李健 楊昌鵬 陳智理 郭靜婕
摘要:對(duì)3個(gè)香蕉品種果實(shí)POD的最適pH值與pH值穩(wěn)定性、最適溫度與熱穩(wěn)定性以及化合物的影響進(jìn)行了比較分析,為控制3個(gè)香蕉品種過(guò)氧化物酶(POD)引起的酶促褐變提供理論依據(jù)。結(jié)果表明,威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD最適pH值分別為6.5、5.0、5.5;pH值穩(wěn)定性范圍分別在6.0~9.0、8.0~9.0、5.0~9.0;POD最適溫度分別是35、25、30 ℃;POD的耐熱性表現(xiàn)為大蕉POD>威廉斯蕉POD>粉蕉POD;威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性的最佳抑制劑都是抗壞血酸,其次是鹽酸-L-半胱氨酸。
關(guān)鍵詞:香蕉;過(guò)氧化物酶;特性
中圖分類(lèi)號(hào):S668.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2011)15-3093-04
Characteristic Analysis of Peroxidase from Banana Pulp of Three Cultivars
LI Jian1,2,YANG Chang-peng1,2,CHEN Zhi-li2,GUO Jing-jie2
(1. College of Agricultural, Guangxi University, Nanning 530005,China;
2. Guangxi Agricultural Vocational and Technical College, Nanning 530007, China)
Abstract: The characteristics of POD in fruits of three banana cultivars were studied. In Williams jiao, Da jiao and Fen jiao, the optimum pH for POD activity was respectively 6.5, 5.0, 5.5, and the pH stability range was at pH6.0~9.0, pH8.0~9.0, pH5.0~9.0 respectively. The optimum temperature for POD activity was respectively 35 ℃, 25 ℃, 30℃. The heat tolerance of POD activity was Da jiao >Williams jiao >Fen jiao. The optimum inhibitor of POD activity in all three banana cultivars wasascorbic acid, and then followed by hydrochloride-L-cysteine.
Key words: banana cultivars; peroxidase; characteristics
香蕉為世界“四大水果”之一,世界年產(chǎn)量近1億t,居全世界水果產(chǎn)量第二位。香蕉屬呼吸躍變型水果,成熟后質(zhì)地柔軟,對(duì)其長(zhǎng)期保鮮或儲(chǔ)運(yùn)比較困難。目前,香蕉仍以鮮食為主,除少量被加工成香蕉干、香蕉粉和香蕉醬外,其他的加工品則很少見(jiàn),原因是香蕉果實(shí)中富含的多酚物質(zhì)在酚酶(多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶)的催化下進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而醌式化,再通過(guò)一系列的反應(yīng)聚合成黑色素[1],影響其加工性能及感觀質(zhì)量,嚴(yán)重制約著香蕉的深加工和綜合利用。
過(guò)去,大多數(shù)學(xué)者研究的是引起香蕉酶促褐變的多酚氧化酶(PPO)[2-7],對(duì)引起香蕉酶促褐變的過(guò)氧化物酶(POD)研究較少,除了對(duì)香牙蕉果皮的
POD[8]、果肉的POD[9]有少量報(bào)道外,對(duì)香牙蕉以外的香蕉品種果實(shí)的POD鮮見(jiàn)報(bào)道。為此,試驗(yàn)對(duì)我國(guó)栽培面積較大的香蕉品種威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD的最適pH值與pH值穩(wěn)定性、最適溫度與熱穩(wěn)定性、化合物對(duì)POD活性影響的相關(guān)特性進(jìn)行分析比較,以期為香蕉品種果實(shí)加工原料的選擇以及不同香蕉品種果實(shí)POD引起的酶促褐變的控制提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
采用八成熟的市售威廉斯蕉(Musa cavendishii L., AAA)、大蕉(Musa sapientum L., ABB)及粉蕉(Musa paradisiaca L.,ABB)。
1.2方法
1.2.1POD的提取將香蕉果實(shí)去皮,去除果肉四周的絲絡(luò),精確稱(chēng)?。担?g果肉,將果肉切成細(xì)塊狀, 按料液比1∶1(m/v,g∶mL)的比例加入含有0.03%果膠酶和3% Tween80的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH值7.0),一起打漿40 s后,置于40 ℃水浴中酶解90 min,除去果膠物質(zhì),取出用紗布過(guò)濾后,再在
