妊娠期脂多糖接觸激活體內(nèi)TLR4信號(hào)通路引起胚胎腦內(nèi)炎癥應(yīng)激

朱元貴， 陳曉春， 陳志

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，2 血液科，福建省血液病研究所，福建 福州 350001；3 Rush大學(xué)醫(yī)學(xué)中心藥理學(xué)系，美國(guó)伊利諾伊州 芝加哥市 60612)

妊娠期脂多糖接觸激活體內(nèi)TLR4信號(hào)通路引起胚胎腦內(nèi)炎癥應(yīng)激

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，福建省老年醫(yī)學(xué)研究所，2血液科，福建省血液病研究所，福建 福州 350001；3Rush大學(xué)醫(yī)學(xué)中心藥理學(xué)系，美國(guó)伊利諾伊州 芝加哥市 60612)

目的： 觀察孕鼠腹腔脂多糖 (LPS) 注射后母體外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMNC) 上Toll樣受體4 (TLR4) 信號(hào)通路激活情況和胚胎腦組織中炎癥性細(xì)胞因子的水平。方法10.5 d孕鼠腹腔注射LPS 0、3、6、12、24、48 和72 h后，通過(guò)蛋白免印跡測(cè)定孕鼠PBMNC 上TLR4、分化抗原14 (CD14)、髓樣分化蛋白2 (MD-2)、p65和p50蛋白水平，Luminex 100免疫熒光法測(cè)定孕鼠血清、羊水、腦組織及胚胎腦組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白水平，實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定孕鼠PBMNC和胚胎腦組織TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平。結(jié)果LPS腹腔注射誘導(dǎo)激活孕鼠PBMNC上TLR4信號(hào)通路，TLR4、CD14和MD-2蛋白水平短暫增高，核因子κB (NF-κB) 激活片段p65 和p50蛋白水平增高，TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平增高(Plt;0.01)；孕鼠外周血和羊水TNF-α、IL-1β和IL-10水平短暫增高(Plt;0.01)，腦內(nèi)IL-1β蛋白水平短暫升高(Plt;0.01)；胚胎腦內(nèi)TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA水平顯著增高(Plt;0.01)。結(jié)論妊娠期母體LPS接觸可激活母體外周免疫細(xì)胞TLR4信號(hào)通路，引發(fā)胚胎腦內(nèi)炎癥應(yīng)激狀態(tài)，可能增加出生后相關(guān)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

脂多糖； Toll樣受體4; 細(xì)胞因子類； 胚胎

細(xì)菌性陰道炎 (bacterial vaginosis,BV) 是妊娠期常見的感染性疾病，大約占妊娠人數(shù)的14％[1]。BV是引起早產(chǎn)、低體重兒和死胎的重要原因[2,3]。BV主要由革蘭陰性菌引起，引起絨毛膜組織腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β (interleukin 1β,IL-1β) 和白細(xì)胞介素6 (IL-6) 水平明顯增高[4,5]。在BV孕婦羊水中也可以檢測(cè)出內(nèi)毒素成分脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)[5]。LPS可誘導(dǎo)胎盤絨毛組織生成炎性細(xì)胞因子和前列腺素，與流產(chǎn)和早產(chǎn)有關(guān)[6]。此外，BV與白質(zhì)損傷和腦癱等胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生有關(guān)[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Sprague-Dawley (SD) 大鼠在多巴胺 (dopamine,DA) 能神經(jīng)元發(fā)育早期階段即妊娠期第10.5 d腹腔注射LPS后引起出生后個(gè)體DA 能神經(jīng)元數(shù)量減少、紋狀體DA含量降低、腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平升高[8-10]等帕金森病 (Parkinson disease,PD) 特征性的神經(jīng)病理變化，提示妊娠期感染可能是胚胎出生后發(fā)生PD的重要危險(xiǎn)因素之一，但是妊娠期母體LPS暴露如何影響胚胎和出生后個(gè)體DA系統(tǒng)的功能還不清楚。

