硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細胞乙酰肝素酶表達及遷移能力的影響*

鄭 冬， 袁 梅， 李 娟， 谷景立， 盧 博， 劉俊茹， 黃蓓暉

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細胞乙酰肝素酶表達及遷移能力的影響*

鄭 冬△， 袁 梅， 李 娟， 谷景立， 盧 博， 劉俊茹， 黃蓓暉

(中山大學附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

目的： 研究硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266的乙酰肝素酶(HPA)表達及遷移能力的影響，并探討其作用機制。方法體外培養(yǎng)U266細胞，以不同濃度的硼替佐米進行處理，采用CCK-8檢測細胞活力，用RT-PCR方法檢測HPA mRNA水平的變化，用Western blotting方法檢測HPA蛋白及IκB表達水平的變化，以Transwell方法檢測細胞遷移能力的變化。結果U266細胞表達HPA，以0、3.125、12.5及50 nmol/L濃度的硼替佐米處理U266細胞48 h，HPA mRNA及蛋白的表達逐漸減少(Plt;0.01)，而細胞遷移能力逐漸減弱(Plt;0.01)。同時，HPA的蛋白表達水平與IκB的表達水平呈負相關(Plt;0.01)。結論硼替佐米通過抑制HPA的表達抑制骨髓瘤細胞的遷移能力，其機制可能是通過NF-κB信號途徑進行調(diào)控的。

硼替佐米； 多發(fā)性骨髓瘤； 乙酰肝素酶； 細胞遷移

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細胞增殖性疾病，在血液腫瘤性疾病中占10％。新藥硼替佐米近年來在MM的治療取得了重大突破，使骨髓瘤患者的療效有了明顯改善[1]。已知曉乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是一種與腫瘤細胞生長及轉(zhuǎn)移密切相關的葡萄糖醛酸酯酶[2]，研究發(fā)現(xiàn)，HPA在MM的患者中呈現(xiàn)高表達，且表達水平與患者預后密切相關[3-5]。硼替佐米是否同樣能影響骨髓瘤細胞HPA的表達，進而減弱其遷移能力，從而抑制骨髓瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，尚有待進一步研究。本研究探討了硼替佐米對骨髓瘤細胞株U266的HPA表達及遷移能力的影響，期望發(fā)現(xiàn)硼替佐米作用于骨髓瘤細胞的新途徑。

材 料 和 方 法

1細胞和試劑

人MM細胞系U266由第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所，Trizol 試劑購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq 酶購自Toyobo公司，PCR 引物由TaKaRa公司合成，HPA兔抗人多克隆抗體及IκB兔抗人多克隆抗體購自Santa Cruz，GAPDH兔抗人單克隆抗體及羊抗IgG/HRPⅡ抗購自博奧申公司，Transwell板(8 μm孔徑)購于Corning。

2細胞培養(yǎng)

用含10％的胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

3藥物干預

硼替佐米粉劑溶解于生理鹽水中，將其濃度配置為100 μmol/L(母液)，使用RPMI-1640培養(yǎng)基將其稀釋成終濃度為：3.125、6.25、12.5、25、50 nmol/L，未加入硼替佐米藥物的即為對照組，每個實驗濃度組各設3個復孔。每次實驗重復3次。

4CCK-8檢測細胞活力

將收集的細胞稀釋為6×107cells/L，分別接種50 μL于96孔板中，3×104cells/well，每孔分別加入配置好的不同濃度的硼替佐米(0、3.125、6.25、12.5、25、50 nmol/L) 50 μL，將孔板置于5％CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中作用不同時間(12、24、36、48、60 h)。將處理好的細胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，最后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。

5RT-PCR檢測HPAmRNA

細胞檢測前的藥物干預方法同上，只是將培養(yǎng)板改換為6孔板，接種5×106個細胞。HPA上游引物： 5′-GAATGGCCCTACCAGGAGCA -3′，下游引物5′-AACGCATTTAGGCCAAAGATCAAG-3′,擴增產(chǎn)物為145 bp；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3′,下游引物5′- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3′，擴增產(chǎn)物為138 bp。

總RNA的提取按RNA提取試劑盒說明書進行。經(jīng)紫外分光光度計測定其260 nm和280 nm處吸光度(A)值，選取A260/A280比值為1.8-2.0者，以A計算出濃度。反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書合成cDNA。PCR反應條件如下：94 ℃預變性2 min；96 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，進行35個循環(huán)(內(nèi)參照GAPDH只進行了30個循環(huán))；72 ℃延長7 min。反應體系為25 μL。取PCR擴增產(chǎn)物5 μL上樣于1.5 ％瓊脂糖(含0.5 g/L的溴化乙錠)，于100 V電壓下電泳25 min，然后將凝膠放入凝膠電泳成像儀，在紫外光下觀察結果并行灰度分析。

