丁苯酞對缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和 HIF-1α表達(dá)的影響*

殷建瑞, 張 波, 譚麗華, 傅 賢, 魏 歡, 李 玲

(1廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 510260； 2昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510080)

丁苯酞對缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF和 HIF-1α表達(dá)的影響*

殷建瑞1, 張 波1, 譚麗華1, 傅 賢1, 魏 歡2, 李 玲3△

(1廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,廣東 廣州 510260；2昆明市延安醫(yī)院，云南 昆明 650051；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，廣東 廣州 510080)

目的探討丁苯酞(NBP)保護(hù)缺氧缺糖(OGD)細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)予以O(shè)GD損傷，MTT法檢測細(xì)胞活性；Hoechst 33342染色檢測細(xì)胞核形態(tài)；免疫熒光法觀察血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)，IPP軟件分析熒光強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析;Western blotting檢測加以驗(yàn)證。結(jié)果NBP在0.01- 10 μmol/L濃度之間劑量依賴性減少了OGD導(dǎo)致的細(xì)胞活性下降和細(xì)胞核形態(tài)改變。NBP促進(jìn)了OGD后HUVECs內(nèi)VEGF和HIF-1α的表達(dá)，均高于OGD組，熒光定量分析差異顯著。兩者表達(dá)的高峰分別為OGD后6 h和8 h。結(jié)論NBP可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧缺糖條件下HIF-1α的表達(dá)，從而引起下游VEGF的表達(dá)增多，最終保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧缺糖損傷。

丁苯酞; 血管內(nèi)皮細(xì)胞; 缺氧缺糖; 血管內(nèi)皮生長因子; 缺氧誘導(dǎo)因子-1

左旋丁基苯酞又名芹菜甲素，是從芹菜種籽中分離出的有效成分，根據(jù)它的結(jié)構(gòu)式，其異構(gòu)體右旋丁基苯酞被合成出來。之后它們的混合物消旋丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)作為臨床藥物被發(fā)展起來，也稱為丁苯酞[1]。 大量的研究證實(shí)NBP在治療腦卒中和其它一些疾病中具有良好效果，而且發(fā)現(xiàn)其可能通過多種途徑發(fā)揮保護(hù)作用，如改善供血、保護(hù)血腦屏障、抗血栓形成、抗炎癥、改善線粒體功能失調(diào)等[2-4]。然而，NBP發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制并非完全清楚。闡明NBP對細(xì)胞的具體保護(hù)機(jī)制，可以對NBP進(jìn)行改進(jìn)和發(fā)展，使此藥能夠更加有效地發(fā)揮保護(hù)作用。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)(購自上海晶賽公司)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、90%濕度、含 5% CO2和 95% 空氣(V/V) 的培養(yǎng)箱中。

NBP(石家莊恩必普藥業(yè)有限公司贈(zèng)送,99.9%臨用前使用溶劑DMSO)溶解，再使用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。NBP的最終濃度為0.01、0.1、1、10、100 μmol/L。在溶劑對照組中只單獨(dú)加入溶劑。

2缺氧缺糖(oxygen-glucosedeprivation,OGD)細(xì)胞模型

將內(nèi)皮細(xì)胞種植于各種規(guī)格的培養(yǎng)皿，先培養(yǎng)24 h。在NBP處理組將培養(yǎng)液換成含有不同濃度NBP的無糖DMEM培養(yǎng)液(其中含0.2%DMSO)，在溶劑處理組換為僅含有0.2%DMSO的無糖DMEM培養(yǎng)液，再培養(yǎng)30 min。之后細(xì)胞被放置于持續(xù)充以95%N2+ 5%CO2混合氣體的密封低氧槽中，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)所需，在37 ℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育所需時(shí)間。 當(dāng)OGD結(jié)束，在移入正常氧壓條件前，將培養(yǎng)液換成含有相同濃度NBP或者DMSO的正常培養(yǎng)基。在正常對照組，細(xì)胞接受除了無糖培養(yǎng)基或者缺氧處理之外的所有實(shí)驗(yàn)操作步驟。

3細(xì)胞活性測定

依照測試盒中廠家提供的說明書來測定細(xì)胞活性。在OGD結(jié)束時(shí)，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入100 μL 0.5 g/L MTT，置于37 ℃、90%濕度、含 5% CO2和 95% 空氣(V/V)的培養(yǎng)箱中4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄培養(yǎng)液，每個(gè)孔中加入100 μL溶媒。最后，在酶聯(lián)免疫儀上，570 nm波長測定各孔吸光度值(A570)。由于只有活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為難溶性藍(lán)紫色結(jié)晶物，故各孔A570的變化可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。所有結(jié)果來自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)中設(shè)3個(gè)平行組。

