• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小凹蛋白-1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR介導(dǎo)NO生成中的作用和機(jī)制*

    2011-11-20 03:35:51王振煥胡清華鄧峰美陳雄英孫志萍
    中國病理生理雜志 2011年5期
    關(guān)鍵詞:精胺內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)粒

    王振煥, 胡清華, 鐘 華, 鄧峰美, 陳雄英, 孫志萍, 何 芳△

    (1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2病理生理教研室,3醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心,新疆 石河子 832002;4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,衛(wèi)生部呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430030)

    小凹蛋白-1在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR介導(dǎo)NO生成中的作用和機(jī)制*

    王振煥1,2, 胡清華3, 鐘 華1,2, 鄧峰美1,2, 陳雄英1,2, 孫志萍4, 何 芳1,2△

    (1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院2病理生理教研室,3醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心,新疆 石河子 832002;4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,衛(wèi)生部呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430030)

    目的: 探討小凹蛋白-1(Cav-1)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)鈣敏感受體(CaR)介導(dǎo)NO生成中的作用和機(jī)制。方法利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的Cav-1干擾質(zhì)粒(Cav-1 shRNA)轉(zhuǎn)染入HUVECs,隨機(jī)分為:(1) 對照組;(2)CaR激動劑 (精胺)組;(3) 精胺+Ca2+組;(4) CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(Calhex231)+精胺組;(5) Calhex231+精胺+Ca2+組;(6) 非律平(filipin)+精胺組;(7) filipin+精胺+ Ca2+組;(8)空質(zhì)粒 (vehicle)+精胺+Ca2+組;(9) Cav-1 shRNA+精胺組;(10) Cav-1 shRNA+精胺+Ca2+組。Western blotting檢測Cav-1 shRNA轉(zhuǎn)染后HUVECs中CaR和Cav-1蛋白表達(dá),通過NO熒光探針DAF-FM DA負(fù)載HUVECs檢測細(xì)胞內(nèi)NO的生成;并在提供充足底物的條件下檢測細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。結(jié)果Cav-1干擾后,Cav-1蛋白表達(dá)降低,同時(shí) CaR的膜蛋白表達(dá)降低(Plt;0.05),CaR的漿蛋白表達(dá)無變化(Pgt;0.05)。無論細(xì)胞外為零鈣液或含鈣液時(shí),精胺(2 mmol/L)刺激CaR時(shí)均引起eNOS活性和NO含量增加(Plt;0.05),其中細(xì)胞外液為含鈣液時(shí),eNOS活性和NO含量增加較細(xì)胞外為零鈣液時(shí)更明顯(Plt;0.05),Calhex231 (1 μmol/L)可阻斷(細(xì)胞外為零鈣液)或降低(細(xì)胞外液為含鈣液) 精胺介導(dǎo)的上述作用 (均Plt;0.05);此作用亦可被filipin (1.5 mg/L)或Cav-1基因沉默減弱(細(xì)胞外液為含鈣液) (均Plt;0.05)。結(jié)論HUVECs中Cav-1對CaR介導(dǎo)的NO生成有促進(jìn)作用,其機(jī)制可能與Cav-1影響CaR膜定位及對激動劑反應(yīng)性有關(guān)。

    小凹蛋白-1; 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞; 受體,鈣敏感; 一氧化氮

    生理?xiàng)l件下,NO主要源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)增加為激活eNOS的重要條件;而小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)為eNOS的負(fù)調(diào)控蛋白,也是小凹(caveolae)表面標(biāo)志蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白[1]。鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor, CaR)為G蛋白偶聯(lián)受體C家族的II型受體。該受體激活后經(jīng)磷脂酶C (phospholipase C,PLC),增加胞內(nèi)三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,IP3)和二磷酸甘油(diphosphoglycerate,DAG),使[Ca2+]i升高,抑制甲狀旁腺素的分泌,在維持全身鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[2,3]。此外,CaR在影響NOS活性和NO生成中也發(fā)揮重要作用。人主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中功能性的CaR表達(dá),在CaR激動劑精胺的刺激下,引起[Ca2+]i增加和NO生成[4,5]。如上所述,Ca2+為激活eNOS生成NO的重要輔助因子,而Cav-1是介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流重要的支架蛋白,又是eNOS的負(fù)調(diào)控蛋白。同時(shí),文獻(xiàn)已證實(shí)Cav-1為CaR的相互作用蛋白之一。在培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞株(Saos-2),Cav-1與CaR相互結(jié)合,Cav-1可上調(diào)CaR的功能[6,7]。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)有CaR和Cav-1表達(dá),兩者共定位于膜上,Cav-1對CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流有下調(diào)作用(資料已整理投稿)。那么,在HUVECs,CaR激活后是否具有介導(dǎo)NO生成作用,Cav-1對此有何種調(diào)節(jié)作用?有待證實(shí)。

