融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其靶向結(jié)合乳腺癌細(xì)胞的功能分析*

高國(guó)輝， 王金丹， 黃奇迪， 楊紀(jì)峰， 楊水兵， 包兵兵， 張 羽， 胡孝渠△

(溫州醫(yī)學(xué)院1生命科學(xué)院,2附屬第一醫(yī)院腫瘤外科,3仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325000)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及其靶向結(jié)合乳腺癌細(xì)胞的功能分析*

高國(guó)輝1， 王金丹1， 黃奇迪2， 楊紀(jì)峰1， 楊水兵1， 包兵兵3， 張 羽3， 胡孝渠2△

(溫州醫(yī)學(xué)院1生命科學(xué)院,2附屬第一醫(yī)院腫瘤外科,3仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325000)

目的： 利用昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)的單鏈抗體可變區(qū)片段(ScFv)，分析其靶向結(jié)合乳腺癌細(xì)胞表面受體HER2的功能。方法構(gòu)建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP，重組獲得真核表達(dá)載體重組子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,轉(zhuǎn)化DH10Bac，收集重組病毒bacmid,分別轉(zhuǎn)染、感染粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4，SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物。Ni2+-NTA 親和層析法純化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分別滴入乳腺癌細(xì)胞HER2陽(yáng)性的SKBR3和HER2陰性的MCF7，對(duì)比攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體靶向結(jié)合乳腺癌細(xì)胞表面HER2受體情況。結(jié)果獲得長(zhǎng)度約1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP，感染重組病毒的Tn-5B1-4細(xì)胞膜附近有明顯綠色熒光，SDS-PAGE、Western blotting法檢測(cè)到60 kD的特異性條帶。 結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示HER2陽(yáng)性的SKBR3細(xì)胞表面有明顯綠色熒光，而HER2陰性的MCF7細(xì)胞表面熒光易被洗脫。結(jié)論在Tn-5B1-4中成功表達(dá)攜帶綠色熒光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP，該攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體具有靶向結(jié)合乳腺癌細(xì)胞表面HER2受體的效能。

抗HER2單鏈抗體可變區(qū)片段； 綠色熒光蛋白； 融合基因表達(dá)

研究表明，人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)基因在多種腫瘤組織表達(dá)[1-3]。 HER2表達(dá)量越高，腫瘤的惡性程度越高，患者預(yù)后也越差[4,5]。因此，以HER2為靶標(biāo)的生物靶向治療是抗腫瘤治療的新思路。

抗HER2單鏈抗體可變區(qū)片段(anti-HER2 single-chain variable fragment，anti-HER2-ScFv)是抗HER2免疫球蛋白Fab片段中的可變區(qū)部分，由一段重鏈和一段輕鏈組成，具有靶向結(jié)合HER2的特異性。如果其攜帶藥物分子靶向結(jié)合HER2，將會(huì)阻斷表皮生長(zhǎng)因子對(duì)HER2 受體的激活，同時(shí)藥物定點(diǎn)殺傷靶細(xì)胞，從而導(dǎo)致HER2 受體無(wú)法磷酸化而使HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞停止增殖[6]。在大量的臨床分子診斷或生物靶向治療研究中[7,8]，驗(yàn)證抗HER2單鏈抗體與HER2靶向結(jié)合時(shí)，一般使用間接免疫技術(shù)或者染色技術(shù)。由于這兩種技術(shù)使用過(guò)程中影響因素多，在多種臨床分子診斷和靶向生物治療等實(shí)驗(yàn)結(jié)果中容易產(chǎn)生誤差。因此，研究一種同時(shí)具有靶向性和明顯報(bào)告作用的抗HER2單鏈抗體應(yīng)用于臨床分子診斷和抗腫瘤靶向治療十分必要。