4Hoechst染色

使用Hoechst 33342對OGD后HUVECs進(jìn)行染色，以檢測OGD后細(xì)胞核形態(tài)的變化。在4孔板中培育細(xì)胞，直至生長融合85%左右，在暴露于OGD后，每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1 μL Hoechst 33342(5 g/L，Sigma)和1 mL的培養(yǎng)基，培育30 min。使用PBS溶液對染色細(xì)胞沖洗2次，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。為定量分析細(xì)胞核形態(tài)變化，具有異常胞核的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)被計(jì)數(shù)。在10幅隨機(jī)挑選的40倍放大顯微鏡視野中的所有細(xì)胞均被計(jì)數(shù)。所有結(jié)果來自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)中設(shè)3個(gè)平行組。

5免疫熒光

將生長于蓋玻片上的HUVECs使用新鮮配制的4%多聚甲醛(pH 7.4)固定20min，PBS洗凈，使用含1% Triton X-100的PBS破膜30 min，PBS洗凈。含5%驢血清的PBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)30 min，使用以下的Ⅰ抗孵育細(xì)胞1 h：兔來源抗內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體(chemicon)，老鼠抗缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)抗體(Abcam)，(所有Ⅰ抗均使用3%BSA/PBS 按1∶500稀釋)這些結(jié)合的Ⅰ抗通過與FITC標(biāo)記的驢抗兔Ⅱ抗和TR標(biāo)記的驢抗鼠Ⅱ抗孵育后進(jìn)行檢測(所有Ⅱ抗均使用3%BSA/PBS 按1∶1 000稀釋)。PBS沖洗干凈后，所有玻片均通過倒置顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。所有的熒光圖片均在同樣的曝光條件下進(jìn)行拍攝。為進(jìn)行核計(jì)數(shù)染色，所有的細(xì)胞均在染色后使用10 g/L DAPI孵育10 min。使用IPP軟件分析熒光強(qiáng)度。所有結(jié)果來自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)中設(shè)3個(gè)平行組。

6免疫印跡(Westernblotting)檢測VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)

處理后的細(xì)胞使用PBS洗凈，使用含PMSF的細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，13 000×g離心10 min(4 ℃)，收集上清。按照說明以BCA-100蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%積層膠和8%分離膠進(jìn)行跑膠，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，含5%脫脂牛奶的TBS-T封閉1 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。TBS-T洗凈，Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，TBS-T洗凈。使用超敏反應(yīng)盒進(jìn)行曝光、拍片。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1NBP劑量依賴性地減少了OGD導(dǎo)致的細(xì)胞損傷

通過MTT法和觀察細(xì)胞核形態(tài)來評(píng)估細(xì)胞活性。與溶劑對照組相比，在0.01-100 μmol/L濃度之間NBP并不影響HUVECs的細(xì)胞活性。OGD處理8 h后，溶劑處理組的相對MTT值是50%，而10 μmol/L NBP組大約為80%，見圖1。在0.01-10 μmol/L濃度之間，NBP劑量依賴性地抑制了OGD導(dǎo)致的MTT值下降，見圖1。然而10 μmol/L與 100 μmol/L之間的作用無顯著差異，說明當(dāng)NBP的濃度達(dá)到10μmol/L時(shí)已經(jīng)是作用的飽和濃度，超過10 μmol/L的濃度不會(huì)提高其保護(hù)效果。

Figure 1. NBP significantly prevents OGD-induced decrease of viability of HUVECs in a dose-dependent manner. s.n=5.*Plt; 0.05 vs normal control; #Plt;0.05 vs OGD+vehicle.