    本課題在前期研究基礎(chǔ)上,以原代培養(yǎng)的HUVECs為研究對象,觀察了CaR激動劑精胺(spermine)和負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231處理后HUVECs中eNOS活性和NO生成變化,以及Caveolae結(jié)構(gòu)破壞劑非律平(filipin)或Cav-1基因沉默后對HUVECs中eNOS活性和NO生成影響,試圖闡明Cav-1在CaR介導(dǎo) NO生成中作用和機(jī)制,為心腦血管疾病防治提供新思路 。

    材 料 和 方 法

    1主要材料和試劑

    1.1主要試劑 健康孕婦剖宮產(chǎn)的新鮮臍帶(來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院,經(jīng)倫理道德委員會批準(zhǔn)和個(gè)人知情同意);胰酶(Sigma);M199 (Thermo);胎牛血清(Gibco); 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM,ScienCell);明膠(Sigma);精胺(Sigma);filipin (Sigma); Calhex231 (Sigma);Cav-1Ⅰ抗(Cell Signaling Technology);CaRⅠ抗(Affinity BioReagents,ABR);β-actin抗體(Santa Cruz);ECL發(fā)光試劑盒(Thermo);LipofectamineTM2000 (Invitrogen);Cav-1shRNA質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P公司);G418 (Biosharp);NOS和NO檢測試劑盒(Beyotime);去內(nèi)毒素高純度質(zhì)粒抽提試劑盒(Omega)。

    2方法

    2.1HUVECs的培養(yǎng)與鑒定 依據(jù)本研究室以前的研究方法培養(yǎng)HUVECs,并對其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及對細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色來鑒定是否為HUVECs。取2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    2.2實(shí)驗(yàn)分組 按照以下方式分組處理,并持續(xù)灌流20 min,其中細(xì)胞外不含鈣離子組和含鈣離子組分別用Ca2+-free HBS溶液和含2 mmol/L Ca2+的HBS溶液將藥物配制成不同濃度灌流:(1) 對照組;(2) spermine (2 mmol/L)組;(3) spermine + Ca2+組;(4) Calhex231 (1 μmol/L) + spermine組;(5) Calhex231+spermine+Ca2+組;(6) filipin (1.5 mg/L)+spermine組;(7) filipin+spermine+ Ca2+組;(8) 轉(zhuǎn)染組:又分為空白對照組(Control 組),vehicle 組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒, Cav-1 shRNA組:轉(zhuǎn)染靶向Cav-1基因的siRNA,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加精胺(2 mmol/L)或精胺(2 mmol/L)+Ca2+(2 mmol/L),按照下述方法檢測相應(yīng)指標(biāo)。

    2.3質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 (1)質(zhì)粒構(gòu)建:由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建pGCsi-U6/Neo/DsRed重組質(zhì)粒,該質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)了克隆的RNAi打靶序列100%正確。(2)轉(zhuǎn)染:待細(xì)胞生長至70%-90%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)分為:未轉(zhuǎn)染組即空白對照組(control組)、空質(zhì)粒組(vehicle組)和特異性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組即實(shí)驗(yàn)組(Cav-1shRNA組),按照LipofectamineTM2000操作說明書進(jìn)行。質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增和純化,制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,將該復(fù)合物與HUVECs混合,完成HUVECs轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24-48 h后,熒光顯微鏡下觀察到RFP,加入G418 (200 mg/L)進(jìn)行篩選,待未表達(dá)抗性基因的細(xì)胞被殺死后,將G418 改為100 mg/L維持1周。

    2.4Western blotting檢測HUVECs Cav-1和CaR蛋白表達(dá) 棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS沖洗后,加入裂解液,提取細(xì)胞漿蛋白和膜蛋白,BCA 試劑測定蛋白含量,電泳,半干轉(zhuǎn),然后封閉,分別加入Cav-1 (1∶1 000)和CaR (1∶500)的Ⅰ抗,孵育過夜。第2 d用TBST洗膜3次各20 min,加入相應(yīng)的Ⅱ抗 (1∶1 000)搖床上孵育1.5 h,TBST洗膜3次各20 min;ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,顯影定影處理,獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    2.5eNOS活性的測定 當(dāng)接種于96孔板的HUVECs達(dá)80%融合時(shí),把96孔板里的培養(yǎng)基吸盡后加入100 μL含有eNOS抑制劑的NOS的檢測緩沖液,輕輕搖勻。再加入100 mL檢測反應(yīng)液,輕輕搖勻。37 ℃孵育箱中孵育30 min。直接把96孔板放到多功能酶標(biāo)儀上,以沒有細(xì)胞的孔為空白對照,激發(fā)波長為495 nm,發(fā)射波長為515 nm。eNOS活性用eNOS相對熒光強(qiáng)度(relative fluorescence unit,RFU)表示,其計(jì)算公式如下:eNOS相對活性=RFU已刺激-RFU抑制劑+已刺激)/(RFU未刺激-RFU抑制劑+未刺激)。