LPS是革蘭陰性菌的主要致病成分，具有強(qiáng)烈的免疫激活功能，誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞因子失控性表達(dá)。Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4,TLR4) 是LPS主要識(shí)別受體，是介導(dǎo)LPS引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活不可缺少的細(xì)胞表面成分之一[11]。LPS首先與血清的LPS結(jié)合蛋白 (LPS-binding protein,LBP) 結(jié)合，然后再結(jié)合于細(xì)胞表面的CD14分子。LPS以LPS-LBP-CD14三體復(fù)合物形式活化TLR4信號(hào)通路。同時(shí)結(jié)合于TLR4胞外區(qū)的髓樣分化因子-2 (myeloid differentiation factor 2,MD-2) 對(duì)于穩(wěn)定LPS-LBP-CD14復(fù)合物具有重要的作用，是TLR4信號(hào)通路中不可缺少的成分之一[12]。TLR4參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以通過(guò)核因子 (nuclear factor κB,NF-κB) 激活細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，如IL-1、IL-6和IL-8，介導(dǎo)B7家族成員表達(dá)活化[13]。

因此本研究觀察孕鼠第10.5 d LPS腹腔注射后孕鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMNC) TLR4、CD14、MD-2、p65和p50蛋白以及細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-10 mRNA水平的變化，同時(shí)測(cè)定孕鼠血清、羊水和腦內(nèi)TNF-α、IL-1β 和IL-10 蛋白以及胚胎腦內(nèi)細(xì)胞因子蛋白和mRNA水平，為妊娠期LPS暴露引起出生后個(gè)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常提供胚胎早期異常的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物的選擇

2 月齡成年SD大鼠購(gòu)自Zivic-Miller公司。所有的動(dòng)物飼養(yǎng)在清潔級(jí)的動(dòng)物中心，常規(guī)給于飼料和飲用水，所有的動(dòng)物在使用前3 d送達(dá)，以讓動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境。所有有關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方案經(jīng)過(guò)美國(guó)Rush大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2SD孕鼠腹腔LPS注射

于妊娠期第10.5 d (embryonic day 10.5,E10.5) 腹腔注射LPS (Sigma,型號(hào)：Escherichiacoli026∶B6; 目錄號(hào): L-8274; 10 000 endotoxin units/kg溶于HBSS中) 或HBSS (Hank’s balanced salt solution) 對(duì)照，分別于注射后0、3、6、12、24、48和72 h后處死孕鼠，對(duì)照組取72 h，每組5只，分別收集孕鼠和胚胎組織，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

3動(dòng)物的處死和標(biāo)本的收集

常規(guī)苯巴比妥鈉 (65 mg/kg) 麻醉后打開腹腔，用27G1注射針頭迅速收集羊水，加入肝素抗凝，然后取出胎盤和胚胎組織置于預(yù)冷的HBSS中，隨后母體心室內(nèi)抽取5-10 mL全血，肝素抗凝后用于單個(gè)核細(xì)胞的分離，同時(shí)抽取1 mL全血用于分離血清。最后心室內(nèi)灌注預(yù)冷的生理鹽水，迅速取出大腦放入干冰預(yù)冷的2-甲基丁烷迅速冷凍后置于-80 ℃保存。胚胎斷頭后在解剖顯微鏡下剝離腦膜及血管，分離出的大腦組織用PBS沖洗后，一半置于組織裂解液(Bio-Rad)，另一半置于Trizol液(Invitrogen)中，均用超聲波勻漿儀 (Biologics) 制備勻漿后于-80 ℃下保存不超過(guò)2個(gè)月。

4PBMNC分離

用Ficoll-Paque Plus淋巴細(xì)胞分離液 (Amersham Biosciences) 常規(guī)分離PBMNC，PBS清洗2次制備細(xì)胞懸液，分成2份離心去掉上清液，一份加入100 μL組織裂解液，另一份加入200 μL Trizol液，混勻后于-80 ℃下保存。