本研究利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)能在活細(xì)胞中直接觀察的特點(diǎn)，構(gòu)建anti-HER2-ScFv-GFP融合基因，用昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗HER2 ScFv-GFP融合蛋白，分離純化含有綠色熒光的抗HER2單鏈抗體后，以HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞SKBR3和HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7為模型，將其與SKBR3、MCF7結(jié)合，觀察靶向結(jié)合效率，以探討融合了綠色熒光蛋白的抗HER2單鏈抗體是否會(huì)改變靶向結(jié)合HER2受體的功能。實(shí)驗(yàn)成功后，使原來(lái)不可見(jiàn)的抗HER2單鏈抗體封閉乳腺癌細(xì)胞表面HER2受體現(xiàn)象變得直觀便捷，為進(jìn)一步的臨床分子診斷和生物靶向治療等提供動(dòng)態(tài)變化的證據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1基因片段、載體、菌株與細(xì)胞株 鼠源性人抗HER2-ScFv片段由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院宋爾衛(wèi)教授課題組提供、GFP片段由浙江大學(xué)生命科學(xué)院吳敏教授惠贈(zèng)、pFAST Bac-to-Bac HT A表達(dá)載體、大腸桿菌TG1、DH10Bac、粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4(Tn)為浙江大學(xué)昆蟲(chóng)病毒分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。 pGEM T easy vector購(gòu)于Promega，乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MCF7為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑 T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、中分子量蛋白marker、PVDF膜購(gòu)于Promega，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、HindIII、BamHI及其配套bueffr、dNTPs、DNA marker DL2000、DNA marker 4500均購(gòu)自TaKaRa; 鼠抗His-Tag mAb、goat anti-mouse IgG-HRP、DAB為Abmary產(chǎn)品，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco-BRL，昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基NTM-FH insect medium為Sigma產(chǎn)品。 DNA Gel Purficatoin Kit 3.1為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于Omega。

1.3PCR引物 根據(jù)anti-HER2-ScFv片段序列設(shè)計(jì)引物如下：上游引物5’-ccg gaattc atggcccag gtgcag-3’,引入酶切位點(diǎn)EcoR I,下游引物5’-ccat ggatcc atggtggtgg tgat-3’,引入酶切位點(diǎn)BamH I,其中抗HER2-ScFv片段的終止密碼子TAA被刪除掉。

根據(jù)GFP片段序列設(shè)計(jì)引物如下：上游引物5’-aac ggatcc atggtgagca agggcg-3’,其中引入酶切位點(diǎn)BamH I,下游引物5’-ccg aagctt ttacttgtacagc tcgtc-3’,其中引入酶切位點(diǎn)HindIII,M13通用引物如下:上游引物5’-gtttt cccag tcacga c-3’,下游引物5’-cagga aacag ctatg ac-3’,用于檢測(cè)轉(zhuǎn)座的發(fā)生和插入外源基因片段的大小。以上3對(duì)引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

2方法

2.1融合基因anti-HER2-ScFv-GFP的獲得 PCR法分別獲得目的基因anti-HER2-ScFv和GFP。利用引物設(shè)計(jì)中的兩端對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)EcoR I、BamH I雙酶切基因片段anti-HER2-ScFv，產(chǎn)生同時(shí)具有EcoRI、BamH I黏性末端的片段，膠回收之；利用引物設(shè)計(jì)中的兩端對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)HindIII、BamH I雙酶切基因片段GFP，產(chǎn)生同時(shí)具有HindIII、BamH I黏性末端的片段，膠回收之，將兩條同時(shí)具有BamH I黏性末端膠回收片段產(chǎn)物利用T4 DNA連接酶16 ℃直接連接BamH I黏性末端。以該連接產(chǎn)物為模板，以片段anti-HER2-ScFv的上游引物為融合基因的上游引物，以片段GFP的下游引物為融合基因的下游引物，PCR擴(kuò)增獲得融合基因，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定之。將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM T easy vector，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選，構(gòu)建供體重組質(zhì)粒pGEM T easy vector/anti-HER2-ScFv-GFP，PCR法和EcoR I、HindIII雙酶切鑒定，并測(cè)序鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒中融合基因序列，BLAST比對(duì)序列的正確性。