10 000 r/min、2 ℃條件下離心20 min,收集上清液作為POD的粗酶提取液。
1.2.2POD的測(cè)定采用楊昌鵬等[9]的方法,用分光光度計(jì)比色法測(cè)定香蕉果實(shí)POD活性。反應(yīng)液由3.8 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH值7.0)、0.5 mL 愈創(chuàng)木酚-乙醇溶液(0.1mol/L)、0.5 mL過(guò)氧化氫(0.3%)和0.2 mL酶液組成。在30 ℃下反應(yīng)5 min,于470 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值的變化。以每毫升酶液每分鐘吸光度改變0.1為1個(gè)酶活性單位(U)。
1.2.3pH值對(duì)香蕉POD活性及穩(wěn)定性的影響
1)pH值對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性影響的測(cè)定。分別用pH值3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0的混合緩沖溶液取代0.1 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液,測(cè)定威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)的POD活性。以吸光值最大處酶活性為100%,計(jì)算出其他pH值的相對(duì)活性,繪出相對(duì)酶活性曲線(xiàn),從而判定其POD的最適pH值。
2)pH值對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD穩(wěn)定性的測(cè)定。分別取2 mL pH值3.0~11.0的各種混合緩沖溶液,再分別加入0.5 mL威廉斯蕉、大蕉及粉蕉酶液,放置在冰箱內(nèi)72 h后,再?。?mL 0.1 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液和1 mL處理過(guò)的各酶液相混合,測(cè)定威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)的POD殘存的酶活性。以吸光值最大處活性為100%,計(jì)算出其他pH值處理?xiàng)l件下POD的相對(duì)酶活性。
1.2.4溫度對(duì)香蕉POD活性及穩(wěn)定性的影響
1)溫度對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性影響的測(cè)定。將酶促反應(yīng)混合液分別置于20、25、30、35、40、50、60、70 ℃水浴下反應(yīng)5 min,測(cè)定威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD活性。以吸光值最大處酶活性為100%,計(jì)算出其他溫度的相對(duì)活性,繪出相對(duì)酶活性曲線(xiàn),并判定其POD的最適溫度。
2)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD的熱穩(wěn)定性測(cè)定。將提取的酶液分別在30~100 ℃水浴加熱10 min和30 min,冷卻后測(cè)定威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD的殘余酶活性。以吸光值最大處活性為100%,計(jì)算出其他溫度處理?xiàng)l件下的相對(duì)POD活性。
1.2.5化合物對(duì)香蕉果實(shí)POD活性的影響
用于研究的化合物分別有氯化鈉、檸檬酸、植酸、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、鹽酸-L-半胱氨酸、EDTA-Na2、氟化鈉、氯化鎂、硫酸銅、乙酸鋅、氯化錳、氯化鈣等。
測(cè)定化合物對(duì)香蕉果實(shí)POD活性影響時(shí),用3.3 mL的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH值7.0)和0.5 mL的一定濃度的上述化合物取代POD酶活性測(cè)定反應(yīng)體系中的3.8 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH值7.0),在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其反應(yīng)物吸光值的變化,再分別計(jì)算出威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活力。以在酶活性測(cè)定反應(yīng)體系中不添加任何化合物測(cè)得的香蕉果實(shí)POD的酶活性為100%,分別計(jì)算出添加各種化合物后反應(yīng)體系的香蕉果實(shí)的相對(duì)POD活性。
2結(jié)果與分析
2.1威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD最適pH值及其穩(wěn)定性
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD與最適pH值的關(guān)系見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD最適pH值分別是6.5、5.0、5.5。威廉斯蕉POD最適pH值與楊昌鵬等[9]報(bào)道的巴西蕉果肉POD最適pH值相同,比香蕉皮POD最適pH 值6.0[8] 略高。
