 5 h，solution pH value of 4，eluent－solid ratio of 10∶1，eluent pH value of 5，the concentration of 80%ethanol eluent，and desorption oscillation time of 3 h.So，saponins have strong antioxidation activity to lard and its activity is in proportion to saponins in dose.

Folium Ilicis Cornutae，saponins，macroporous resin，separation and purification，antioxidation

TS221

A

1003－0174(2011)08－0045－05

中南林業(yè)科技大學(xué)青年科學(xué)研究基金(06007B)

2010－10－19

曾超珍，女，1978年出生，講師，藥用植物資源與利用