2.2真核表達(dá)載體重組子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建 用EcoR I、HindIII分別雙酶切供體質(zhì)粒pGEM T easy vector/anti-HER2-ScFv-GFP和真核表達(dá)載體pFAST Bac-to-Bac HT A;用T4 DNA連接酶將anti-HER2-ScFv-GFP與具有相同黏性末端的表達(dá)載體pFAST Bac-to-Bac HT A在4 ℃連接反應(yīng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選，雙酶切鑒定重組子，并對(duì)重組子測(cè)序確認(rèn)閱讀框的正確性。

2.3重組bacmid的獲得 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP轉(zhuǎn)化含有輔助質(zhì)粒的DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)8 h后，轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)座酶的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)座，并使DH10Bac獲得慶大霉素抗性，通過(guò)涂布含IPTG、X-gal、卡那霉素、慶大霉素及四環(huán)素的LB平板上篩選白色菌落，挑入含有3種同樣抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，堿法小量提取重組病毒DNA，用M13上、下游通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定融合基因anti-HER2-ScFv-GFP轉(zhuǎn)座是否成功。

2.4昆蟲(chóng)細(xì)胞Tn-5B1-4的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及重組病毒的感染 取鑒定好的重組bacmid基因組DNA，用Lipofectin轉(zhuǎn)染細(xì)胞。詳細(xì)步驟如下:(1)先在35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種2×105Tn-5B1-4細(xì)胞，加入2 mL有血清培養(yǎng)基，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分散，27 ℃培養(yǎng)24 h。(2)取2支1.5 mL Eppendorf管配制下列溶液:溶液A:約1-2 μg重組桿狀病毒DNA溶于100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中；溶液B：5 μL Lipofectin稀釋于80 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中;合并溶液A和溶液B輕輕混勻，室溫靜置15 min。(3)棄細(xì)胞培養(yǎng)液，并用無(wú)血清培養(yǎng)基洗3次，加0.8 mL無(wú)血清培養(yǎng)基至Lipofectin-DNA混合物中，輕輕混勻后，小心滴加到細(xì)胞表面，輕輕混勻。(4)27 ℃培養(yǎng)8 h后，棄轉(zhuǎn)染液，加有血清培養(yǎng)基2 mL繼續(xù)培養(yǎng)。(5)感染5 d后收集有明顯病毒感染癥狀的細(xì)胞上清，再感染Tn-5BI-4細(xì)胞3輪進(jìn)行病毒擴(kuò)增。熒光顯微鏡下觀察被感染的粉紋夜蛾細(xì)胞Tn-5B1-4(Tn)的變化。

2.5SDS-PAGE與Western blotting分析 取重組病毒感染5 d后的Tn-5B1-4細(xì)胞和陰性對(duì)照經(jīng)bacmid感染的Tn-5B1-4細(xì)胞，超聲破碎，經(jīng)3 000 r/min離心2 min，棄上清，1×PBS緩沖液洗滌3次。每1.5 mL感染細(xì)胞懸浮液加50 μL PBS，再加50 μL 2×SDS上樣緩沖液，進(jìn)行12％ SDS-PAGE電泳檢測(cè)。含有表達(dá)產(chǎn)物細(xì)胞破碎上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次加入鼠抗6×His-Tag mAb(1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜)為 Ⅰ 抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000稀釋?zhuān)覝? h)為 Ⅱ 抗，用化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室條件下感光顯影。

2.6融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP的分離純化與濃度測(cè)定 取20 mL含有表達(dá)產(chǎn)物的經(jīng)過(guò)第3輪感染的Tn-5B1-4細(xì)胞培養(yǎng)液離心后收集細(xì)胞，用100 mmol/L Tris·HC1(pH 8.0)重懸，冰浴中溫和超聲6次(每次2 min，間隔10 s)破碎，4 ℃,10 000×g離心5 min，收集上清，用Ni2+-NTA親合層析柱室溫結(jié)合1 h，用洗滌緩沖液(100 mmol/L Tris·HC1，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗滌5 次后，分別用含100、200、500 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫，過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾待用。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定收集的融合蛋白濃度，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(g/L)。

