菜籽多糖WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

朱建飛 唐春紅 吳謀成

(重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院1，重慶 400067)

(重慶工商大學(xué)綠色食品研究所2，重慶 400067)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院3，武漢 430070)

菜籽多糖WPS－1對(duì)小鼠腹腔
巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

朱建飛1，2唐春紅1，2吳謀成3

(重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院1，重慶 400067)

(重慶工商大學(xué)綠色食品研究所2，重慶 400067)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院3，武漢 430070)

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性，菜籽多糖WPS－1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，并表現(xiàn)出明顯的劑量－效果關(guān)系，WPS－1促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的最佳質(zhì)量濃度為40 μg/mL。采用半定量RT－PCR進(jìn)一步研究不同作用時(shí)間下40 μg/mL WPS－1對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞IL－6、腫瘤壞死因子α(TNF－α)這兩種細(xì)胞因子以及誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)的影響。WPS－1促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞IL－6、TNF－α和iNOS mRNA表達(dá)的最佳時(shí)間為24 h。菜籽多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。

菜籽多糖 巨噬細(xì)胞 免疫作用

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫體系中重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。激活的巨噬細(xì)胞是宿主抵抗腫瘤的重要因素，在其中，激活的巨噬細(xì)胞分泌IL－1、IL－6、IL－12、TNF－α等細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子直接參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用［1－3］。激活的巨噬細(xì)胞增加iNOS的表達(dá)，iNOS催化產(chǎn)生大量的NO，NO是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤的中心分子［4］。近年來(lái)，大量藥理及臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫受體、提高機(jī)體的免疫功能［5］。激活巨噬細(xì)胞是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要途徑之一［6］。通過(guò)研究WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的影響，檢測(cè)WPS－1對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的作用，并采用RT－PCR法檢測(cè)了對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL－6和TNF－α的影響，同時(shí)檢測(cè)WPS－1在mRNA水平對(duì)iNOS的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“雙低”品種華雜4號(hào)菜籽冷榨粕:湖北華益油料科技公司;巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、脂多糖(LPS)、刀豆球蛋白A(ConA):美國(guó)Sigma－Aldrich公司;RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)基:美國(guó)Gibco公司;二乙基焦磷酰胺(DEPC)、RNA酶抑制劑(RNasin)、Taq DNA聚合酶:加拿大BBI公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料公司提供;Trizol試劑:美國(guó)Invitrogen公司;M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶:美國(guó)MBI公司;Oligo(dT)15、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、引物合成:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司;BALB/c雄性小鼠:SPF級(jí)，體重(20±2)g，湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

SL2300型二氧化碳培養(yǎng)箱:美國(guó)Sheldon公司;24孔細(xì)胞培養(yǎng)板:美國(guó)Corning公司;0.22 μm 微孔濾膜:上海半島公司凈化器材廠;DFC300FX型倒置熒光顯微鏡:德國(guó)Leica公司;UV－9100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京瑞利分析儀器公司;PTC－100型PCR儀:美國(guó)MJ公司;JS－300型圖像分析系統(tǒng):上海培清科技公司;ELX 800型全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀:美國(guó)Bio－Tek公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽多糖提取及純化工藝路線

脫脂菜籽粕，用熱水按最佳工藝流程提?。?］。得到的水溶性多糖提取液用篩選出的特1號(hào)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行初步純化［8］，以去除溶液中的游離蛋白及酚類等色素物質(zhì)。流出液經(jīng)真空濃縮，再通過(guò)分步醇沉以及DE－52纖維素離子交換柱層析工藝［9］，得到菜籽多糖WPS－1，純度89.3%。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞的分離

手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗等手術(shù)器械等需經(jīng)消毒處理;分離巨噬細(xì)胞的方法如下［10］:(1)以頸椎脫臼法處死小鼠，用70%乙醇浸濕小鼠全身。將其仰臥放置，四肢展開(kāi)釘在木板上;(2)在腹股溝區(qū)做一橫切口，撕裂皮膚以完全暴露腹腔，用70%乙醇沖洗腹壁;(3)用注射器先抽1 mL消毒的空氣和4 mL預(yù)冷至4℃的培養(yǎng)液，用鑷子提起腹壁，從腹部左側(cè)向腹腔中注射;(4)叩打腹壁2 min，使培養(yǎng)液散布于整個(gè)腹腔，并促使巨噬細(xì)胞從腹腔的漿膜表面釋放，形成細(xì)胞懸液;(5)另取一支注射器，從腹部右側(cè)進(jìn)針，抽出懸液，移入預(yù)冷的容器中;(6)計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.3 巨噬細(xì)胞的純化

根據(jù)巨噬細(xì)胞黏附能力強(qiáng)、貼壁快的特點(diǎn)，采用差速黏附法純化巨噬細(xì)胞［10］。將密度為 2×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h。輕搖培養(yǎng)瓶，傾棄瓶中液體。再用Hanks液清洗2次，除去未貼壁的細(xì)胞。加入培養(yǎng)液，鏡鑒。瓶中已貼壁的細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞，純度可達(dá)95%。少量混雜的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換液，除去已變性死亡的中性粒細(xì)胞，得到接近純凈的巨噬細(xì)胞。