5孕鼠腦組織的分離

把冷凍的全腦置于干冰預(yù)冷的大理石板上，根據(jù)大鼠腦部解剖圖譜，從水平方向切成2 mm厚的薄片，根據(jù)紋狀體和中腦所在部位，用直徑為2 mm的中空組織收集細(xì)針收集紋狀體和中腦黑質(zhì)組織，同時(shí)收集小腦組織，置于組織裂解液(每10 mg組織至少200 μL裂解液)中，然后用超聲波勻漿儀制備勻漿后低溫12 000×g離心30 min，汲取上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定(Bio-Rad)，蛋白濃度表示為g/L。

6PBMNC細(xì)胞裂解液Westernblotting測(cè)定

細(xì)胞裂解液低溫下12 000×g離心15 min后汲取上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定后用裂解液稀釋成2 g/L的樣本液，然后加入等體積的上樣緩沖液 (62.5 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8,10％ 甘油,2％ SDS,0.1％ 溴酚藍(lán))，熟沸5 min，冷卻后取樣品30 μg以10％ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，室溫下用封閉液 (含5％脫脂奶粉和1.2％Tween 20)封閉1 h后分別加入用封閉液稀釋的兔抗鼠TLR4 (Santa cruz,1∶500),或CD14 (Santa Cruz,1∶500),或MD-2 (Santa Cruz,1∶500)，或p65和p50 (Santa Cruz,1∶1 000)，或β-actin (Abcam,1∶4 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，用1∶4 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG(Vector)孵育2 h，再用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色 (Pierce)，X射線底片 (Fujifilm RX) 曝光。同時(shí)選擇β-actin為內(nèi)參照。每次曝光后底片掃描后對(duì)條帶的點(diǎn)密度用Scion的軟件進(jìn)行定量，然后與β-actin作比較，計(jì)算出相對(duì)百分值。

7細(xì)胞因子的測(cè)定

細(xì)胞因子的測(cè)定利用Bio-Rad的多細(xì)胞因子分析試劑盒(TNF-α,IL-1β,IL-10)測(cè)定，測(cè)定方法為L(zhǎng)uminex 100免疫熒光法，具體方法可參考文獻(xiàn)[14,15]。這種方法的原理是把不同的抗體連接到特殊的微粒上，然后與標(biāo)本孵育，這樣抗原與抗體結(jié)合在微粒上后再與生物素標(biāo)記的抗體孵育后形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物，最后用鏈親和素標(biāo)記的Ⅱ抗結(jié)合生物素標(biāo)記的抗體，結(jié)合流式細(xì)胞儀測(cè)定微粒的熒光信號(hào)，進(jìn)行定量測(cè)定。血清和羊水用分析液進(jìn)行1∶8稀釋，腦組織提取液用裂解液調(diào)整蛋白濃度到1 g/L后再測(cè)定。血清和羊水樣本的細(xì)胞因子濃度表示為ng/L，腦組織樣本的濃度表示為ng/g 蛋白，所有標(biāo)本重復(fù)測(cè)定，取平均值作為樣本的值。當(dāng)樣本的熒光強(qiáng)度值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低值1.95 ng/L時(shí)，取1.95 ng/L作為測(cè)定值進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

8實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-timeRT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

利用Trizol常規(guī)提取PBMNC和胚胎腦組織總RNA，RNA定量后用DNase (Ambion) 處理樣本去除DNA污染以純化RNA，然后應(yīng)用一步法real-time RT-PCR檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA的表達(dá)水平，并以β-actin為參照，試劑購(gòu)自Qiagen。引物序列見表1。25 μL的反應(yīng)體系包括1× RT混合液、0.5 μmol/L的引物和2.5單位的逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)以SYBR Green為熒光指示劑。反應(yīng)在50℃下30 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，95 ℃下15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后94 ℃變性15 s，退火溫度和時(shí)間見表1，72 ℃延伸45 s，共30 (β-actin) 或40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果根據(jù)熔解溫度 (Tm) 進(jìn)行判定。選擇LPS腹腔注射6 h后脾組織的總RNA建立TNF-α、IL-1β、IL-10和β-actin mRNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品確定樣本的mRNA相對(duì)量，并與內(nèi)參照β-actin對(duì)比，計(jì)算出樣本內(nèi)不同細(xì)胞因子與β-actin的比值。另外在擴(kuò)增終點(diǎn)取8 μL的產(chǎn)物，進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳并拍照，進(jìn)一步確定PCR反應(yīng)的特異性。