2.7融合蛋白封閉HER2陽(yáng)性細(xì)胞株SKBR3與HER2陰性細(xì)胞株MCF7功能的對(duì)比分析 胰酶消化鋪滿(mǎn)的乳腺癌細(xì)胞SKBR3和MCF7，重懸于無(wú)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，分別滴入不同稀釋度的anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白樣品(1∶5，1∶20，1∶40)，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使anti-HER2-ScFv與乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MCF7細(xì)胞表面受體充分接觸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108/L，以1 mL/well加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，添加胎牛血清含100 mL/L，37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗3次。激光共聚焦顯微鏡觀察單鏈抗體與SKBR3、MCF7細(xì)胞表面受體結(jié)合情況。用GFP蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)濃度溶液滴定SKBR3作為陰性對(duì)照。

結(jié) 果

1融合基因anti-HER2-ScFv-GFP的獲得

1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明anti-HER2-ScFv在816 bp左右、GFP在720 bp左右，見(jiàn)圖1B,2條片段產(chǎn)物用T4 DNA連接酶直接連接的產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增在1 539 bp左右有明顯條帶，見(jiàn)圖1C，將之克隆到pGEM T easy vector，EcoR I、HindIII雙酶切鑒定結(jié)果在1 539 bp左右有明顯條帶，單酶切結(jié)果在4 500 bp左右，見(jiàn)圖1D，與預(yù)計(jì)相符合。 對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒pGEM T easy vector/anti-HER2-ScFv-GFP測(cè)序,表明整個(gè)融合基因?yàn)? 539 bp，BLAST分析重組子中的融合基因序列與理論序列同源性為100％，因此融合基因成功構(gòu)建，供體質(zhì)粒pGEM T easy vector/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建成功。

Figure 1.Construction of the fusion gene anti-HER2-ScFv-GFP.The anti-HER2-ScFv DNA sequence and GFP DNA sequence were produced by PCR.The two aim gene DNA sequence were digested by restriction enzyme and ligated by the T4 DNA ligase directly.The PCR product was amplified from the ligated product.And the PCR product was cloned into pGEM T easy vector.A:schematic diagram of anti-HER2-ScFv generated by fusing GFP gene in frame with the 5’ end of the fusion genes; B: M: marker;1:the product of aim gene anti-HER2-ScFv; 2: the product of aim gene GFP ;C: M:marker;1: the PCR product amplified from the ligation product of fusion gene anti-HER2-ScFv-GFP; D: M:marker;1:the double digestion product of pGEM T easy vector/anti-HER2-ScFv-GFP;2:the single digestion product of pGEM T easy vector/anti-HER2-ScFv-GFP.

2真核表達(dá)載體重組子pFASTBac-to-BacHTA/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建與重組病毒bacmid的獲得

EcoR I、HindIII雙酶切鑒定重組子pFAST Bac-to-Bac HT A /anti-HER2-ScFv-GFP，1％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)在1 539 bp有明顯條帶，見(jiàn)圖2A，經(jīng)測(cè)序結(jié)果完全正確，陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFAST Bac-to-Bac I /anti-HER2-ScFv-GFP轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后，以M13通用引物PCR鑒定白色菌落，結(jié)果在3 800 bp左右有明顯條帶，見(jiàn)圖2B，與預(yù)計(jì)相符合，證明融合基因anti-HER2-ScFv-GFP完全轉(zhuǎn)座到重組病毒bacmid上。

3融合基因anti-HER2-ScFv-GFP在Tn-5B1-4中的表達(dá)與鑒定分析

重組bacmid在Lipofectin介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Tn-5B1-4細(xì)胞。5 d后有少量綠色熒光顯示，見(jiàn)圖3B，分離獲得血清中的重組病毒顆粒，連續(xù)3輪感染Tn-5B1-4通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白越來(lái)越多，均勻分布于靠近細(xì)胞膜附近,見(jiàn)圖3C、D、E。

經(jīng)12％ SDS-PAGE電泳和Western blotting免疫印跡分析，結(jié)果在55 kD與72 kD之間有1條特異性條帶，與預(yù)計(jì)在60 kD左右有1條目的條帶相符合，見(jiàn)圖4。 Ni2+-NTA親合層析柱純化目的蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度約為144.9 mg/L。

