受褐飛虱誘導(dǎo)的水稻酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建

祝莉莉 胡亮 杜波

摘要：為了研究水稻抗褐飛虱的分子機(jī)制，構(gòu)建了受褐飛虱取食誘導(dǎo)的水稻的酵母雙雜交文庫(kù)。檢測(cè)結(jié)果表明構(gòu)建的文庫(kù)容量為２．２２×１０６ CFU，文庫(kù)滴度為５．４×１０７ CFU／ｍＬ，文庫(kù)ｃＤＮＡ插入片段長(zhǎng)度主要分布在７００～１ ０００ ｂｐ之間。

關(guān)鍵詞：褐飛虱；水稻；酵母雙雜交文庫(kù)

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｑ８１２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）15－3201-03

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｒｉｃｅ Ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｂｒｏｗｎ Ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ

ＺＨＵ Ｌｉ－ｌｉ，ＨＵ Ｌｉａｎｇ，ＤＵ Ｂｏ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｉｃｅ ｔｏ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ， ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｒｉｃｅ ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ２．２２×１０６ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｅｓ； ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｌｉｂｒａｒｙ ｗｅｒｅ ５．４×１０７ CFU／ｍＬ． Ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｍｏｓｔ ｉｎｓｅｒｔｓ ｗｅｒｅ ７００～１ ０００ ｂｐ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ； ｒｉｃｅ； ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ

褐飛虱（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔ?覽ｌ．，ＢＰＨ）是對(duì)水稻危害最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，嚴(yán)重威脅水稻的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)［１］。在水稻生產(chǎn)中，依靠化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治褐飛虱不僅可能引起褐飛虱的再猖獗，還會(huì)造成環(huán)境污染［２］。目前認(rèn)為，培育并推廣種植抗褐飛虱水稻品種是綜合防治褐飛虱最為經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的方法［３］。迄今為止，人們?cè)谝吧竞驮耘嗥贩N中定位了２１個(gè)抗褐飛虱的主效基因［４］，并成功地克隆了水稻抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４［５］，但水稻抗褐飛虱的分子機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)，科學(xué)家們應(yīng)用多種方法，如ｃＤＮＡ ａｒｒａｙ、抑制差減雜交、ｃＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒｙ以及ｉＴＲＡＱ技術(shù)等，從ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白質(zhì)水平對(duì)抗、感水稻品種受褐飛虱取食誘導(dǎo)后的變化進(jìn)行了探索［６－９］。這些研究表明，褐飛虱的取食導(dǎo)致了水稻體內(nèi)與細(xì)胞防御、細(xì)胞傳遞、大分子代謝、信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)顯著的改變。然而，這些報(bào)道都是大范圍地進(jìn)行水稻抗褐飛虱分子機(jī)制的探索?？购诛w虱相關(guān)基因與哪種蛋白相互作用，從而介導(dǎo)抗性反應(yīng)則完全不清楚。

酵母雙雜交技術(shù)是一種研究蛋白質(zhì)之間相互作用的有效手段，不但可以檢測(cè)已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的在于發(fā)現(xiàn)與已知蛋白相互作用的未知蛋白，是一種成熟的研究蛋白間相互作用的方法。本研究構(gòu)建褐飛虱取食水稻品種９３１１的酵母雙雜交文庫(kù)，為篩選抗褐飛虱基因互作蛋白分子，并進(jìn)一步研究水稻抗褐飛虱的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

１材料和方法

１．１實(shí)驗(yàn)材料

建庫(kù)所用水稻品種為９３１１；所用褐飛虱飼養(yǎng)在武漢大學(xué)植物遺傳研究所的水稻品種臺(tái)中本地一號(hào)（ＴＮ１）上。構(gòu)建酵母文庫(kù)的試劑盒購(gòu)自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司，ＲＮＡ提取試劑盒購(gòu)自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司。

１．２方法

１．２．１水稻處理將水稻品種９３１１播種于直徑９ ｃｍ的塑料杯中。４葉期時(shí)分別于０、３、６、１２、２４、４８、７２、９６ ｈ按每棵苗８頭間隔接入褐飛虱，同一時(shí)間終止反應(yīng)。

１．２．２ＲＮＡ的提取采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的ＲＮＡ提取試劑盒提取水稻葉鞘的ＲＮＡ。提取后的ＲＮＡ進(jìn)行電泳，檢測(cè)其質(zhì)量，并調(diào)整ＲＮＡ的量至所有樣品相同。