表1 實(shí)時(shí)RT-PCR的引物序列和擴(kuò)增條件

9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1孕鼠LPS注射后母體PBMNC上TLR4信號(hào)通路的激活

孕鼠PBMNC上表達(dá)有TLR4、MD-2和CD14，LPS腹腔注射后以上蛋白組份均短暫增高 (Plt;0.01vs0 h)，見圖1。LPS注射后在3 h-12 h間可見NF-κB激活片段p65和p50表達(dá)，提示LPS可快速誘發(fā)免疫細(xì)胞內(nèi)TLR4信號(hào)通路中NF-κB激活，促進(jìn)核內(nèi)有關(guān)炎癥性基因的轉(zhuǎn)錄。

2孕鼠LPS注射后母體PBMNC細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平

由圖2可見，LPS注射后PBMNC上TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯增高(Plt;0.01vs0 h)。TNF-α mRNA水平3 h后就達(dá)到峰值，48 h后逐漸恢復(fù)到正常水平。IL-1β mRNA持續(xù)升高到6 h后逐漸下降，在72 h后仍高于正常值水平，而IL-10 mRNA水平在12 h后明顯上升，但24 h后就逐漸恢復(fù)到正常水平。

Figure 1.Maternal lipopolysaccharide (LPS) administration induces a variety of proteins expressed in peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of gravid rats.±s.n=5.**Plt;0.01 vs control (0 h).

Figure 2.The mRNA levels of TNF-α,IL-1β and IL-10 in PBMNC of gravid rats after maternal LPS administration.±s.n=5.*Plt;0.05,**Plt;0.01 vs control (0 h).

3孕鼠LPS注射后母體血清、羊水和腦內(nèi)細(xì)胞因子水平

由表2可見，LPS作用后孕鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)。TNF-α在6 h就達(dá)到高峰，隨后持續(xù)下降。IL-1β持續(xù)升高到12 h后緩慢下降，72 h仍高于正常水平 (Plt;0.01vs0 h)。此外LPS作用6 h后IL-10水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)，24 h后迅速下降到正常水平。

同時(shí)，E10.5腹腔注射LPS后可見羊水內(nèi)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)。此外孕鼠腦內(nèi)紋狀體、中腦黑質(zhì)和小腦組織內(nèi)只有IL-1β出現(xiàn)水平升高 (結(jié)果未顯示)，24 h后恢復(fù)到正常水平。

4孕鼠LPS注射后胚胎腦組織內(nèi)細(xì)胞因子水平

E10.5孕鼠腹腔注射LPS后3 h胚胎腦組織內(nèi)TNF-α和IL-1β水平明顯增高 (Plt;0.01vs0 h)，見表3，而IL-10水平?jīng)]有改變。TNF-α和IL-1β 72 h后仍高于對(duì)照組水平，提示胚胎腦內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子水平增高。

5孕鼠LPS注射后胚胎腦組織內(nèi)細(xì)胞因子mRNA水平

為進(jìn)一步驗(yàn)證腦組織內(nèi)的細(xì)胞因子是否來(lái)源于胚胎腦組織本身轉(zhuǎn)錄翻譯，我們還測(cè)定了腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表達(dá)水平。由圖3可見，LPS作用后腦內(nèi)TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平明顯增加 (Plt;0.01vs0 h)。其中TNF-α mRNA 24 h后下降到正常水平，IL-1β在48 h后逐漸下降到正常值水平，而IL-10 mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。

表2 孕鼠腹腔LPS注射后不同時(shí)點(diǎn)血清和羊水細(xì)胞因子水平

表3 孕鼠腹腔LPS注射后不同時(shí)點(diǎn)胚胎腦內(nèi)細(xì)胞因子水平

Figure 3.The mRNA levels of TNF-α,IL-1β and IL-10 in embryonic brains after maternal LPS administration..n=5.**Plt;0.01 vs control (0 h).