在細(xì)胞核形態(tài)學(xué)分析中，我們也觀察到了同樣的結(jié)果。在OGD處理后出現(xiàn)了核皺縮和核聚集等形態(tài)學(xué)變化，而這種形態(tài)變化在正常細(xì)胞中基本是未見的。我們使用NBP預(yù)處理后，顯著減少了這種形態(tài)學(xué)變化，見圖2。

2NBP對OGD作用后VEGF表達(dá)的影響

在正常培養(yǎng)條件下，免疫熒光幾乎檢測不到HUVECs內(nèi)VEGF的表達(dá)，但經(jīng)過OGD處理8 h后HUVECs的VEGF表達(dá)量明顯升高，主要在細(xì)胞胞漿中表達(dá)，較均勻分布。在OGD+NBP組中，細(xì)胞內(nèi)VEGF生成的量得到更進(jìn)一步的升高，熒光強(qiáng)度更高，且有表達(dá)聚集的現(xiàn)象，見圖3。使用IPP圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，可確定3組間的VEGF表達(dá)具有明顯差異，見圖3。 Western blotting可以觀察到相同的蛋白表達(dá)趨勢，見圖3。

Figure 2. NBP significantly prevents OGD-induced changes of nuclear morphology in cultured HUVECs(Hoechst 33342 staining,×200). There were visible crenation of nuclei (B1,×600) and condensation of chromatin (B2,×600) in HUVECs after OGDtreatment(marked with arrows, B), which were less visible in control cells (A) and obviously improved in the cells pretreated with NBP (10 μmol/L) (C). ±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control; #Plt;0.05 vs OGD +vehicle.

Figure 3. NBP enhances OGD-induced expression of VEGF.A:digital photomicrograph under fluorescent illumination showed the expression of VEGF was mainly in the cytoplasm(×400). B:bar graph showing the average quantitative optical density of VEGF obtained through IPP analysis. The VEGF level was indicated by the value of optical density over the area with fluorescent. C:Western blotting detected the same results. ±s.n=5 *Plt;0.05 vs normal control; #Plt; 0.05 vs OGD +vehicle.

3NBP促進(jìn)了OGD導(dǎo)致的HIF-1α表達(dá)和其在核內(nèi)的聚集

在正常的培養(yǎng)條件下，幾乎檢測不到HUVECs內(nèi)HIF-1α的表達(dá)，OGD處理6 h后, HUVECs核內(nèi)的HIF-1α表達(dá)明顯增高。在OGD+NBP組中，HIF-1α的免疫熒光強(qiáng)度較單獨(dú)的OGD處理明顯增加，而且聚集在細(xì)胞核的位置，見圖4。使用IPP圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，可確定3組間的HIF-1α表達(dá)差異顯著，見圖4。Western blotting可以觀察到相同的蛋白表達(dá)趨勢,見圖4。

Figure 4. NBP enhances OGD-induced expression of HIF-1α. A:digital photomicrograph under fluorescent illumination showed the expression of HIF-1α was overlapped with the stain of nuclei (×400). B:bar graph showing the average quantitative optical density of HIF-1α obtained through IPP analysis. The HIF-1α level was indicated by the value of optical density over the area with fluorescent.C:Western blotting detected the same results. ±s.n=5.*Plt;0.05 vs normal control;#Plt;0.05 vs OGD +vehicle.

討 論

大量的研究報(bào)道了NBP的積極保護(hù)作用[2,6]。在本研究中，我們同樣觀察到NBP對缺氧缺糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。雖然發(fā)現(xiàn)了如此多的保護(hù)作用，但這些結(jié)果僅僅揭示了表面現(xiàn)象，我們對于NBP保護(hù)缺血腦組織的確切機(jī)制并不清楚。

血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管再生和血管形態(tài)、功能維持中具有重要地位。我們既往的研究發(fā)現(xiàn) NBP可以通過增加腦內(nèi)微血管數(shù)目和逆轉(zhuǎn)其結(jié)構(gòu)改變，從而達(dá)到有效減少寒潮時(shí)雙腎雙夾高血壓大鼠模型(stroke-prone renovascular hypertensive rats ，RHRSP)腦卒中發(fā)生及減輕腦損害[5]。研究結(jié)果提示NBP可能作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到預(yù)防腦卒中發(fā)生的作用，這為我們探索NBP保護(hù)作用的具體機(jī)制提供了線索。之后發(fā)表的相關(guān)研究[7]報(bào)道NBP可以促進(jìn)局灶缺血腦組織和短暫缺血腦組織中VEGF的表達(dá)，VEGF是一種促進(jìn)血管形成和分化的重要調(diào)節(jié)因子，同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)特性[8]。綜合分析發(fā)表的研究，我們推測NBP可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)血管再生，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

