愈骨療傷膠囊提取工藝的優(yōu)化

孫 艷，卞 俊，許志仁，陳海飛，柳正良

(1.解放軍第411醫(yī)院藥學(xué)科，上海200434；2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，南昌333004)

[本文編輯] 邢文榮 姚春芳

愈骨療傷膠囊為解放軍第411醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的自制制劑，制劑批準(zhǔn)文號[南制字(2006)F57023]，含有川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、白芍、當(dāng)歸、沒藥等11味藥材，以川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)為君藥，補(bǔ)肝腎、續(xù)筋骨、調(diào)和血脈，補(bǔ)腎活血。川續(xù)斷的主要活性成分為川續(xù)斷皂苷Ⅵ，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨骼愈合的作用[1]。骨碎補(bǔ)的主要活性成分為柚皮苷，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血脂的藥理作用[2]。本研究以川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷為指標(biāo)性成分，采用L9(33)正交試驗(yàn)，考察回流提取與超聲循環(huán)提取的區(qū)別。在回流提取中，考察不同溶劑，即水和不同濃度的乙醇對其含量的影響，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷轉(zhuǎn)換率綜合得分為考察指標(biāo)，對處方提取工藝進(jìn)行篩選。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀，包括2487雙波長紫外檢測器、1525泵、717自動進(jìn)樣器 ；LXJII離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)療器械三廠)；DZF－6020型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；202－00型電熱恒溫干燥箱(浙江寧波生化儀器廠)；H.H.S 11－2B電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；SENCO W201恒溫水浴鍋及SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)；SK3300H型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器廠)；AB104－N電子分析天平(梅特勒－托利多儀器公司)；HF－50B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 試藥 骨碎補(bǔ)(批號2008090600)、川續(xù)斷(批號2009030124)、白芍(批號20081202170)、甘草(批號2009052201)和當(dāng)歸(批號2009030049)等藥材均購自于上海市雷允上中藥飲片公司，符合《中華人民共和國藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(批號111685－200802)和柚皮苷對照品(批號為110722－200610)均由中國藥品生物制品檢定所提供。水為重蒸餾水(本院自制)，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 川續(xù)斷藥材的含量測定 取川續(xù)斷粗粉約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25ml甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再次稱定，用甲醇補(bǔ)足其失重。搖勻，濾過，取濾液5ml，置于50ml容量瓶中，用流動相定容至刻度線。搖勻，即得。按《中華人民共和國藥典》2010年版一部[3]方法測得其含量為7.09%。

2.2 骨碎補(bǔ)藥材的含量測定[3]取骨碎補(bǔ)粗粉約0.25g，精密稱定，加甲醇30ml，加熱回流3h，放冷，濾過，濾液置50ml量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。按文獻(xiàn)[3]方法測得骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量為0.53%。

2.3 提取物中川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 迪馬 C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；采用梯度洗脫法，A為蒸餾水，B為乙腈，梯度洗脫：1→20→30min，A：80%→60%→80%；流速為1.0ml／min；采用雙波長檢測，212nm測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ，283nm測定柑皮苷；柱溫為30℃。

圖1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of asperosaponinⅥand naringin

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解，制成0.2mg／ml溶液作為川續(xù)斷皂苷Ⅵ儲備液(1)。稱取柚皮苷對照品適量，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解制成0.15mg／ml溶液，作為柚皮苷儲備液(2)。精密吸取儲備液(1)和儲備液(2)各1.0ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45μm的濾膜后作為混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備與測定 分別取川續(xù)斷和骨碎補(bǔ)藥材樣品的提取物粉末約0.05g，精密稱定，置于25ml容量瓶，加乙腈:水(30:70)溶液超聲(功率30W，頻率50Hz)溶解，放冷，稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm的微孔濾膜得到供試品溶液，備用。分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入HPLC儀測定，在212nm處測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積，在283nm處測定柚皮苷對照品溶液峰面積，見圖1。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱定川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品8.1mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密稱定柚皮苷對照品5.1mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。分別精密吸取以上兩種儲備液 5、2.5、1.25、0.625、0.063ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液，分別吸取20μl注入HPLC儀，記錄色譜峰。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(c)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A川續(xù)斷皂苷Ⅵ＝228 217c川續(xù)斷皂苷Ⅵ－4 176，r＝0.999 8，n＝6，線性范圍 為0.041～6.48μg／ml；A柚皮苷＝5 999 871c柚皮苷＋3 556，r＝0.999 9，n＝6，線性范圍為2.76～16.56μg／ml。

2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，在212nm處測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積，得其RSD為0.65%(n＝6)；在283nm處測定柚皮苷峰面積，得其RSD為0.57%(n＝6)。