１．２．３ｃＤＮＡ的合成參照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ試劑盒的說(shuō)明，先合成ｃＤＮＡ第一鏈，再通過(guò)ＰＣＲ擴(kuò)增雙鏈ｃＤＮＡ，并純化以去除小片段ｃＤＮＡ。

１．２．４酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ試劑盒的說(shuō)明制備Ｙ１８７感受態(tài)細(xì)胞，制備好的感受態(tài)細(xì)胞要立即使用。

１．２．５酵母文庫(kù)的轉(zhuǎn)化按照Ｃｌｏｎｔｅｃｈ試劑盒的要求，將擴(kuò)增的雙鏈ｃＤＮＡ、線(xiàn)性化的ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞Ｙ１８７。在直徑１５０ ｍｍ的ＳＤ／－Ｌｅｕ培養(yǎng)皿上涂抹１５０ μＬ菌液（共１００個(gè)培養(yǎng)皿）。在直徑９０ ｍｍ的ＳＤ／－Ｌｅｕ培養(yǎng)皿上分別涂抹１∶１０，１∶１００和１∶１ ０００的稀釋菌液，以檢測(cè)轉(zhuǎn)化的效率。培養(yǎng)皿在３０ ℃條件下倒置培養(yǎng)３ ｄ至菌落出現(xiàn)。

１．２．６文庫(kù)的收集和滴度測(cè)定根據(jù)按比例稀釋的平板上的克隆數(shù)，計(jì)算文庫(kù)的獨(dú)立轉(zhuǎn)化的克隆：初始文庫(kù)獨(dú)立克隆子數(shù)目（庫(kù)容量）＝每塊平板的平均克隆子數(shù)目×稀釋倍數(shù)×懸浮體積。然后用含有３０％甘油的ＬＢ液體培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，全部收集于無(wú)菌三角瓶中，共３００ ｍＬ。充分混勻后，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行滴度測(cè)定。符合滴度要求，再按每１ ｍＬ分裝至１．５ ｍＬ的ＥＰ管，保存在－８０ ℃。

１．２．７ｃＤＮＡ插入片段大小的檢測(cè)隨機(jī)挑取平板上生長(zhǎng)的單菌落，以ｐＧＡＤＴ７載體通用引物Ｔ７和ＡＤ對(duì)其進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，電泳檢測(cè)ｃＤＮＡ插入片段的大小。

２結(jié)果與分析

２．１ＲＮＡ的質(zhì)量及濃度

用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總ＲＮＡ純度（圖１）。結(jié)果顯示：提取的ＲＮＡ含量高，純度好，未發(fā)生降解，滿(mǎn)足建庫(kù)需要；同時(shí)，調(diào)整ＲＮＡ樣品的上樣量，使受褐飛虱取食８?jìng)€(gè)時(shí)間段的水稻ＲＮＡ樣品量相同。相同質(zhì)量的ＲＮＡ混合后，反轉(zhuǎn)錄得到單鏈ｃＤＮＡ。

２．２ｃＤＮＡ合成和純化結(jié)果

ｍＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈后，ＬＤ－ＰＣＲ擴(kuò)增獲得雙鏈ｃＤＮＡ。?。?μＬ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增片段的大小符合要求。用試劑盒提供的純化柱進(jìn)行純化去掉２００ ｂｐ以下的小片段。電泳結(jié)果顯示純化后的雙鏈ｃＤＮＡ的大小主要在３００～

３ ０００ ｂｐ之間（圖２）。

２．３文庫(kù)的容量與滴度

根據(jù)公式計(jì)算得知９３１１的初始文庫(kù)獨(dú)立克隆子數(shù)目為２．２２×１０６ CFU；用液體培養(yǎng)基收集后，血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)文庫(kù)的滴度為５．４×１０７ CFU／ｍＬ。２０多倍的文庫(kù)滴度既保證了ｃＤＮＡ文庫(kù)的完整性和覆蓋度，也減少了篩庫(kù)的工作量。

２．４酵母文庫(kù)插入片段大小

隨機(jī)挑選２４個(gè)文庫(kù)轉(zhuǎn)化子，通過(guò)ＰＣＲ反應(yīng)檢測(cè)文庫(kù)插入片段大小。從圖３中可以看出：所構(gòu)建的９３１１酵母文庫(kù)中，插入片段大小不等，具有良好的多樣性；插入片段大小主要分布在４００～１ ５００ ｂｐ之間，密集分布在７００～１ ０００ ｂｐ之間，文庫(kù)插入片段平均大小約為８８０ ｂｐ。

