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    愈骨療傷膠囊提取工藝的優(yōu)化

    2011-11-20 01:56:42許志仁陳海飛柳正良
    藥學(xué)服務(wù)與研究 2011年5期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)換率容量瓶皂苷

    孫 艷,卞 俊,許志仁,陳海飛,柳正良

    (1.解放軍第411醫(yī)院藥學(xué)科,上海200434;2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,南昌333004)

    [本文編輯] 邢文榮 姚春芳

    愈骨療傷膠囊為解放軍第411醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的自制制劑,制劑批準(zhǔn)文號[南制字(2006)F57023],含有川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、白芍、當(dāng)歸、沒藥等11味藥材,以川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)為君藥,補(bǔ)肝腎、續(xù)筋骨、調(diào)和血脈,補(bǔ)腎活血。川續(xù)斷的主要活性成分為川續(xù)斷皂苷Ⅵ,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)骨骼愈合的作用[1]。骨碎補(bǔ)的主要活性成分為柚皮苷,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血脂的藥理作用[2]。本研究以川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷為指標(biāo)性成分,采用L9(33)正交試驗(yàn),考察回流提取與超聲循環(huán)提取的區(qū)別。在回流提取中,考察不同溶劑,即水和不同濃度的乙醇對其含量的影響,以川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷轉(zhuǎn)換率綜合得分為考察指標(biāo),對處方提取工藝進(jìn)行篩選。

    1 儀器和試藥

    1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀,包括2487雙波長紫外檢測器、1525泵、717自動進(jìn)樣器 ;LXJII離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)療器械三廠);DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);202-00型電熱恒溫干燥箱(浙江寧波生化儀器廠);H.H.S 11-2B電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠);SENCO W201恒溫水浴鍋及SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司);SK3300H型超聲波清洗儀(上??茖?dǎo)超聲儀器廠);AB104-N電子分析天平(梅特勒-托利多儀器公司);HF-50B超聲循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

    1.2 試藥 骨碎補(bǔ)(批號2008090600)、川續(xù)斷(批號2009030124)、白芍(批號20081202170)、甘草(批號2009052201)和當(dāng)歸(批號2009030049)等藥材均購自于上海市雷允上中藥飲片公司,符合《中華人民共和國藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)。川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(批號111685-200802)和柚皮苷對照品(批號為110722-200610)均由中國藥品生物制品檢定所提供。水為重蒸餾水(本院自制),乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。

    2 方法和結(jié)果

    2.1 川續(xù)斷藥材的含量測定 取川續(xù)斷粗粉約0.5g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入25ml甲醇,密塞,稱定重量,超聲處理30min,放冷,再次稱定,用甲醇補(bǔ)足其失重。搖勻,濾過,取濾液5ml,置于50ml容量瓶中,用流動相定容至刻度線。搖勻,即得。按《中華人民共和國藥典》2010年版一部[3]方法測得其含量為7.09%。

    2.2 骨碎補(bǔ)藥材的含量測定[3]取骨碎補(bǔ)粗粉約0.25g,精密稱定,加甲醇30ml,加熱回流3h,放冷,濾過,濾液置50ml量瓶中,用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器,洗液濾入同一量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得供試品溶液。按文獻(xiàn)[3]方法測得骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量為0.53%。

    2.3 提取物中川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的含量測定

    2.3.1 色譜條件 迪馬 C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);采用梯度洗脫法,A為蒸餾水,B為乙腈,梯度洗脫:1→20→30min,A:80%→60%→80%;流速為1.0ml/min;采用雙波長檢測,212nm測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ,283nm測定柑皮苷;柱溫為30℃。

    圖1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of asperosaponinⅥand naringin

    2.3.2 對照品溶液的制備 稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量,置50ml容量瓶中,加甲醇溶解,制成0.2mg/ml溶液作為川續(xù)斷皂苷Ⅵ儲備液(1)。稱取柚皮苷對照品適量,置50ml容量瓶中,加甲醇溶解制成0.15mg/ml溶液,作為柚皮苷儲備液(2)。精密吸取儲備液(1)和儲備液(2)各1.0ml,置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,過0.45μm的濾膜后作為混合對照品溶液。

    2.3.3 供試品溶液的制備與測定 分別取川續(xù)斷和骨碎補(bǔ)藥材樣品的提取物粉末約0.05g,精密稱定,置于25ml容量瓶,加乙腈:水(30:70)溶液超聲(功率30W,頻率50Hz)溶解,放冷,稀釋至刻度,搖勻,過0.45μm的微孔濾膜得到供試品溶液,備用。分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各20μl,注入HPLC儀測定,在212nm處測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積,在283nm處測定柚皮苷對照品溶液峰面積,見圖1。

    2.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱定川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品8.1mg,置于50ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為儲備液。精密稱定柚皮苷對照品5.1mg,置于50ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為儲備液。分別精密吸取以上兩種儲備液 5、2.5、1.25、0.625、0.063ml,置于10ml容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液,分別吸取20μl注入HPLC儀,記錄色譜峰。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣濃度(c)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A川續(xù)斷皂苷Ⅵ=228 217c川續(xù)斷皂苷Ⅵ-4 176,r=0.999 8,n=6,線性范圍 為0.041~6.48μg/ml;A柚皮苷=5 999 871c柚皮苷+3 556,r=0.999 9,n=6,線性范圍為2.76~16.56μg/ml。

    2.3.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一混合對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,在212nm處測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積,得其RSD為0.65%(n=6);在283nm處測定柚皮苷峰面積,得其RSD為0.57%(n=6)。