    2.6NO含量的檢測 按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行,待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),按1∶2 000比例,用 DAF-FM DA熒光探針稀釋液稀釋DAF-FM DA,取200 μL稀釋后的DAF-FM DA,37 ℃孵育細(xì)胞15 min后,用HBS溶液反復(fù)沖洗。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡(Olympus XI70)上,以沒有細(xì)胞的孔為空白對照,同時(shí)用495 nm激發(fā)波長,515 nm發(fā)射波長,實(shí)時(shí)、逐時(shí)點(diǎn)檢測刺激前后熒光的強(qiáng)弱,并通過IPA Software進(jìn)行分析。NO含量用相對熒光強(qiáng)度RFU計(jì)算:NO含量=(測定孔曲線最高RFU -最低RFU)-(空白孔曲線最高RFU-最低RFU)。熒光強(qiáng)度應(yīng)用Image-Pro Plus 5.0分析。在胞外液是零鈣液時(shí)檢測,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不能維持到預(yù)定的檢測時(shí)間60 min,只能檢測20 min,這與Jung等[7]的研究血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)Ca2+內(nèi)流是釋放NO所必須的結(jié)果一致,因此圖中不含鈣離子的各組檢測時(shí)間為20 min。各組分別減去空白對照組(背景熒光)的NO熒光強(qiáng)度值后為NO凈熒光強(qiáng)度值,以此表示NO含量。

    3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    結(jié) 果

    1HUVECs的培養(yǎng)與鑒定

    原代細(xì)胞放入培養(yǎng)箱后12 h,在倒置顯微鏡下觀察融合的HUVECs呈典型的鋪路石或鵝卵石樣排列;對細(xì)胞內(nèi)Ⅷ因子進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,95%以上的細(xì)胞呈陽性著色,證實(shí)細(xì)胞為HUVECs(資料未顯示)。

    2小凹結(jié)構(gòu)破壞對HUVECs中Cav-1蛋白表達(dá)影響

    同一代HUVECs分為4組:即對照組(control)、不同濃度加藥組(1.5 mg/L、2 mg/L和2.5 mg/L filipin組),HUVECs經(jīng)不同濃度filipin處理6 h后提取HUVECs的漿蛋白,采用Western blotting檢測Cav-1蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示對照組、1.5 mg/L、2 mg/L及2.5 mg/L filipin組中Cav-1的蛋白含量相對值為1.56±0.01、1.53±0.01、1.49±0.01和1.57±0.02,各加藥組與對照組相比,無顯著差異(Pgt;0.05),見圖1。

    Figure 1.Effects of different concentrations of filipin on the expression of Cav-1 protein in HUVECs after 6-hour incubation±sE.n=3.

    3Cav-1干擾后HUVECs中Cav-1和CaR蛋白表達(dá)

    提取轉(zhuǎn)染48 h、用G418 (200 mg/L)進(jìn)行篩選7 d后HUVECs的漿蛋白和膜蛋白,與對照組比較,可見Cav-1 shRNA 組中Cav-1蛋白表達(dá)降低(抑制率為70%,Plt;0.05),vehicle 組Cav-1蛋白表達(dá)無明顯變化(Pgt;0.05)。同時(shí),Cav-1 shRNA 組中CaR的膜蛋白表達(dá)降低(抑制率為20%,Plt;0.05),CaR的漿蛋白表達(dá)無明顯變化(Pgt;0.05), vehicle 組CaR的膜蛋白和漿蛋白表達(dá)均無明顯變化(Pgt;0.05),見圖2。

    Figure 2.Effect of shRNA targeted to Cav-1 on Cav-1 and CaR protein expression in HUVECs detected by Western blotting±sE.n=3.△Plt; 0.05 vs control; #Plt; 0.05 vs vehicle.

    4不同處理因素刺激下HUVECs內(nèi)eNOS活性的變化

    各組HUVECs培養(yǎng)48 h后加處理因素檢測,與對照組相比,精胺組eNOS活性升高;與精胺組相比,精胺+Ca2+組eNOS活性進(jìn)一步升高(Plt;0.05),Calhex231 +精胺組eNOS活性降低(Plt;0.05),filipin+精胺組及Cav-1 shRNA+精胺組eNOS活性均無顯著差異(Pgt;0.05)。與精胺+ Ca2+組相比,Calhex231+精胺+Ca2+組、filipin+精胺+Ca2+組及Cav-1 shRNA+精胺+ Ca2+組eNOS活性均降低(Plt;0.05),而vehicle+精胺+Ca2+組eNOS活性無顯著差異(Pgt;0.05),見圖3。