３討論

用于構(gòu)建水稻酵母雙雜交文庫(kù)的水稻品種是９３１１，其并不具有對(duì)褐飛虱的抗性。但是有研究表明通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇將抗褐飛虱基因?qū)耄梗常保焙螅傻牟牧暇哂蟹€(wěn)定的抗性［１０，１１］?？紤]到９３１１具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，已測(cè)序完成，有可用的基因組序列，且多個(gè)抗褐飛虱基因均能在９３１１中發(fā)揮作用。所以選擇用受褐飛虱取食誘導(dǎo)的９３１１來(lái)構(gòu)建酵母雙雜交文庫(kù)，以用于篩選與抗性相關(guān)基因互作的蛋白。

對(duì)文庫(kù)質(zhì)量的評(píng)價(jià)主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面。一方面為文庫(kù)的代表性，指文庫(kù)中包含的重組ｃＤＮＡ分子反映來(lái)源組織中表達(dá)信息（即ｍＲＮＡ種類(lèi)）的完整性，其好壞可用文庫(kù)的庫(kù)容量來(lái)表示，指構(gòu)建的初始ｃＤＮＡ文庫(kù)中所包含的獨(dú)立的重組子克隆數(shù)。庫(kù)容量取決于來(lái)源組織中所表達(dá)的ｍＲＮＡ種類(lèi)和每種ｍＲＮＡ的拷貝數(shù)。因此，ＲＮＡ的提取是ｃＤＮＡ合成和文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中最為關(guān)鍵的一步。本研究嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明抽提并純化ｍＲＮＡ，通過(guò)質(zhì)量評(píng)價(jià)確定所提取的ＲＮＡ產(chǎn)量高、純度好，未發(fā)生降解，且調(diào)整濃度至所有樣品量一致。測(cè)定酵母文庫(kù)的庫(kù)容量大于１×１０６ CFU，保證了文庫(kù)的完整性和覆蓋度。文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)的另一個(gè)方面是重組ｃＤＮＡ片段的序列完整性。本研究在合成ｃＤＮＡ的過(guò)程中，盡可能保證ｃＤＮＡ序列的完整性。對(duì)構(gòu)建的文庫(kù)ｃＤＮＡ插入片段ＰＣＲ結(jié)果分析表明，插入片段大小主要分布在４００～１ ５００ ｂｐ之間，密集分布在７００～

１ ０００ ｂｐ之間，文庫(kù)插入片段平均大小約為８８０ ｂｐ。本研究所構(gòu)建的水稻品種酵母雙雜交文庫(kù)經(jīng)分析評(píng)價(jià)確定其質(zhì)量達(dá)到了酵母雙雜交研究的標(biāo)準(zhǔn)，可以用來(lái)進(jìn)行大規(guī)模的互作蛋白篩選實(shí)驗(yàn)。

在植物與病原菌相互作用的研究中，人們通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，在不同的植物中篩選到了與抗病蛋白相互作用的蛋白分子。Ｍａｃｋｅｙ等［１２］通過(guò)篩選擬南芥的酵母雙雜交文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)擬南芥的抗病蛋白ＲＰＭ１和ＲＰＳ２通過(guò)ＲＩＮ４蛋白與三種不同的病原菌Ａｖｒ蛋白相互作用，使擬南芥產(chǎn)生抗病反應(yīng)。Ｙｕａｎ等［１３］在水稻中篩選出了與抗白葉枯基因Ｘａ１３互作的蛋白ＣＯＰＴ１和ＣＯＰＴ５，這兩個(gè)蛋白調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)銅離子的含量，從而使水稻產(chǎn)生抗病反應(yīng)。但是，在水稻抗蟲(chóng)研究中，由于并沒(méi)有克隆出水稻的抗蟲(chóng)基因，所以很少有通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)研究水稻與昆蟲(chóng)相互作用的報(bào)道。目前，水稻抗褐飛虱基因Ｂｐｈ１４已經(jīng)被成功克隆出來(lái)［５］，因此構(gòu)建受褐飛虱取食的水稻酵母雙雜交文庫(kù)，能為篩選與Ｂｐｈ１４互作的蛋白分子，從而研究水稻抗褐飛虱的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并對(duì)研究植物與刺吸式口器昆蟲(chóng)的相互作用具有參考意義。

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