4融合蛋白封閉HER2陽(yáng)性細(xì)胞株SKBR3與HER2陰性細(xì)胞株MCF7功能的對(duì)比分析

將純化后的融合蛋白分別做3個(gè)梯度的稀釋后，不同濃度的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP與HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞SKBR3均結(jié)合，表面分布大量綠色熒光，細(xì)胞表面的熒光單鏈抗體不容易被洗脫，細(xì)胞有微弱的皺縮現(xiàn)象，見(jiàn)圖5A，而3個(gè)梯度的融合蛋白與HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7混合后表面的攜帶綠色熒光單鏈抗體極易被洗脫而表面無(wú)綠色熒光，見(jiàn)圖5B，不同濃度的GFP蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞SKBR3也容易被洗脫而無(wú)法觀察到綠色熒光，見(jiàn)圖5C。

Figure 2.The pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP positive plasmid was digested by restriction enzyme EcoR I and Hind III,and was transformed into dh10Bac cells(containing bacmid and help plasmid).Transposition occurred between the mini-Tn7 element on the pFAST Bac-to-Bac HT A and the mini-att Tn7 target site on the bacmid to generate a recombinant bacmid.The recombinant bacmid was verified by PCR to make sure that the fusion gene anti-HER2-ScFv-GFP had been transferred into bacmid.A: M:marker;1:the double digestion product of pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP positive plasmid;2:the single digestion product of pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP positive plasmid;B: M:marker;1:the PCR product of the recombinant bacmid containing fusion gene anti HER2 ScFv-GFP.

Figure 3.The recombinant bacmid was transfected into insect cells Tn-5B1-4,and the green fluorescence was seen.It was showed that the fusion gene anti-HER2-ScFv-GFP had been integrated into bacmid.The recombinant virus infected insect cells Tn-5B1-4.The result indicated that the anti-HER2-ScFv-GFP with green fluorescent protein was successfully expressed in insect cells Tn-5B1-4.A:negative control;B:insect cells Tn-5B1-4 transfected by the recombinant bacmid;C:insect cells Tn-5B1-4 infected by the recombinant virus at the first phase(5 d);D:insect cells Tn-5B1-4 infected by the recombinant virus at the second phase(5 d);E:insect cells Tn-5B1-4 infected by the recombinant virus at the third phase(5 d).

Figure 4.The SDS-PAGE and Western blotting analysis of the fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP from the infected Tn-5B1-4.It indicated that there was a specific protein between 55 kD and 72 kD.A: the result of the SDS-PAGE analysis.M: marker;1: the fusion anti-HER2-ScFv-GFP purified protein from Tn-5B1-4;2: the fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP from the infected Tn-5B1-4;3:Tn-5B1-4-bacmid;4:Tn-5B1-4 negative control.B: the Western blotting analysis result.M: marker;1: the fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP.

討 論

在乳腺癌的治療中，癌基因HER2的表達(dá)水平與預(yù)后、治療手段的選擇等相關(guān)。雖然HER2在乳腺癌的表達(dá)率不高，但是陽(yáng)性病例在臨床上往往表現(xiàn)預(yù)后差、發(fā)展快。因此，針對(duì)HER2制備抗HER2的單鏈抗體開(kāi)發(fā)新的生物靶向治療方法具有十分重要的意義。

目前,以抗HER2單鏈抗體為研究對(duì)象,將效應(yīng)分子與之融合直接在細(xì)胞中表達(dá)，獲得具有靶向殺傷性抗HER2單鏈抗體，并用其靶向治療HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的報(bào)道越來(lái)越多。此研究思路利用抗HER2單鏈抗體既可以封閉HER2信號(hào)通道，又能特異性地發(fā)揮殺傷作用。裘秀春等[9]將抗HER2單鏈抗體基因e23ScFv與銅綠假單胞菌外毒素PE的轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域基因(PEII)和tBid基因連接，構(gòu)建攜帶抗HER2重組融合蛋白基因ScFv/tBid的真核表達(dá)載體pCMV，轉(zhuǎn)染骨肉瘤E10細(xì)胞,采用間接免疫熒光染色法觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的固縮、核濃縮等形態(tài)特征。王芳等[10]研究重組抗HER2 ScFv/tBid基因在SKBR3細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)轉(zhuǎn)染SKBR3細(xì)胞的作用，結(jié)果表明重組抗HER2 ScFv/tBid分子可以在轉(zhuǎn)染的SKBR3細(xì)胞中表達(dá)，采用間接免疫熒光染色法觀察到該融合蛋白可抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外,以抗HER2單鏈抗體作為導(dǎo)向系統(tǒng)偶聯(lián)各種HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的HER2受體并特異性殺死該腫瘤細(xì)胞的研究還有很多。