1.2.4 巨噬細(xì)胞的接種和培養(yǎng)［10］

將純化巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)瓶快速冷凍至2℃，待細(xì)胞收縮后猛搖或吹打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來(lái)。制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。以2×105～4×105個(gè)/cm2的密度接種細(xì)胞。加入適量培養(yǎng)液RPMI1640(20%的胎牛血清)在37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中靜息培養(yǎng)2 h后用于試驗(yàn)。

1.2.5 細(xì)胞成活率的檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞成活率［11］，取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入密度為2×105～4×105個(gè)/cm2的細(xì)胞，加入不同質(zhì)量濃度的WPS－1的培養(yǎng)液，使WPS －1 的最終質(zhì)量濃度分別為 1、3、10、30、100 μg/mL，每孔最終體積為500 μL。設(shè)空白對(duì)照孔(不加任何藥物，只有細(xì)胞和培養(yǎng)液)。每一質(zhì)量濃度6個(gè)重復(fù)孔。置于37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)預(yù)訂時(shí)間。棄去培養(yǎng)液上清液，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，每孔加 500 μL 0.5 mg/mL MTT 染液，在37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。每孔加入 500 μL 含10%SDS(用 10 mmol/L 鹽酸配制)的溶液，在37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，讓結(jié)晶物完全溶解，測(cè)定570 nm處的OD值。

1.2.6 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響

取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入密度為2×105～4×105個(gè)/cm2的細(xì)胞。根據(jù)前期考察WPS－1質(zhì)量濃度對(duì)脾淋巴細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響，WPS－1質(zhì)量濃度為40 μg/mL時(shí)，各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)接近完全，再增加樣品質(zhì)量濃度，mRNA表達(dá)量基本保持不變。因此本文將WPS－1質(zhì)量濃度固定為40 μg/mL，每孔最終體積為 500 μL，同時(shí)以5 μg/mL的LPSConA作為陽(yáng)性對(duì)照。設(shè)空白對(duì)照孔(不加任何藥物，只有細(xì)胞和培養(yǎng)液)。每一質(zhì)量濃度6個(gè)重復(fù)孔。置于37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)預(yù)訂時(shí)間。吸去上清培養(yǎng)液，每孔加入1 mL Trizol試劑，按照Invitrogen公司Trizol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總的RNA，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體操作略。

試驗(yàn)所用細(xì)胞因子引物參照文獻(xiàn)［12－14］，具體如下:

1.2.7 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS的mRNA表達(dá)水平的影響檢測(cè)

應(yīng)用RT－PCR檢測(cè)的mRNA表達(dá)水平，方法同1.2.6。

IL－6引物的擴(kuò)增條件為:95℃保溫2 min，然后3步循環(huán):95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，樣品在4℃中結(jié)束反應(yīng);TNF－α、iNOS引物的擴(kuò)增條件為:95℃保溫2 min，然后3步循環(huán):95℃變性20 s，61 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共進(jìn)行 36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min，樣品在4℃中結(jié)束反應(yīng)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 8.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以X±SD表示，以t檢驗(yàn)法進(jìn)行組間顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞成活率的影響

圖1為不同質(zhì)量濃度WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，同空白對(duì)照組比，WPS－1為1 μg/mL時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響(P ＞0.05)，5 μg/mL時(shí)有顯著影響(P ＜0.05)，10～160 μg/mL 范圍內(nèi)有極顯著影響(P＜0.01)。WPS－1促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出明顯的劑量－效果關(guān)系，巨噬細(xì)胞的活性隨著WPS－1質(zhì)量濃度的增加而增加，但到達(dá)40 μg/mL后，巨噬細(xì)胞的增殖活性趨于穩(wěn)定。這說(shuō)明WPS－1作為免疫調(diào)節(jié)劑的最佳劑量為40 μg/mL。作為陽(yáng)性對(duì)照的LPS和ConA，在5 μg/mL劑量下極顯著地促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，且比WPS－1最高質(zhì)量濃度組(160 μg/mL)對(duì)小鼠總脾淋巴細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用大。這說(shuō)明WPS－1刺激小鼠總脾淋巴細(xì)胞發(fā)生有絲分裂的能力低于LPS和ConA這兩種常用的致有絲分裂原。

圖1 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞增殖的影響

2.2 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響

由圖2可得，與空白對(duì)照相比，WPS－1與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為3、6、12 h時(shí)，IL－6 mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著增加(P＞0.05)，24 h時(shí)mRNA表達(dá)量有極顯著增加(P＜0.01)，且此時(shí)mRNA增加量達(dá)到最大，但到48 h時(shí)mRNA表達(dá)量又下降到初始水平，未有顯著增加(P＞0.05)。可以得出，WPS－1對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞IL－6 mRNA的表達(dá)未表現(xiàn)出時(shí)效關(guān)系，僅在12～24 h時(shí)間范圍mRNA表達(dá)量突然增加。