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)孕鼠LPS接觸后可通過(guò)TLR4信號(hào)通路激活母體PBMNC上NF-κB，誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，并引起胚胎腦內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子水平增高。結(jié)合我們前期發(fā)現(xiàn)的E10.5腹腔注射LPS可引起出生后個(gè)體DA 能神經(jīng)元數(shù)量減少[8-10]，推測(cè)在DA能神經(jīng)元發(fā)育階段，妊娠母體內(nèi)毒素誘發(fā)的胎兒腦內(nèi)炎癥應(yīng)激，可能會(huì)影響胚胎期DA神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育，最終引起出生后個(gè)體DA神經(jīng)元系統(tǒng)功能障礙。

TLR4廣泛表達(dá)在各種免疫細(xì)胞表面。本研究中，孕鼠腹腔注射LPS后PBMNC TLR4、CD14和MD-2短暫性表達(dá)增加，同時(shí)LPS誘導(dǎo)NF-κB激活引起p65和p50水平增加。PBMNC內(nèi)TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平以及血清中有關(guān)細(xì)胞因子水平亦明顯升高。PBMNC內(nèi)p65水平升高、細(xì)胞因子mRNA表達(dá)升高和血清中細(xì)胞因子水平升高具有一定的時(shí)間次序，提示PBMNC可識(shí)別LPS誘發(fā)信號(hào)激活NF-κB，隨后引起細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)在LPS作用的早期血清中抗炎性細(xì)胞因子IL-10亦有升高。IL-10處理后的單核細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性明顯下降，提示IL-10在LPS引起的炎癥反應(yīng)中起對(duì)抗作用[16]。LPS引起IL-10水平的升高和IL-10的對(duì)抗作用發(fā)生在TNF-α和IL-1β等炎癥性細(xì)胞因子水平升高以后[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)IL-10蛋白或mRNA水平均較TNF-α和IL-1β反應(yīng)慢，而且持續(xù)的時(shí)間較IL-1β短，提示LPS暴露后IL-10水平增高可能是一種防御性作用，但炎癥性細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，誘導(dǎo)了炎癥損傷。

LPS作用后孕鼠體內(nèi)免疫細(xì)胞通過(guò)TLR4信號(hào)途徑識(shí)別LPS和激活信號(hào)通路并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子，這種作用引起的炎癥性細(xì)胞因子是否會(huì)影響胚胎的發(fā)育，或是胚胎本身是否能識(shí)別LPS從而誘發(fā)自身的免疫反應(yīng)，目前還不清楚。本研究結(jié)果證實(shí)孕鼠LPS接觸會(huì)引起胎兒腦內(nèi)炎癥性細(xì)胞因子水平升高，這種結(jié)果對(duì)于包括DA神經(jīng)元系統(tǒng)在內(nèi)的神經(jīng)組織發(fā)育具有重要的影響作用。在胚胎發(fā)育的早期，由于胎盤屏障和血腦屏障發(fā)育不成熟，母體LPS接觸后產(chǎn)生的細(xì)胞因子可能通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入胎盤和胚胎組織引起胚胎腦內(nèi)細(xì)胞因子增高，或是妊娠母體LPS直接進(jìn)入胚胎體內(nèi)。但是此階段胚胎是否識(shí)別LPS以及如何激活自身的免疫系統(tǒng)還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)胚胎腦內(nèi)只有炎癥性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-1β)在蛋白和mRNA水平明顯升高，而IL-10沒(méi)有明顯改變，而妊娠母體外周血TNF-α、IL-1β和IL-10水平均明顯增高，提示胚胎腦內(nèi)TNF-α和IL-1β可能來(lái)源于胚胎本身對(duì)LPS的識(shí)別和免疫激活。事實(shí)上，TLR4表達(dá)在胚胎發(fā)育的早期，小鼠在E10就可在胚盤組織上檢出TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)，肺和肝臟組織也可在E13檢出TLR2和TLR4 mRNA[17]。我們也發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎腦組織在E10就可以檢測(cè)出TLR2和TLR4蛋白表達(dá)(資料未顯示)，利用熒光標(biāo)記的LPS腹腔注射孕鼠后在胚胎體內(nèi)可見熒光物質(zhì)[18]，因此推測(cè)在E10.5，妊娠母體LPS暴露后LPS可能會(huì)直接通過(guò)胎盤組織或血液循環(huán)進(jìn)入胚胎體內(nèi)，識(shí)別TLR4引發(fā)相應(yīng)的信號(hào)激活和基因轉(zhuǎn)錄。