Figure 5.The combining function comparison of fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP with HER2-negative breast cancer cell MCF7 and HER2-positive breast cancer cell SKBR3.The combining function of GFP with HER2-positive breast cancer cell SKBR3 was also observed.A: the combining function result of fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP with SKBR3;B: the combining function result of fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP with MCF7;C: the combining function result of GFP with SKBR3.

在融合蛋白的檢測(cè)方面，本研究充分利用綠色熒光蛋白在活細(xì)胞中可直接觀察外源基因表達(dá)的特點(diǎn)，在融合基因的設(shè)計(jì)中,將抗HER2-ScFv基因片段置于融合基因的上游,綠色熒光蛋白GFP置于融合基因下游,通過(guò)引物設(shè)計(jì)刪除抗HER2-ScFv基因的終止密碼子TAA，構(gòu)建成綠色熒光蛋白基因處下游的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP。結(jié)果，利用激光共聚焦顯微鏡或者普通熒光顯微鏡在昆蟲(chóng)細(xì)胞Tn-5B1-4內(nèi)細(xì)胞膜附近可直接觀察到明顯綠色熒光出現(xiàn)，表明綠色熒光蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)，從而可直接斷定該融合基因上游的部分片段抗HER2單鏈抗體基因在該昆蟲(chóng)細(xì)胞中正確表達(dá)。而在前期的抗HER2單鏈抗體的表達(dá)中，眾多研究通過(guò)間接免疫熒光染色法或者夾心ELISA 法進(jìn)行檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)[10，11]，這些方法中需要使用多種抗體參與鑒定過(guò)程或需要使用專(zhuān)業(yè)設(shè)備。而本研究中，若在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)顯示綠色熒光，則表明GFP正確表達(dá)不需要通過(guò)間接免疫熒光染色法或者夾心ELISA 法即可判斷抗HER2-ScFv成功表達(dá)。

在抗HER2單鏈抗體的靶向功能檢測(cè)方面，本研究利用桿狀病毒表達(dá)載體pFAST Bac-to-Bac HT A含有6×His的特點(diǎn)，采用Ni2+-NTA親和層析法獲得高度純化的目的融合蛋白進(jìn)行靶向性驗(yàn)證，弱化了雜質(zhì)對(duì)靶向性的影響。結(jié)果，利用激光共聚焦顯微鏡直接觀察到被認(rèn)定為HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞SKBR3表面均勻分布大量的綠色熒光，且高濃度的融合抗體與SKBR3結(jié)合24 h后有一定的皺縮現(xiàn)象，而被認(rèn)定為HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7與該融合蛋白結(jié)合后很容易被PBS洗脫。分析認(rèn)為，攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈具有靶向結(jié)合HER2陽(yáng)性細(xì)胞表面HER2的功能，更重要的是鑒定靶向性時(shí)也僅需要利用激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡觀察HER2陽(yáng)性細(xì)胞表面的熒光分布情況即可，同時(shí)細(xì)胞發(fā)生皺縮變化等動(dòng)態(tài)現(xiàn)象也很明顯。張立紅等[12]構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pCMV-e23scFv-PEII-revcasp3，并轉(zhuǎn)染人T淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat，篩選并建系。用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中融合蛋白的分泌表達(dá)，將上清接種人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞之后1-6 d用MTT(噻唑藍(lán))比色法檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。姚燕丹等[13]將HER2陽(yáng)性的人乳腺癌BT 474和HER2陰性的人乳腺癌MDA-MB 231細(xì)胞分為單純?cè)灰浦步M和matrigel聯(lián)合移植組，腫瘤組織及相關(guān)臟器送病理切片和HE染色及免疫組化，比較matrigel對(duì)2種乳腺癌細(xì)胞移植后腫瘤形成時(shí)間、成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的情況，結(jié)果用免疫組化法和HE染色法，然后用光鏡觀察腫瘤凋亡和增殖情況。從方法學(xué)上比較，在融合蛋白的表達(dá)和靶向性檢測(cè)2個(gè)方面充分利用綠色熒光的報(bào)告作用，對(duì)簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟、避免誤差有一定作用。