    5不同處理因素刺激下HUVECs內(nèi)NO含量的變化

    與對照組相比,精胺組NO熒光強(qiáng)度值增加;與精胺組相比,精胺+Ca2+組NO熒光強(qiáng)度值進(jìn)一步增加(Plt;0.05), Calhex231+精胺組NO熒光強(qiáng)度值明顯降低(Plt;0.05),filipin+精胺組及Cav-1 shRNA+精胺組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度值無顯著差異(Pgt;0.05)。與精胺+Ca2+組相比,Calhex231+精胺+Ca2+組、filipin+精胺+Ca2+組及Cav-1 shRNA+精胺+Ca2+組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度值均明顯降低(Plt;0.05),而vehicle+精胺+Ca2+組細(xì)胞內(nèi)NO熒光強(qiáng)度值無顯著差異(Pgt;0.05),見圖4。

    Figure 3.The changes of eNOS activity in HUVECs with different treatments.±sE.n=6.*Plt;0.05 vs control group;△Plt;0.05 vs spermine group; #Plt;0.05 vs spermine+Ca2+group.

    Figure 4.The changes of NO content in HUVECs after different treatments.±sE.n=6.*Plt;0.05 vs control group; △Plt;0.05 vs spermine group; #Plt;0.05 vs spermine+Ca2+group.

    討 論

    隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)CaR激活有影響NO生成的作用。在培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤模型中發(fā)現(xiàn),當(dāng)CaR 激動劑細(xì)胞外Ca2+濃度升高時(shí),CaR激活上調(diào)iNOS mRNA和蛋白的表達(dá),并導(dǎo)致 NO生成增加,對nNOS和eNOS無影響,在此過程中細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i無變化[4]。Ziegelstein等[5]證實(shí)在人的主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中精胺激活CaR,經(jīng)PLC增加胞內(nèi)IP3使內(nèi)鈣釋放導(dǎo)致[Ca2+]i增加和NO生成。本研究以HUVECs為研究對象,結(jié)果發(fā)現(xiàn)精胺刺激下HUVECs內(nèi)eNOS的活性與NO含量增加,而CaR負(fù)性變購調(diào)節(jié)劑Calhex231處理完全阻斷了精胺介導(dǎo)的上述作用,充分證明HUVECs內(nèi)精胺刺激下HUVECs內(nèi)eNOS的活性與NO含量增加由CaR介導(dǎo)。此外,Koyama等[8]研究表明外Ca2+內(nèi)流是細(xì)胞內(nèi)NO合成的先決條件 ,CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流在eNOS的激活與NO生成中作用尚不清楚,故本研究亦在細(xì)胞外有鈣的情況下(作為外鈣來源,模擬CaR激活介導(dǎo)外鈣內(nèi)流),給予精胺刺激與單純精胺刺激相比,HUVECs內(nèi)eNOS的活性與NO含量進(jìn)一步增加,Calhex231只能部分阻斷此作用,這與我們前期按照上述同樣方式處理后HUVECs[Ca2+]i變化趨勢一致(資料已整理投稿)。該結(jié)果說明精胺激活CaR后引發(fā)胞內(nèi)鈣釋放和激活的外鈣內(nèi)流共同參與了上述過程,而在細(xì)胞外有鈣的情況下進(jìn)一步加強(qiáng)了精胺介導(dǎo)的上述效應(yīng),證實(shí)了在HUVECs中CaR激活介導(dǎo)持續(xù)Ca2+內(nèi)流亦是NO生成所必須的。我們的研究結(jié)果與上述在睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤模型中的研究結(jié)果相比提示:在不同組織細(xì)胞經(jīng)不同配體(Ca2+或精胺)激活CaR影響NO生成中的作用,激活了不同的NOS,對Ca2+依賴也有所不同。