威廉斯蕉POD在峰值過(guò)后,pH值7.0時(shí)活性快速下降至72.06%,而大蕉及粉蕉POD活性下降速度則相對(duì)較慢,由此可見(jiàn),威廉斯蕉POD對(duì)pH值變化的敏感性高于粉蕉POD和大蕉POD。
當(dāng)pH值為3.0時(shí),威廉斯蕉、大蕉及粉蕉的POD活性分別是其最大活性的17.65%、50.67%、29.43%;當(dāng)pH≥9.0時(shí),三者的POD活性遠(yuǎn)低于其最大活性,由此可知,低酸能較好地抑制威廉斯蕉POD的活性,也對(duì)香蕉PPO活性有較好的抑制效果[3];低酸對(duì)粉蕉POD活性也有一定的抑制效果,但對(duì)大蕉POD抑制效果較差;而當(dāng)pH≥9.0時(shí),都能較好地抑制三者的POD活性。生產(chǎn)上若采用低酸度處理威廉斯蕉、粉蕉原料及其加工制品,應(yīng)該可以有效控制威廉斯蕉果肉由PPO和POD共同引起的酶促褐變。
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性的pH值穩(wěn)定性曲線(xiàn)如圖2所示。由圖2可以看出,威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD的pH值穩(wěn)定范圍分別是6.0~9.0、8.0~9.0、5.0~9.0,三者POD活性的pH值穩(wěn)定性范圍依次是:粉蕉>威廉斯蕉>大蕉。其中威廉斯蕉POD粗酶的pH值穩(wěn)定范圍與巴西蕉果肉POD純酶的接近[9]。大蕉POD在pH≤5.0時(shí)活性較低,之后隨著pH值增大活性快速上升,在pH值8.0時(shí)達(dá)到峰值,而后又快速下降,表現(xiàn)為波動(dòng)較大,pH值穩(wěn)定性較差。
2.2威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD的最適溫度及其熱穩(wěn)定性
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性與最適溫度的關(guān)系見(jiàn)圖3。由圖3可以看出,威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性最適溫度分別是35、25、30 ℃,其中威廉斯蕉POD粗酶最適溫度與楊昌鵬等[9]報(bào)道的巴西蕉果肉POD純酶最適溫度相同,比香蕉皮POD最適溫度30 ℃[7]稍高。
圖4顯示了威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD的熱穩(wěn)定性。由圖4可以看出,70 ℃加熱30 min,大蕉POD保持最大活性;80 ℃加熱10 min,威廉斯蕉POD、大蕉POD仍殘存25%左右的活性,而粉蕉POD基本失活;100 ℃加熱30 min,威廉斯蕉POD、大蕉POD殘存活性分別保持14.45%、18.28%,仍然不易完全失活,這與楊昌鵬等[9]報(bào)道的90 ℃高溫加熱條件下,巴西蕉果肉POD仍然不易完全失活相符。由此可見(jiàn),大蕉POD的熱穩(wěn)定性較高,3個(gè)蕉類(lèi)品種的POD耐熱性表現(xiàn)為大蕉>威廉斯蕉>粉蕉。
威廉斯蕉POD粗酶在60 ℃加熱10 min,其殘存活性是57.58%,而楊昌鵬等[9]報(bào)道的巴西蕉POD純酶在60 ℃加熱10 min,其殘存活性已低于10%??梢?jiàn),威廉斯蕉POD粗酶的熱穩(wěn)定性高于其POD純酶的熱穩(wěn)定性。類(lèi)似的有王瑧等[10]的報(bào)道。
2.3化合物對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD活性的影響
不同化合物對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果實(shí)POD 活性的影響如表1所示。從表1可以看出,10 mmol/L的鹽酸-L-半胱氨酸、抗壞血酸對(duì)威廉斯蕉POD活性有較顯著的抑制效果。因此,威廉斯蕉POD最佳抑制劑是抗壞血酸,其次是鹽酸-L-半胱氨酸,這與楊昌鵬等[9]報(bào)道的相符;再次是低濃度EDTA-Na2、10 mmol/L亞硫酸氫鈉對(duì)威廉斯蕉POD活性也有一定的抑制效果;但是10 mmol/L EDTA-Na2、低濃度的亞硫酸氫鈉以及氯化鈉、檸檬酸、植酸、氟化鈉、氯化鎂則對(duì)威廉斯蕉POD活性無(wú)明顯影響;而乙酸鋅、氯化錳、硫酸銅、氯化鈣則對(duì)威廉斯蕉POD有明顯的激活作用,其中以乙酸鋅的激活作用最為顯著。
10 mmol/L的鹽酸-L-半胱氨酸和抗壞血酸對(duì)大蕉POD活性有較顯著的抑制效果,因此大蕉POD的最佳抑制劑也是抗壞血酸,其次是鹽酸-L-半胱氨酸;10 mmol/L亞硫酸氫鈉對(duì)大蕉POD活性也有一定的抑制效果;但是低濃度的亞硫酸氫鈉以及氯化鈉、檸檬酸、植酸、氟化鈉、氯化鎂、EDTA-Na2則對(duì)大蕉POD活性無(wú)明顯影響;而乙酸鋅、氯化錳、硫酸銅、氯化鈣對(duì)大蕉POD有明顯的激活作用,其中以氯化錳的激活作用最為顯著。
10 mmol/L的鹽酸-L-半胱氨酸和10、1、0.5 mmol/L抗壞血酸對(duì)粉蕉POD活性均有顯著的抑制效果,因此粉蕉POD的最佳抑制劑也是抗壞血酸,其次是鹽酸-L-半胱氨酸;10 mmol/L的亞硫酸氫鈉對(duì)大蕉POD活性也有一定的抑制效果;但是低濃度的亞硫酸氫鈉以及氯化鈉、檸檬酸、植酸、氟化鈉、EDTA-Na2、氯化鎂則對(duì)粉蕉POD活性無(wú)明顯影響;而乙酸鋅、氯化錳、硫酸銅,氯化鈣對(duì)粉蕉POD同樣有明顯的激活作用,其中以乙酸鋅的激活作用最為顯著。