綜上所示，本研究提示妊娠期內(nèi)毒素暴露可誘發(fā)機(jī)體通過(guò)TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)NF-κB激活和炎癥性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)胚胎炎癥應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致相應(yīng)窗口期的組織器官發(fā)育異常，增加出生后神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

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MaternalexposuretolipopolysaccharideinducesTLR4signalingactivationandembryonicbraininflammatorystressingravidrats

(1DepartmentofNeurology,UnionHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianInstituteofGeriatrics,Fuzhou350001,China;2DepartmentofHematology,UnionHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianInstituteofHematology,Fuzhou350001,China;3DepartmentofPharmacology,RushUniversityMedicalCenter,Chicago,Illinois60612,USA.E-mail:ygzhu92@gmail.com)

AIM: To observe the signaling activation of Toll-like receptor 4 (TLR4) in peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of gravid rats and inflammatory cytokine response in embryonic brains following maternal exposure to lipopolysaccharide (LPS).METHODSTimed-pregnant rats at embryonic day 10.5 (E10.5) were intraperitoneally injected with LPS (10 000 endotoxin unit/kg).The PBMNC,serum and amniotic fluid (AF) in gravid rat,and fetal brain were harvested 0 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h and 72 h after LPS administration.Western blotting was performed to measure the protein levels of TLR4,cluster of differentiation 14 (CD14),myeloid differentiation factor 2 (MD-2),p65 and p50 in PBMNC.Luminex 100 multiplex cytokine assay and real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to determine the protein and mRNA levels of tumor necrosis factor α (TNF-α),interleukin 1β (IL-1β) and interleukin 10 (IL-10).RESULTSMaternal LPS exposure led to TLR4 signaling activation in PBMNC of gravid rats,with a transient (within 6 h) increase in the protein levels of TLR4,CD14 and MD-2,as well as p65 and p50,activated subunits of nuclear factor κB (NF-κB) .Proinflammatory cytokines TNF-α and IL-1β,as well as anti-inflammatory cytokine IL-10,were significantly increased in the serum and AF of gravid rats.There was only a transient increase in IL-1β protein in the brains of gravid rats.In contrast,both protein and mRNA levels of TNF-α and IL-1β were significantly increased in embryonic brains over the time course of 3 h and 48 h.CONCLUSIONThe results reveal that maternal exposure to LPS induces TLR4 signaling activation in peripheral immune cells of gravid rats and inflammatory stress in embryonic brains,indicating the pathogenesis of some postnatal diseases.

Lipopolysaccharide; Toll-like receptor 4; Cytokines; Embryo

1000-4718(2011)05-0956-06

R711; Q189

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.023

2010-11-15

2011-02-22

△ 通訊作者 Tel: 0591-83357896-8525; E-mail: ygzhu92@gmail.com