    已有研究表明CaR作用機(jī)制主要由G蛋白α亞基介導(dǎo),但此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制作用并不能完全解釋CaR的生物學(xué)效應(yīng),與CaR相互作用蛋白賦予CaR獨(dú)特的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特征[6],作為eNOS負(fù)調(diào)控蛋白的Cav-1是與CaR相互作用的蛋白之一。然而,并非在所有組織細(xì)胞都存在CaR和Cav-1相互作用,即使同一種與CaR相互作用蛋白定位于不同的組織細(xì)胞其調(diào)節(jié)功能也不同,如在培養(yǎng)的人骨肉瘤細(xì)胞株(Saos-2)和甲狀旁腺細(xì)胞,CaR和Cav-1形成復(fù)合物并共定位于胞膜,在Saos-2,Cav-1可上調(diào)CaR激活引起的[Ca2+]i增加[7],而在甲狀旁腺細(xì)胞使用一種膽固醇結(jié)合劑filipin破壞Caveolae的結(jié)構(gòu)和功能,可阻斷CaR誘導(dǎo)的 ERK1/2激活[9]。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaR和Cav-1兩者共定位于HUVECs膜上,Cav-1對CaR介導(dǎo)的鈣內(nèi)流有下調(diào)作用,Cav-1對CaR介導(dǎo)的NO生成又有何種調(diào)節(jié)作用呢?結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caveolae結(jié)構(gòu)抑制劑filipin處理后對HUVECs中Cav-1蛋白沒有影響,卻抑制了有細(xì)胞外鈣的情況下精胺激活CaR引發(fā)的eNOS活性與NO含量增加,對單獨(dú)精胺刺激介導(dǎo)的上述效應(yīng)無影響。為進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果,實(shí)驗(yàn)中在保證RNAi特異性抑制Cav-1前提下,觀察到與filipin處理一致的結(jié)果。該結(jié)果證實(shí),在HUVECs,Cav-1對CaR經(jīng)外鈣內(nèi)流介導(dǎo)的eNOS激活和NO生成有促進(jìn)作用。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)Cav-1干擾后在Cav-1蛋白表達(dá)降低同時(shí)CaR膜蛋白表達(dá)也降低,CaR漿蛋白沒有變化,推測Cav-1可能充當(dāng)CaR膜定位及對激動劑反應(yīng)實(shí)現(xiàn)各種不同功能的重要伴侶蛋白,由于filipin處理及Cav-1干擾后HUVECs的小凹結(jié)構(gòu)破壞減少了CaR蛋白在膜上定位,使CaR對激動劑反應(yīng)降低,抑制了spermine刺激CaR介導(dǎo)的上述效應(yīng)。

    通過上述一系列實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)在HUVECs中CaR有通過增加[Ca2+]i使NO生成增加的作用,此過程由CaR激活介導(dǎo)內(nèi)鈣釋放、外鈣內(nèi)流共同參與,其中,外鈣內(nèi)流對促進(jìn)釋放NO生成尤為重要,Cav-1在CaR介導(dǎo)的NO生成過程中起著促進(jìn)作用。

    [1]Dudzinski DM,Michel T.Life history of eNOS: Partners and pathways[J].Cardiovasc Res,2007,75(2): 247-260.

    [2]Brown EM,Gamba G,Riccardi D,et al.Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid[J].Nature,1993,366(6455): 575- 580.

    [3]李光偉,邢文婧,郝靜輝,等.鈣敏感受體在缺氧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用[J].中國病理生理雜志,2010,26(12):2433-2437.

    [4]Tfelt-Hansen J,Ferreira A,Yano S,et al.Calcium-sensing receptor activation induces nitric oxide production in H-500 Leydig cancer cells[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2005,288(6):E1206- E1213.

    [5]Ziegelstein RC,Xiong Y,He C,et al.Expression of a functional extracellular calcium-sensing receptor in human aortic endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,342(1):153-163.

    [6]Huang C,Miller RT.The calcium-sensing receptor and its interacting proteins[J].J Cell Mol Med,2007,11(5):923-934.

    [7]Jung SY,Kwak JO,Kim HW,et al.Calcium sensing receptor forms complex with and is up-regulated by caveolin-1 in cultured human osteosarcoma(Saos-2)cells[J].Exp Mol Med,2005,37(2):91-100.

    [8]Koyama T,Kimura C,Park SJ,et al.Functional implications of Ca2+mobilizing properties for nitric oxide production in aortic endothelium[J].Life Sci,2002,72(4-5):511-520.

    [9]Kifor O,Kifor I,Moore FD Jr,et al.Decreased expression of caveolin-1 and altered regulation of mitogen-activated protein kinase in cultured bovine parathyroid cells and human parathyroid adenomas[J].J Clin Endocrinol Metab,2003,88(9):4455-4464.

    Roleofcaveolin-1inextracellularCa2+-sensingreceptor-mediatedNOgenerationinhumanumbilicalveinendothelialcells

    WANG Zhen-huan1,2,HU Qing-hua3,ZHONG Hua1,2,DENG Feng-mei1,2,CHEN Xiong-ying1,2,SUN Zhi-ping4,HE Fang1,2

    (1KeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases,MinistryofEducation,2DepartmentofPathophysiology,3CentreofMedicalFunctionalExperiments,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China;4DepartmentofPathophysiology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,KeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,HealthMinistryofChina,Wuhan430030,China.E-mail:fangf2002shz@126.com)