VEGF蛋白既可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可表達(dá)于多種神經(jīng)組織細(xì)胞[9]，之前的研究并未闡明NBP主要是促進(jìn)何種細(xì)胞大量表達(dá)VEGF。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)NBP可以促進(jìn)OGD條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。與正常氧壓條件相比較，OGD促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中VEGF的表達(dá)，經(jīng)過NBP處理后，VEGF的總量得到進(jìn)一步提高。這一結(jié)果與既往大鼠體內(nèi)研究是一致的[7]，同時(shí)也揭示了NBP可以直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)VEGF，從而發(fā)揮自分泌作用。

VEGF表達(dá)的上游受到多種因子調(diào)節(jié)，為更深入闡明NBP的作用機(jī)制，我們進(jìn)一步探討了NBP促進(jìn)VEGF表達(dá)的上游通路。既往研究表明在缺氧條件下HIF-1α可促進(jìn)血管的再生[10]，而HIF-1α也可作為調(diào)節(jié)因子促進(jìn)下游VEGF的表達(dá)[11]。本研究中我們探討了NBP是否可以通過上調(diào)HIF-1α從而達(dá)到促進(jìn)VEGF的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺氧條件下HIF-1α的表達(dá)增多而且在細(xì)胞核內(nèi)聚集，NBP可進(jìn)一步促進(jìn)這種變化。這一結(jié)果與我們觀察到的NBP促進(jìn)缺氧條件下VEGF變化趨勢是一致的?；贖IF-1α對VEGF表達(dá)的重要調(diào)節(jié)作用，我們推測NBP通過上調(diào)HIF-1α，從而最終促進(jìn)了VEGF的表達(dá)，兩者表達(dá)的最高峰分別出現(xiàn)在OGD后6h和8h，也支持HIF-1α是NBP促進(jìn)VEGF表達(dá)的重要上游通路。

NBP不僅促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α、VEGF的表達(dá)，也提高了血管內(nèi)皮細(xì)胞對缺氧的耐受性，增加了缺氧條件下細(xì)胞的存活。既往研究表明在多種損傷條件下，HIF-1α在保護(hù)細(xì)胞存活中發(fā)揮著重要作用[12]。同時(shí)VEGF對細(xì)胞也具有良好的保護(hù)作用[13]。所以NBP可以促進(jìn)缺氧條件下HIF-1α的穩(wěn)定和聚集，從而直接保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧損傷。NBP也可間接通過HIF-1α下游的VEGF產(chǎn)生對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，我們認(rèn)為NBP可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧條件下HIF-1α的表達(dá)和在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，從而增加下游VEGF的表達(dá)，并保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF可作用于細(xì)胞自身的VEGF抗體，促進(jìn)血管再生和血管形態(tài)功能的保存，最終達(dá)到預(yù)防和治療腦卒中的作用。

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EffectsofNBPonexpressionofVEGFandHIF-1αinHUVECsundertheconditionofoxygen-glucosedeprivation

YIN Jian-rui1, ZHANG Bo1, TAN Li-hua1, FU Xian1, WEI Huan2, LI Ling3

(1DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou510260,China;2Yan’anHospital,Kunming650051,China;3DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:bozhang.1982 @yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the mechanism that dl-3-n-butylphthalide (NBP) protects cells from the induced by oxygen-glucose deprivation (OGD).METHODSHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were exposed to OGD to induce endothelial damage. Endothelial injury was assessed by measuring the changes of chromatin morphology and MTT method. The protein levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hypoxia inducible factor-1 alpha (HIF-1α) were determined by immunofluorescence and quantitatively analyzed with the software IPP. Western blotting was applied to verify the results.RESULTSNBP at the concentrations of 0.01 to 100 μmol/L dose-dependently protected against OGD-induced cell damage. Compared with OGD group, NBP enhanced OGD-induced the expression of VEGF and HIF-1α, and the difference was statistically significant. The expression of VEGF and HIF-1α reached to the peak at the time points of 6 h and 8 h after OGD, respectively.CONCLUSIONUnder the condition of OGD, NBP enhances the expression of HIF-1α in HUVECs, subsequently promotes the expression of downstream VEGF, and eventually elevates the survival of the cells.

dl-3-n-Butylphthalide; Vascular endothelial cells; Oxygen-glucose deprivation; Vascular endothelial growth factors; Hypoxia inducible factor-1

1000-4718(2011)04-0643-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.004

2010-09-09

2011-03-03

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2008B080703029)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2010B080701008)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81071069)

△通訊作者 Tel：020-34153252; E-mail: bozhang.1982 @yahoo.com.cn