3結(jié)論與討論
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD最適pH值分別是6.5、5.0、5.5,威廉斯蕉POD對(duì)pH值變化的敏感性高于粉蕉和大蕉。其中威廉斯蕉POD粗酶最適pH值與巴西蕉果肉POD純酶最適pH值相同,比香蕉皮POD最適pH值略高。
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD的pH值穩(wěn)定范圍分別是6.0~9.0、8.0~9.0、5.0~9.0,三者POD活性的pH值穩(wěn)定性范圍依次是粉蕉>威廉斯蕉>大蕉。其中威廉斯蕉POD粗酶的pH值穩(wěn)定范圍與巴西蕉果肉POD純酶的接近。
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD的最適溫度分別是35、25、30 ℃,其中威廉斯蕉POD粗酶最適溫度與巴西蕉果肉POD純酶的相同,比香蕉皮POD最適溫度稍高。
3個(gè)香蕉品種的POD耐熱性表現(xiàn)為大蕉>威廉斯蕉>粉蕉。威廉斯蕉POD粗酶的熱穩(wěn)定性高于其POD純酶的熱穩(wěn)定性。
威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD的抑制劑基本一致,即威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性的最佳抑制劑都是抗壞血酸,其次是鹽酸-L-半胱氨酸;低濃度的亞硫酸氫鈉以及氯化鈉、檸檬酸、植酸、氟化鈉、EDTA-Na、氯化鎂對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD活性無(wú)明顯影響;乙酸鋅、氯化錳、硫酸銅、氯化鈣對(duì)威廉斯蕉、大蕉及粉蕉POD有明顯的激活作用;其中乙酸鋅對(duì)威廉斯蕉、粉蕉POD激活作用最為顯著,而氯化錳對(duì)大蕉POD激活作用最為顯著。
試驗(yàn)采用威廉斯蕉、大蕉及粉蕉果肉POD的粗酶液進(jìn)行研究,還未進(jìn)一步開(kāi)展大蕉、粉蕉POD純化試驗(yàn)及其純酶特性的研究,這方面的試驗(yàn)研究有待進(jìn)一步開(kāi)展。
生產(chǎn)上如果采用可食性鹽酸-L-半胱氨酸、抗壞血酸處理威廉斯蕉、大蕉及粉蕉原料及其加工制品,應(yīng)該可以有效地抑制香蕉果實(shí)由POD引起的香蕉酶促褐變,但實(shí)際抑制效果如何,還有待進(jìn)一步的研究。
參考文獻(xiàn):
[1] MONTGOMERY M W, SGARBIERI V C. Isoenzymes of banana polyphenol oxidase[J]. Phytochemistry,1975,14(4):1245-1249.
[2] FUJITA S, YANG C P, MATSUFUJI K, et al. Changes of polyphenol oxidase of banana (Musa sapientum L.) fruits during ripening treatment by ethylene[J]. Food Preservation Science, 2001,27(2):79-82.
[3] YANG C P, FUJITA S, ASHRAFUZZAMAN M D, et al. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) pulp[J]. Agriculture Food Chemistry,2000,48(7):2732-2735.
[4] YANG C P, FUJITA S, KOHNO K, et al. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from banana (Musa sapientum L.) peel[J]. Agriculture Food Chemistry,2001,49(3):1446-1449.
[5] YANG C P, NONG Z R., LU J L, et al. Banana polyphenol oxidase: occurrence and change of polyphenol oxidase activity in some banana cultivars during fruit development[J]. Food Science Technology,2004,10(1):75-78.
[6] 李光磊,惠明,王清德, 等. 香蕉中多酚氧化酶特性探討[J]. 糧油加工與食品機(jī)械,2001(6):28-29.
[7] 張勇,池建偉,溫其標(biāo),等. 香蕉酶促褐變的研究[J]. 食品科學(xué),2004,25(3):45-48.
[8] 鮑金勇,趙國(guó)建,梁淑如,等. 香蕉皮多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶特性的研究[J]. 食品科技,2005(11):17-20.
[9] 楊昌鵬,羅菊珍,郭靜婕,等.香蕉果肉過(guò)氧化物酶初步純化及特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(36):16148-16150.
[10] 王瑧,廖祥儒,張建國(guó),等. 女貞果實(shí)過(guò)氧化物酶的純化及熱穩(wěn)定性研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(5):23-27.