    AIM: To study the role of caveolin-1 (Cav-1) in extracellular Ca2+-sensing receptor (CaR)-induced production of nitric oxide (NO) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe expression ofCav-1 gene in HUVECs was silenced by transfection of constructed Cav-1 short hairpin RNA (Cav-1 shRNA) interference plasmids.The HUVECs in second or third passage were divided into 10 groups: control group,spermine group,spermine+Ca2+group,Calhex231+spermine group,Calhex231+spermine+Ca2+group,filipin+spermine group,filipin+spermine+Ca2+group,vehicle+spermine+Ca2+group,Cav-1 shRNA+spermine group and Cav-1 shRNA+spermine+Ca2+group.The protein levels of Cav-1 and CaR in HUVECs were detected by Western blotting after transfection.The production of NO and the activity of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) were determined using the fluorescent NO indicator,3-amino-4-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate (DAF-FM DA).RESULTSThe protein expression of Cav-1 in HUVECs was decreased after transfected withCav-1 shRNA.Simultaneously,the CaR membrane protein was decreased,whereas CaR protein level in the cytosol was unaffected.Whether in the culture medium with or without Ca2+,the CaR agonist spermine at concentration of 2 mmol/L resulted in an increase in the activity of eNOS and the production of NO in HUVECs.In the presence of spermine,the production of NO and activity of eNOS in HUVECs were abolished (without Ca2+) or decreased (with Ca2+) after inhibition of CaR by a negative allosteric modulator Calhex231 (1 μmol/L,Plt;0.05).In the presence of Ca2+,the effect of spermine on the increase in the activity of eNOS and the production of NO in HUVECs was also attenuated after acute caveolae disruption with filipin (1.5 mg/L) or transfected withCav-1 shRNA (Plt;0.05).CONCLUSIONCaR-mediated production of NO in HUVECs might be promoted by the binding of Cav-1 to CaR.The mechanism is involved in the effect of Cav-1 on the localization of CaR at the plasma membrane,thus changing the responsibility of CaR.

    Caveolin-1; Human umbilical vein endothelial cells; Receptors,calcium-sensing; Nitric oxide

    1000-4718(2011)05-0934-05

    R364.1+4

    A

    10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.019

    2010-08-20

    2011-03-14

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30860099)