6Westernbloting檢測HPA及IκB蛋白的表達

提取總蛋白前的細胞藥物干預與提取RNA前處理一致，加入RIPA裂解液及使用超聲細胞破碎儀裂解細胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)測定蛋白濃度后，定量，變性。選擇9 ％的分離膠及3.75％的濃縮膠，上樣、電泳后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用含5％脫脂奶的1×TBST室溫封閉膜1 h，加入HPAⅠ抗(1∶600)，4 ℃孵育過夜，搖床輕搖，第2 d洗膜，然后加入Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光液反應數(shù)分鐘，使用Kodak 膠卷壓片，曝光，顯影，定影。然后將膜取出，用Stripping Buffer(Pierce)洗脫后重復上述封閉步驟，加入IκBⅠ抗(1∶800)，后同上顯影后，再加入內(nèi)參照GAPDH(1∶2 500)，顯影。用Quantity One(Bio-Rad)進行灰度分析。

7Transwell細胞體外遷移實驗

遷移實驗用24孔Transwell板，其孔徑為8 μm。照前述用不同濃度的硼替佐米(3.125、12.5、50 nmol/L)作用細胞40 h后用于實驗。調(diào)整細胞密度為1×109cells/L，Transwell細胞培養(yǎng)板上室中加入200 μL U266細胞懸液，下室中加入含有趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)和不同濃度的硼替佐米600 μL，RPMI-1640培養(yǎng)液作用細胞為對照，細胞在5％CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，用細胞收集器仔細收集由上室進入下室的U266細胞，然后使用CCK-8試劑盒進行細胞計數(shù)。

8統(tǒng)計學處理

結 果

1U266細胞中HPA的表達情況

在未給予任何干預處理下，HPA mRNA及蛋白在骨髓瘤細胞株U266的表達見圖1。

2硼替佐米對U266細胞活性的影響

硼替佐米可抑制U266細胞生長，且呈時間和劑量依賴關系，如圖2，硼替佐米作用U266細胞48 h后IC50為8.853 nmol/L。

Figure 1.The expression of HPA mRNA and protein in U266 cells detected by RT-PCR(A) and Western blotting(B),respectively.M:marker;Lane 1-3 :U266 cells.

Figure 2.Cell viability of U266 cells after treated with different concentrations of bortezomib detected by CCK-8 .±s.n=3.

3硼替佐米對HPAmRNA表達水平的影響

由圖3可以看出，隨著硼替佐米藥物濃度的增加，U266細胞內(nèi)HPA mRNA表達量逐漸減少(均Plt;0.01)。

4硼替佐米對HPA和IκB蛋白表達水平的影響

由圖4可以看出，隨著硼替佐米藥物濃度的增加，IκB蛋白的表達水平逐步增加，而HPA蛋白表達量逐漸減少。經(jīng)Pearson相關性分析顯示，HPA蛋白的表達水平與IκB蛋白的表達水平呈負相關(r=-0.904，Plt;0.01)。

5硼替佐米對U266細胞遷移能力的影響

由于Transwell下室中加入了含趨化因子的胎牛血清，故細胞在趨化因子的作用下由上室遷移至下室，因硼替佐米的作用濃度不同，最終進入下室的U266細胞數(shù)不同。隨著硼替佐米藥物濃度的增加(0、3.125、12.5、50 nmol/L)，遷移入下室的U266細胞數(shù)逐漸減少，進入下室的細胞分別為：(1.350±0.079)×104個、(1.230±0.088)×104個、(0.830±0.068)×104個、(0.630±0.096)×104個，經(jīng)方差分析顯示，通過不同濃度的硼替佐米處理過的U266細胞，其遷移能力在總體上是有差異的(Plt;0.05)。經(jīng)Pearson相關分析顯示，HPA的表達與U266細胞遷移能力呈負相關(r=0.85，Plt;0.01)。

Figure 3.The expression of HPA mRNA in U266 cells treated with different concentrations of bortezomib for 48 h detected by RT-PCR.M:marker;lane 1-4:0,3.125,12.5 and 50 nmol/L bortezomib,respectively.±s.n=3.**Plt;0.01 vs lane 1.

Figure 4. The expression of HPA and IκB proteins in U266 cells treated with different concentrations of bortezomib for 48 h detected by Western blotting.Lane 1-4:0,3.125,12.5 and 50 nmol/L bortezomib,respectively±s.n=3.**Plt;0.01 vs lane 1.