在抗HER2單鏈抗體的結(jié)合效率方面，將濃度為144.9 mg/L的純化蛋白3個(gè)梯度進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，均在HER2陽(yáng)性的細(xì)胞表面有明顯熒光，可以認(rèn)為攜帶綠色熒光的融合抗HER2單鏈抗體具有特異靶向性。從pFAST Bac to Bac HT A表達(dá)載體的序列圖譜看，核糖體結(jié)合位點(diǎn)后的第1個(gè)翻譯起始密碼子ATG與目的融合基因的起始密碼子之間的堿基數(shù)目多翻譯出30個(gè)氨基酸，其是由ATG、6×His、TEV site構(gòu)成，分析認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中得到的抗HER2單鏈抗體實(shí)際是在上游多出30個(gè)氨基酸，下游多出1個(gè)綠色熒光蛋白的融合蛋白，功能域幾乎沒(méi)有影響。但是，將該種攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體與藥物分子相互結(jié)合，再進(jìn)行靶向殺傷治療，是否有影響還需要進(jìn)一步研究。

本研究利用抗HER2 ScFv在抗HER2治療中的靶向功能，又利用綠色熒光蛋白的報(bào)告作用，將為研究抗HER2治療提供新思路。本實(shí)驗(yàn)的成功使原來(lái)不可見(jiàn)的單鏈抗體封閉乳腺癌細(xì)胞表面HER2受體現(xiàn)象在熒光蛋白的報(bào)告下能夠變得可見(jiàn)。通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度可以對(duì)抗HER2單鏈抗體基因的表達(dá)水平和封閉效率進(jìn)行判斷，更直觀分析乳腺癌細(xì)胞凋亡與單鏈抗體濃度變化的關(guān)系。

[1]Baxevanis CN,Sotiropoulou PA,Sotiriadou NN,et al.Immunobiology of HER-2/neuoncoprotein and its potential application in cancer immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother,2004,53(3):166-175.

[2]Zhou H,Randall RL,Brothman AR,et al.Her-2/neu expression in osteosarcoma increases risk of lung metastasis and can be associated with gene amplification[J].J Pediatr Hematol Oncol,2003,25(1):27-32.

[3]Morris CD,Gorlick R,Huvos G,et al.Human epidermal growth factor receptor 2 as a prognostic indicator in osteogenic sarcoma[J].Clin Orthop Relat Res,2001,(382):59-65.

[4]Ross JS,Fletcher JA.The HER-2/neuoncogene: prognostic factor,predictive factor and target for therapy[J].Semin Cancer Biol,1999,9(2):125-138.

[5]Salmon DJ,Clark GM,Wong SG,et al.Human breast cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER2/neu oncogene[J].Science,1987,235(4785):177-182.

[6]Li X,Stuckert P,Bosch L,et al.Single chain antibody-mediated gene delivery into ErbB2-positive human breast cancer cell[J].Cancer Gene Ther,2001,8(8):555-565.

[7]Tsai YS,Shiau AL,Chen YF,et al.Enhancement of antitumor activity of gammaretrovirus carrying IL-12 gene through genetic modification of envelope targeting HER2 receptor: a promising strategy for bladder cancer therapy[J].Cancer Gene Ther,2010,17(1):37-48.