圖2 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL－6 mRNA表達(dá)的影響

由圖3可知，與空白對(duì)照相比，WPS－1與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為3、6 h時(shí)，TNF－α mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著增加(P＞0.05)，培養(yǎng)12 h時(shí)mRNA表達(dá)量有顯著增加(P＜0.05)，24 h時(shí)mRNA表達(dá)量有極顯著增加(P＜0.01)，且此時(shí)增加量達(dá)到極大值，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到48 h時(shí)，mRNA表達(dá)量迅速減少，但仍表現(xiàn)為極顯著增加(P＜0.01)?？梢缘贸觯琖PS－1可促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞TNF－α mRNA的表達(dá)，有一定的時(shí)效關(guān)系，給藥24 h時(shí)表達(dá)量最高。

圖3 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF－α mRNA表達(dá)的影響

2.3 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS的mRNA表達(dá)水平的影響

由圖4可見(jiàn)，與空白對(duì)照相比，WPS－1與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為3、6、12 h時(shí)，iNOS mRNA表達(dá)量都沒(méi)有顯著增加(P＞0.05)，僅培養(yǎng)24 h時(shí)mRNA表達(dá)量表現(xiàn)出極顯著增加(P＜0.01)，且此時(shí)增加量達(dá)到極大值，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到48 h時(shí)，mRNA表達(dá)量又回到初始水平，沒(méi)有顯著增加(P＞0.05)。可以得出，WPS－1可促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的沒(méi)有表現(xiàn)出時(shí)效關(guān)系，但給藥24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值。

圖4 WPS－1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 WPS－1可促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，最佳劑量為 40 μg/mL。

3.2 本文研究的兩種細(xì)胞因子TNF－α和IL－6能直接參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。TNF－α的抗腫瘤作用機(jī)理包括TNF－α的直接作用和誘導(dǎo)的針對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答。用40 μg/mL的WPS－1和巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)48 h，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)IL－6和TNF－α的mRNA表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在共同培養(yǎng)12 h時(shí)，巨噬細(xì)胞的TNF－α的mRNA表達(dá)水平開(kāi)始有所增加，因?yàn)門NF－α有自分泌效應(yīng)，即分泌的TNF－α可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF－α，所以當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)到24 h，TNF－α的表達(dá)進(jìn)一步明顯增加，但是在48 h后，TNF－α的mRNA表達(dá)水平下降。IL－6 mRNA表達(dá)水平的增加時(shí)間出現(xiàn)較晚，應(yīng)該不是WPS－1直接的對(duì) IL－6的增加作用，可能是 TNF－α對(duì)其產(chǎn)生影響，因?yàn)門NF－α能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL－6。但是同時(shí)產(chǎn)生的IL－6反過(guò)來(lái)又會(huì)抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF－α。檢測(cè)WPS－1處理的巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOS的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在共同培養(yǎng)24 h后，iNOS的mRNA表達(dá)才增加，由此可見(jiàn)iNOS的mRNA的增加并非WPS－1的直接誘導(dǎo)作用。促使iNOS的mRNA表達(dá)增加可能的原因是，由于WPS－1可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF－α，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF－α又反過(guò)來(lái)促進(jìn)巨噬細(xì)胞iNOS基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生NO。

3.3 WPS－1可提高小鼠巨噬細(xì)胞的活性，從而增加IL－6和TNF－α這兩種細(xì)胞因子以及iNOS的分泌量。

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Immunomodulating Effects of Rapeseed Polysaccharide WPS－1 on Mouse Peritoneal Macrophage

Zhu Jianfei1，2Tang Chunhong1，2Wu Moucheng3
(College of Environmental and Biological Engineering，Chongqing Technology and Business University1，Chongqing 400067)
(Natural and Health Food Research Institute，Chongqing Technology and Business University2，Chongqing 400067)
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University3，Wuhan 430070)

The MTT assay was adopted to measure cell activation.Rapeseed polysaccharide WPS －1 promoted proliferation macrophage cells in a dose－ dependent manner.The optimal concentration of WPS －1 to promote proliferation was 40 μg/mL.Semi－ quantitative RT － PCR was performed to determine changes in cytokine mRNA expression.The influence of WPS－1 to IL －6，tumor necrosis factor－ α (TNF － α)，and inducible nitric oxide synthase(iNOS)mRNA expression were all 40 μg/mL.The best time of WPS －1 to promote IL －6，TNF － α，iNOS mRNA of expression were all 24 h.The results indicated that rapeseed polysaccharide could enhance the immune regulation of peritoneal macrophages.

rapeseed polysaccharide，macrophage，immunomodulating effects

TS229

A

1003－0174(2011)08－0041－05

“十五”國(guó)家重大科技專項(xiàng)(200lBA501 A20)，“十一五”湖北省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006AA 20lB32)

2010－10－25

朱建飛，男，1979年出生，講師，博士，食品科學(xué)與工程