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品，分別于配制后0、2、4、6、8、10、16h測定其峰面積，求得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD＝1.92%(n＝7)；柚皮苷RSD＝1.59%(n＝7)。結(jié)果表明供試品溶液在16h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品6份，按2.3.3項(xiàng)方法和2.3.1項(xiàng)色譜條件分別測定含量，求得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的 RSD＝1.46%(n＝6)，柚皮苷RSD＝1.1%(n＝6)，表明重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量醇提正交試驗(yàn)1號樣品，共6份。精密稱定，分別加對照品溶液，按上述實(shí)驗(yàn)方法分別測定含量，計(jì)算加樣回收率，川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均回收率為101.04%，RSD為0.57%(n＝6)，柚皮苷平均回收率為102.87%，RSD為1.43(n＝6)。

2.4 工藝優(yōu)化 對愈骨療傷膠囊處方中藥材采用水提、醇提、超聲循環(huán)這3種方法進(jìn)行提取，比較指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)換率大小，優(yōu)選其最佳提取工藝。按2.1和2.2項(xiàng)方法測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的含量，從而得到兩者的轉(zhuǎn)換率，并按加權(quán)系數(shù)法進(jìn)行評分。川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)換率(X)＝(正交試驗(yàn)各供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的量／川續(xù)斷皂苷藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的量)×100%；柚皮苷的轉(zhuǎn)換率(Y)＝(正交試驗(yàn)各供試品中柚皮苷的量／骨碎補(bǔ)藥材中柚皮苷的量)×100%，綜合評分(Z)＝0.5X＋0.5Y。

2.4.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平 水提、醇提和超聲循環(huán)按表1因素水平進(jìn)行提取。

2.4.2 L9(33)正交試驗(yàn) 根據(jù)處方比例稱取各藥材，即稱取川續(xù)斷粉末和骨碎補(bǔ)粉末各6g及其他各味藥材共46.5g，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平進(jìn)行加熱回流提取與超聲循環(huán)提取，得到的液體在2×103×g條件下離心20min，抽濾，減壓濃縮干燥至恒重，分別得到9個(gè)樣品。

表1 提取工藝因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction process

2.4.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 測定各樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷含量，按2.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定并計(jì)算其綜合評分，其結(jié)果見表2。R值越大，表明該因素的影響越大，水為溶劑時(shí)三因素的影響強(qiáng)度為B水提＞C水提＞A水提，其最佳提取工藝為A3B1C2，即加8倍量的水，回流提取2次，每次1h。以醇為溶劑時(shí)，三因素的影響強(qiáng)度為C醇提＞A醇提＞B醇提，其最佳提取工藝為A3B2C3，即加8倍量55%的乙醇，回流提取3次，每次1.5h。超聲循環(huán)提取時(shí)，三因素影響強(qiáng)度為 A超聲＞B超聲＞C超聲，其最佳提取工藝為A1B3C2，即加75%的乙醇，以1 400W的功率提取90(30，30，30)min。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步考察工藝條件的可靠性和穩(wěn)定性，按處方量取藥材共93g，按正交試驗(yàn)優(yōu)選得到的最佳提取工藝條件重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，在對實(shí)驗(yàn)結(jié)果不產(chǎn)生顯著性差異的前提下，從經(jīng)濟(jì)成本與節(jié)能的角度考慮，將醇提工藝進(jìn)行改動，即將8倍量55%的乙醇提取3次改為提取2次后，醇提得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)換率為107.86%，柚皮苷轉(zhuǎn)換率為103.90%，綜合評分為105.88。經(jīng)最佳提取工藝得到的粉末中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)換率與柚皮苷轉(zhuǎn)換率均高于試驗(yàn)各組別，而醇提的綜合評分最高，為愈骨療傷膠囊的工藝確定提供科學(xué)依據(jù)。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

3 討 論

在綜合評分時(shí)對于加權(quán)系數(shù)的選擇上，因制劑中川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷均為其指標(biāo)性成分，故兩種成分具有相同作用，應(yīng)具有相同的權(quán)重系數(shù)，故綜合評分(Z)＝0.5X＋0.5Y。研究中對川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷采用同一流動相系統(tǒng)、不同波長進(jìn)行一次進(jìn)樣，同時(shí)得出兩種指標(biāo)性成分的含量。實(shí)驗(yàn)初期，采用不同比例乙腈－水進(jìn)行等度洗脫時(shí)不能使川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷兩者同時(shí)達(dá)到很好的分離效果，改用乙腈－水進(jìn)行梯度洗脫，調(diào)整兩者比例，使兩物質(zhì)達(dá)到很好的分離效果。對于波長的選擇上，在212nm處川續(xù)斷皂苷Ⅵ有最大吸收，柚皮苷有吸收，但212nm不是柚皮苷的最大吸收波長，其最大吸收波長為283nm。本研究依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版一部對川斷續(xù)和骨碎補(bǔ)的檢測波長進(jìn)行檢測。本研究僅從指標(biāo)性成分的含量角度進(jìn)行工藝的篩選，課題在接下來將從藥效學(xué)的角度對工藝進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

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