[8]Tse C,Brault D,Gligorov J,et al．Evaluation of the quantitative analytical methods real-time PCR forHER-2 gene quantification and ELISA of serum HER-2 protein and comparison with fluorescenceinsituhybridization and immunohistochemistry for determining HER-2 status in breast cancer patients[J]．Clin Chem，2005，51(7)：1093-1101．

[9]裘秀春,單樂(lè)群,紀(jì)振鋼,等.重組抗HER2融合蛋白基因ScFv/tBid對(duì)骨肉瘤E10細(xì)胞的促凋亡作用[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2008,15(2):105-109.

[10]王 芳，裘秀春，王立鋒,等.重組抗HER2 ScFv/tbid基因的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌SKBr-3細(xì)胞的促凋亡作用[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(12):1057-1059.

[11]解志剛,郭 寧,施 明,等.抗人P185erbB2的scFv-Fc 融合蛋白的表達(dá)及免疫功能分析[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2003,35 (4): 371-374.

[12]張立紅，賈林濤，鮑 煒,等.抗HER2單鏈抗體融合凋亡蛋白對(duì)SKOV3細(xì)胞的靶向殺傷[J].細(xì)胞與分子免疫雜志，2003，19(2)：160-162.

[13]姚燕丹，黃松音，袁廣卿,等.Matrigel對(duì)不同Her2表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞原位成瘤、增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2009，25(12)：2338-2343.

Expressionoffusionproteinanti-HER2-ScFv-GFPininsectcellsandbindingtosurfaceofbreastcancercells

GAO Guo-hui1,WANG Jin-dan1,HUANG Qi-di2,YANG Ji-feng1,YANG Shui-bing1,BAO Bing-bing3,ZHANG Yu3,HU Xiao-qu2

(1SchoolofLifeSciences,2DepartmentofSurgicalOncology,TheFirstAffiliatedHospital,3RenjiSchool,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:drhxj@163.com)

AIM: To express a recombinant fusion protein anti-human epidermal growth factor receptor-2 single-chain variable fragment with green fluorescent protein (anti-HER2-ScFv-GFP) using the insect cells-Bac-to-Bac baculovirus expression system and to analyze the binding function of this fusion protein with HER2 on the surface of the breast cancer cells.METHODSHuman anti-HER2-ScFv gene from mice was fused with GFP gene.To obtain the recombinant plasmid pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,we inserted it into Bac-to-Bac baculovirus expression plasmid pFAST Bac-to-Bac HT A.The identified recombinant plasmid was transferred intoEscherichiacoliDH10Bac to allow the generation of a recombinant bacmid.After transfected the recombinant virus bacmid into the insect cells Tn-5B1-4,the recombinant virus was collected to infect Tn-5B1-4.SDS-PAGE and Western blotting analysis were used to verify the expression product in Tn-5B1-4.The fusion protein was purified with Ni2+-NTA affinity chromatography.The purified fusion protein was bound to the surface of HER2-positive breast cancer cells SKBR3 and HER2-negative breast cancer cells MCF7.The binding effects on the surface of breast cancer cells were observed under laser confocal microscope.RESULTSThe fusion gene anti-HER2-ScFv-GFP was successfully constructed with the length of 1 539 bp.The green fluorescence was also observed in Tn-5B1-4 cells infected with the recombinant virus under fluorescent microscope.A 60 kD protein was examined and confirmed by SDS-PAGE and Western blotting.Under laser confocal microscope,strong green fluorescence was observed on the surface of the HER2-positive breast cancer cells SKBR3.However,no green fluorescence was observed on the surface of HER2-negative breast cancer cell MCF7.Obvious green fluorescence on the surface of HER2-positive breast cancer cell SKBR3 was also found after the cells were eluted with 1×PBS.CONCLUSIONThe fusion protein anti-HER2-ScFv-GFP was successfully expressed in insect cells Tn-5B1-4,and can firmly bind to the surface of breast cancer cells SKBR3 and emit the green fluorescent light.

anti-HER2-ScFv; Green fluorescent protein; Fusion gene expression

1000-4718(2011)05-1034-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.040

2010-12-16

2011-03-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30801118/C160403)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Y207301)；溫州市科技局資助項(xiàng)目((No.Y20090293;No.Y2003A138)

△通訊作者 Tel：0577-88078237；E-mail：drhxj@163.com