討 論

MM是漿細胞克隆性增殖的惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，隨著對MM發(fā)病機制的研究進展，發(fā)現(xiàn)了許多新藥抗MM侵襲和轉(zhuǎn)移，同時也發(fā)現(xiàn)了通過抑制某些因子或轉(zhuǎn)導通路可降低MM細胞的遷移。

HPA是一種內(nèi)切糖苷酶，為內(nèi)源性β葡萄醛酸酯酶，通過對硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulphate proteoglycans，HSPG)的特異性降解，改變細胞外基質(zhì)的結構，促使各種炎癥細胞及腫瘤細胞的游走轉(zhuǎn)移，同時釋放多個具有生物學活性的硫酸乙酰肝素鏈(heparan sulfate，HS)片段以及與HS結合的各種生長因子及細胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β，從而促進血管的生成[2]。目前已證實，與正常組織相比，腫瘤組織優(yōu)先表達HPA，并且與許多腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關，影響著腫瘤的預后[6-8]。在MM中，Kelly等[3]及Mahtouk等[4]發(fā)現(xiàn)HPA在MM患者骨髓中呈現(xiàn)高表達，Yang等[5]發(fā)現(xiàn)HPA基因轉(zhuǎn)染的MM細胞的增殖和侵襲力上升，皮下注射可轉(zhuǎn)移至脾、肝、肺和骨，骨內(nèi)注射選擇性地轉(zhuǎn)移至其它骨頭。

硼替佐米是首個應用于臨床治療難治復發(fā)MM的蛋白酶體抑制劑[9]，通過抑制蛋白酶體26S亞基的活性，減少NF-κB的抑制因子(IκB)的降解，阻斷NF-κB信號途徑，從而抑制骨髓瘤細胞增殖及減少生長因子的分泌和黏附因子的表達，達到治療的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，MM細胞株U266表達HPA，并隨著硼替佐米藥物濃度的增加，HPA mRNA及蛋白表達水平逐漸減少，MM細胞的遷移能力逐步減弱，HPA的表達水平與MM細胞的遷移能力密切相關。

因此，我們推測硼替佐米減弱MM細胞遷移的能力，其作用途徑之一是通過調(diào)節(jié)HPA的表達水平來實現(xiàn)的。HPA表達水平的減低可減少激活及釋放細胞因子，也可減少可溶性CD138的形成。而可溶性CD138被認為是促進骨髓瘤細胞的生長及侵襲轉(zhuǎn)移的物質(zhì)[10,11]，并能促進基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達[12]。由此推測，HPA表達水平的減低，減弱了骨髓瘤細胞的游走能力，增強了黏附性，從而降低了骨髓瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，硼替佐米抑制MM細胞HPA的表達，其中HPA蛋白的表達水平與IκB的表達水平呈負相關。是否NF-κB信號途徑的阻斷抑制了HPA 的轉(zhuǎn)錄，進而影響蛋白翻譯，尚需進一步研究。但Andela等[13]通過轉(zhuǎn)染無磷酸化功能的IκB載體入小鼠肺泡細胞，阻斷NF-κB信號通路，可下調(diào)HPA、MMP-9等促轉(zhuǎn)移蛋白物質(zhì)的表達?？傊壳皩τ贖PA的直接調(diào)控機制仍需進一步探討。

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Effectofbortezomibonheparanaseexpressionandmigrationabilityofmultiplemyelomacells

ZHENG Dong,YUAN Mei,LI Juan,GU Jing-li,LU Bo,LIU Jun-ru,HUANG Bei-hui

(DepartmentofHematology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zcxzd@tom.com)

AIM: To study the effects of bortezomib on heparanase (HPA) expression and migration ability of multiple myeloma cell line U266.METHODSThe U266 cells were cultured with different concentrations of bortezomibinvitro.CCK-8 assay was used to determine the cell viability.The mRNA expression of HPA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The protein levels of HPA and IκB were determined by Western blotting.The migration ability of the cells was investigated by Transwell assay.RESULTSHPA was expressed in U266 cells.After treated with bortezomib at the concentrations of 0,3.125,and 12.5 and 50.0 nmol/L for 48 h,the expression of HPA at mRNA and protein levels was gradually reduced (Plt;0.01),and the migration ability of U266 cells was also gradually decreased (Plt;0.01).At the same time,the level of IκB expression negatively correlated with that of HPA expression (Plt;0.01).CONCLUSIONBortezomib inhibits the migration ability of multiple myeloma cell line U266 by suppressing the HPA expression through NF-κB signaling pathway.

Bortezomib; Multiple myeloma; Heparanase; Cell migration

1000-4718(2011)05-0865-04

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.007

2011-03-10

2011-04-28

廣東省科技計劃資助項目(No.2005B30301006)

△通訊作者 Tel：020-87755766-8831;E-mail：zcxzd@tom.com