    △通訊作者 Tel: 0993-2057151;E-mail:fangf2002shz@126.com

    猜你喜歡
    精胺內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)粒
    淺議角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    腹腔注射亞精胺對小鼠卵巢組織多胺含量及代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響
    雌激素治療保護(hù)去卵巢對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初步機(jī)制
    細(xì)胞微泡miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    外源精胺對斷奶仔豬血液精胺含量、臟器發(fā)育和生產(chǎn)性能的影響
    痰瘀與血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系研究
    午夜精品国产一区二区电影 | 不卡一级毛片| 日韩中字成人| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国内精品宾馆在线| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美丝袜亚洲另类| 免费av观看视频| 1000部很黄的大片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产淫片久久久久久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 搡老岳熟女国产| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av免费高清在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 特级一级黄色大片| 欧美又色又爽又黄视频| 我要搜黄色片| 中文字幕免费在线视频6| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 嫩草影院精品99| 国产成人aa在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 在线天堂最新版资源| 久久99热这里只有精品18| 欧美在线一区亚洲| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 美女免费视频网站| 欧美zozozo另类| 一级av片app| 久久久久免费精品人妻一区二区| 91av网一区二区| 我要搜黄色片| 中出人妻视频一区二区| 网址你懂的国产日韩在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最新中文字幕久久久久| 日本与韩国留学比较| 国产高潮美女av| 久久99热这里只有精品18| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产av一区在线观看免费| 色综合色国产| 久久久成人免费电影| 男女视频在线观看网站免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 看十八女毛片水多多多| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 国产乱人视频| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 成人三级黄色视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日本在线视频免费播放| 在线a可以看的网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 两个人视频免费观看高清| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 草草在线视频免费看| 日韩av在线大香蕉| 久久久a久久爽久久v久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美在线一区亚洲| 男女那种视频在线观看| 国产乱人视频| 一夜夜www| 男人狂女人下面高潮的视频| 网址你懂的国产日韩在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 美女内射精品一级片tv| 一本精品99久久精品77| 成人毛片a级毛片在线播放| 九色成人免费人妻av| 乱系列少妇在线播放| 波多野结衣巨乳人妻| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品精品国产色婷婷| 一进一出抽搐动态| 内射极品少妇av片p| 国产一区二区三区av在线 | 免费av毛片视频| 亚洲性久久影院| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产午夜福利久久久久久| 色在线成人网| 日韩欧美三级三区| 免费观看人在逋| 最近手机中文字幕大全| a级毛色黄片| 日韩大尺度精品在线看网址| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 中文亚洲av片在线观看爽| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 免费观看人在逋| 午夜激情福利司机影院| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美区成人在线视频| 日本 av在线| 丰满乱子伦码专区| 午夜福利视频1000在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 岛国在线免费视频观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 性色avwww在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美高清成人免费视频www| 插逼视频在线观看| 成人三级黄色视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费搜索国产男女视频| 少妇熟女欧美另类| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产激情偷乱视频一区二区| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲av五月六月丁香网| 免费无遮挡裸体视频| 日韩人妻高清精品专区| 一进一出好大好爽视频| av在线播放精品| 午夜爱爱视频在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品熟女少妇av免费看| 丰满的人妻完整版| 久久久精品欧美日韩精品| 久久国内精品自在自线图片| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 九九在线视频观看精品| 久久这里只有精品中国| 麻豆成人午夜福利视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲国产精品成人久久小说 | 精品人妻视频免费看| 91久久精品国产一区二区成人| 又爽又黄a免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成年女人永久免费观看视频| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美三级亚洲精品| 国产私拍福利视频在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 精品久久久久久久久久久久久| 国产探花极品一区二区| 久久亚洲精品不卡| 欧美色视频一区免费| 欧美日本视频| 免费电影在线观看免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 少妇的逼好多水| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产高清激情床上av| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲最大成人手机在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 色吧在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 看十八女毛片水多多多| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久久久九九精品二区国产| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费人成在线观看视频色| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线免费十八禁| 久久久久久久久久成人| 亚洲自偷自拍三级| 三级毛片av免费| 亚洲最大成人中文| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲最大成人中文| 露出奶头的视频| 亚洲图色成人| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久午夜福利片| 国产精品野战在线观看| 久久久久久伊人网av| 51国产日韩欧美| 亚洲经典国产精华液单| 深爱激情五月婷婷| 国产在线精品亚洲第一网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久99久视频精品免费| 日本熟妇午夜| 成人特级av手机在线观看| 精品日产1卡2卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 男女视频在线观看网站免费| 在线播放无遮挡| 一进一出好大好爽视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 成年女人看的毛片在线观看| 免费大片18禁| av在线亚洲专区| 日韩欧美精品v在线| 国产精华一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美成人精品欧美一级黄| 两个人的视频大全免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲成人中文字幕在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲色图av天堂| 九九热线精品视视频播放| 别揉我奶头 嗯啊视频| ponron亚洲| 一个人观看的视频www高清免费观看| 看片在线看免费视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 熟女人妻精品中文字幕| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩乱码在线| 人人妻人人看人人澡| 高清日韩中文字幕在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久热精品热| 国产精华一区二区三区| 亚洲专区国产一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲av成人av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 久久国内精品自在自线图片| 看十八女毛片水多多多| 最近视频中文字幕2019在线8| 99久久成人亚洲精品观看| 村上凉子中文字幕在线| 99热6这里只有精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品久久久噜噜| 少妇被粗大猛烈的视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜福利在线观看吧| av在线亚洲专区| 天堂√8在线中文| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品人妻视频免费看| 能在线免费观看的黄片| 成年女人看的毛片在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲性久久影院| 亚洲内射少妇av| 级片在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品伦人一区二区| 免费看a级黄色片| 成人无遮挡网站| 国产成人一区二区在线| 亚洲最大成人av| av在线老鸭窝| 一区福利在线观看| 免费看日本二区| 日韩一本色道免费dvd| 高清毛片免费观看视频网站| 波野结衣二区三区在线| 天美传媒精品一区二区| 成人精品一区二区免费| 精品午夜福利在线看| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久午夜福利片| 伦精品一区二区三区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产精品嫩草影院av在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 色综合色国产| 日本 av在线| 