    2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品,分別于配制后0、2、4、6、8、10、16h測定其峰面積,求得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD=1.92%(n=7);柚皮苷RSD=1.59%(n=7)。結(jié)果表明供試品溶液在16h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    2.3.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品6份,按2.3.3項(xiàng)方法和2.3.1項(xiàng)色譜條件分別測定含量,求得川續(xù)斷皂苷Ⅵ的 RSD=1.46%(n=6),柚皮苷RSD=1.1%(n=6),表明重復(fù)性良好。

    2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量醇提正交試驗(yàn)1號樣品,共6份。精密稱定,分別加對照品溶液,按上述實(shí)驗(yàn)方法分別測定含量,計(jì)算加樣回收率,川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均回收率為101.04%,RSD為0.57%(n=6),柚皮苷平均回收率為102.87%,RSD為1.43(n=6)。

    2.4 工藝優(yōu)化 對愈骨療傷膠囊處方中藥材采用水提、醇提、超聲循環(huán)這3種方法進(jìn)行提取,比較指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)換率大小,優(yōu)選其最佳提取工藝。按2.1和2.2項(xiàng)方法測得川續(xù)斷皂苷Ⅵ和柚皮苷的含量,從而得到兩者的轉(zhuǎn)換率,并按加權(quán)系數(shù)法進(jìn)行評分。川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)換率(X)=(正交試驗(yàn)各供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的量/川續(xù)斷皂苷藥材中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的量)×100%;柚皮苷的轉(zhuǎn)換率(Y)=(正交試驗(yàn)各供試品中柚皮苷的量/骨碎補(bǔ)藥材中柚皮苷的量)×100%,綜合評分(Z)=0.5X+0.5Y。

    2.4.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平 水提、醇提和超聲循環(huán)按表1因素水平進(jìn)行提取。

    2.4.2 L9(33)正交試驗(yàn) 根據(jù)處方比例稱取各藥材,即稱取川續(xù)斷粉末和骨碎補(bǔ)粉末各6g及其他各味藥材共46.5g,按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),各因素水平進(jìn)行加熱回流提取與超聲循環(huán)提取,得到的液體在2×103×g條件下離心20min,抽濾,減壓濃縮干燥至恒重,分別得到9個(gè)樣品。

    表1 提取工藝因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction process

    2.4.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 測定各樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷含量,按2.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定并計(jì)算其綜合評分,其結(jié)果見表2。R值越大,表明該因素的影響越大,水為溶劑時(shí)三因素的影響強(qiáng)度為B水提>C水提>A水提,其最佳提取工藝為A3B1C2,即加8倍量的水,回流提取2次,每次1h。以醇為溶劑時(shí),三因素的影響強(qiáng)度為C醇提>A醇提>B醇提,其最佳提取工藝為A3B2C3,即加8倍量55%的乙醇,回流提取3次,每次1.5h。超聲循環(huán)提取時(shí),三因素影響強(qiáng)度為 A超聲>B超聲>C超聲,其最佳提取工藝為A1B3C2,即加75%的乙醇,以1 400W的功率提取90(30,30,30)min。

    2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步考察工藝條件的可靠性和穩(wěn)定性,按處方量取藥材共93g,按正交試驗(yàn)優(yōu)選得到的最佳提取工藝條件重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn),在對實(shí)驗(yàn)結(jié)果不產(chǎn)生顯著性差異的前提下,從經(jīng)濟(jì)成本與節(jié)能的角度考慮,將醇提工藝進(jìn)行改動,即將8倍量55%的乙醇提取3次改為提取2次后,醇提得到川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)換率為107.86%,柚皮苷轉(zhuǎn)換率為103.90%,綜合評分為105.88。經(jīng)最佳提取工藝得到的粉末中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的轉(zhuǎn)換率與柚皮苷轉(zhuǎn)換率均高于試驗(yàn)各組別,而醇提的綜合評分最高,為愈骨療傷膠囊的工藝確定提供科學(xué)依據(jù)。

    表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

    3 討 論

    在綜合評分時(shí)對于加權(quán)系數(shù)的選擇上,因制劑中川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷均為其指標(biāo)性成分,故兩種成分具有相同作用,應(yīng)具有相同的權(quán)重系數(shù),故綜合評分(Z)=0.5X+0.5Y。研究中對川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷采用同一流動相系統(tǒng)、不同波長進(jìn)行一次進(jìn)樣,同時(shí)得出兩種指標(biāo)性成分的含量。實(shí)驗(yàn)初期,采用不同比例乙腈-水進(jìn)行等度洗脫時(shí)不能使川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷兩者同時(shí)達(dá)到很好的分離效果,改用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫,調(diào)整兩者比例,使兩物質(zhì)達(dá)到很好的分離效果。對于波長的選擇上,在212nm處川續(xù)斷皂苷Ⅵ有最大吸收,柚皮苷有吸收,但212nm不是柚皮苷的最大吸收波長,其最大吸收波長為283nm。本研究依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010版一部對川斷續(xù)和骨碎補(bǔ)的檢測波長進(jìn)行檢測。本研究僅從指標(biāo)性成分的含量角度進(jìn)行工藝的篩選,課題在接下來將從藥效學(xué)的角度對工藝進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

    [1]鐘美英,申玉華.川續(xù)斷的研究現(xiàn)狀[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,14(6):137-139.Zhong MeiYing,Shen YuHua.Current status on studying Chinese teasel root[J].Guiding J Tradit Chin Med Pharm,2008,14(6):137-139.Chinese with abstract in English.

    [2]常德有,董?;?骨碎補(bǔ)的研究概況[J].吉林中醫(yī)藥,2006,26(6):61-62.Chang DeYou,Dong FuHui.Research summary of drynariae rhizome[J].J Jilin Tradit Chin Med,2006,26(6):61-62.Chinese.

    [3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010年版 一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:239-240,309-310.State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 1[S].Beijing:Chinese Medical and Technology Press,2010:239-240,309-310.Chinese.

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