久久久久九九精品影院| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久亚洲精品不卡| 精品日产1卡2卡| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日韩亚洲欧美综合| 在线观看66精品国产| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 黄片wwwwww| 男插女下体视频免费在线播放| 黄色配什么色好看| 校园人妻丝袜中文字幕| 一个人看视频在线观看www免费| 亚州av有码| 欧美在线一区亚洲| 亚洲自拍偷在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费av观看视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产一区二区激情短视频| 99在线人妻在线中文字幕| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品女同一区二区软件| 成年女人毛片免费观看观看9| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 日韩欧美国产在线观看| 色吧在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av.av天堂| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲精品成人久久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 一本一本综合久久| 亚洲成人久久性| 男人的好看免费观看在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 色播亚洲综合网| 国产探花极品一区二区| 色哟哟·www| 男人狂女人下面高潮的视频| 网址你懂的国产日韩在线| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲av一区综合| 亚洲欧美精品综合久久99| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲国产精品合色在线| 日韩制服骚丝袜av| 最近的中文字幕免费完整| 日韩国内少妇激情av| 在线观看一区二区三区| 精品欧美国产一区二区三| 成人永久免费在线观看视频| 国产私拍福利视频在线观看| 久久精品夜色国产| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩欧美三级三区| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 永久网站在线| 超碰av人人做人人爽久久| 男女那种视频在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 最后的刺客免费高清国语| 日韩一区二区视频免费看| 精品国产三级普通话版| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 网址你懂的国产日韩在线| 丰满乱子伦码专区| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品在线观看二区| 高清毛片免费看| 成人特级黄色片久久久久久久| 变态另类丝袜制服| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看66精品国产| 亚洲熟妇熟女久久| 内地一区二区视频在线| 国产高潮美女av| 男女视频在线观看网站免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 搡老岳熟女国产| 最近在线观看免费完整版| 少妇熟女aⅴ在线视频| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲人成网站高清观看| 精品人妻视频免费看| 国内精品宾馆在线| 婷婷精品国产亚洲av| 波多野结衣高清作品| 国产av不卡久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 黄色日韩在线| 亚洲av熟女| 久久亚洲国产成人精品v| 丰满乱子伦码专区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产v大片淫在线免费观看| 国产av在哪里看| 最近在线观看免费完整版| 亚洲成人av在线免费| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久久中文| 长腿黑丝高跟| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日本在线视频免费播放| 精品国产三级普通话版| 中出人妻视频一区二区| 无遮挡黄片免费观看| 韩国av在线不卡| 日韩精品青青久久久久久| 最近在线观看免费完整版| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲七黄色美女视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品久久久久久久电影| 日本免费a在线| 美女被艹到高潮喷水动态| 热99在线观看视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 身体一侧抽搐| 久久韩国三级中文字幕| 欧美高清成人免费视频www| 国产成年人精品一区二区| 亚洲人成网站在线播| 免费看a级黄色片| 美女cb高潮喷水在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品三级大全| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美bdsm另类| 国产中年淑女户外野战色| 色哟哟哟哟哟哟| 男插女下体视频免费在线播放| 三级国产精品欧美在线观看| 99热全是精品| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲图色成人| АⅤ资源中文在线天堂| 色5月婷婷丁香| 91在线精品国自产拍蜜月| 网址你懂的国产日韩在线| 99久久精品国产国产毛片| 国产乱人视频| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久久久大av| 免费观看精品视频网站| 欧美一区二区亚洲| 一级黄色大片毛片| 能在线免费观看的黄片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线播放国产精品三级| 99久久精品国产国产毛片| 色哟哟哟哟哟哟| 久久精品国产亚洲网站| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 美女黄网站色视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | videossex国产| 国内精品美女久久久久久| 少妇熟女欧美另类| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲不卡免费看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 婷婷六月久久综合丁香| 联通29元200g的流量卡| 一个人免费在线观看电影| 欧美最新免费一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 亚洲精品成人久久久久久| 国产综合懂色| 露出奶头的视频| 色综合色国产| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲七黄色美女视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产成人aa在线观看| 精品人妻视频免费看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久久久国产a免费观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 一级毛片我不卡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费黄网站久久成人精品| 长腿黑丝高跟| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品久久久久久久久免| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美潮喷喷水| 日本a在线网址| 一级黄色大片毛片| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久综合国产亚洲精品| 波野结衣二区三区在线| 人妻少妇偷人精品九色| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲不卡免费看| 黑人高潮一二区| 国产av麻豆久久久久久久| 岛国在线免费视频观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 99久国产av精品国产电影| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲18禁久久av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲欧美清纯卡通| av在线观看视频网站免费| 久久久久久久久久久丰满| 色吧在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中国美女看黄片| 久久精品人妻少妇| 高清毛片免费看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲经典国产精华液单| 午夜激情福利司机影院| 免费av毛片视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 最后的刺客免费高清国语| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品1区2区在线观看.| 乱系列少妇在线播放| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 青春草视频在线免费观看| 天美传媒精品一区二区| av在线蜜桃| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久精品影院6| 国内精品一区二区在线观看| 国产真实乱freesex| 国产不卡一卡二| 看片在线看免费视频| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲av中文av极速乱| av黄色大香蕉| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费看av在线观看网站| 精品午夜福利在线看| 国内精品一区二区在线观看| 能在线免费观看的黄片| 日韩制服骚丝袜av| 日韩在线高清观看一区二区三区| 午夜免费激情av| 国产三级在线视频| 国产色婷婷99| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产三级中文精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 我要搜黄色片| 成人av一区二区三区在线看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 最近视频中文字幕2019在线8| 熟女电影av网| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 五月玫瑰六月丁香| 黄色一级大片看看| 亚洲人与动物交配视频| 日韩制服骚丝袜av| 国产成人一区二区在线| 老司机影院成人| 黄片wwwwww| 久久久a久久爽久久v久久| 成年女人永久免费观看视频| 联通29元200g的流量卡| 婷婷亚洲欧美| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产成人freesex在线 | 99久久成人亚洲精品观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 丝袜美腿在线中文| av.在线天堂| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲自拍偷在线| 日本三级黄在线观看| 亚洲av免费在线观看| 麻豆一二三区av精品| 综合色丁香网| 欧美日韩综合久久久久久| 国产人妻一区二区三区在| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美另类亚洲清纯唯美| 黑人高潮一二区| 日韩欧美在线乱码| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 精品熟女少妇av免费看| 免费在线观看成人毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产毛片a区久久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 嫩草影视91久久| 99久国产av精品| 久久中文看片网| 尾随美女入室| 成人性生交大片免费视频hd| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 麻豆成人午夜福利视频|