纖維素降解菌的篩選及酶活力測定

高小朋 楊晗 袁茂林 賀曉龍 任桂梅

摘要：從延安市寶塔區(qū)楊家灣長期堆積牛糞和秸稈的腐殖土中篩選到１７株纖維素降解菌，經(jīng)剛果紅培養(yǎng)基、赫奇遜培養(yǎng)基復(fù)篩，得到ＴＣ－２、ＴＣ－４、ＴＣ－５、ＴＣ－６、ＴＣ－８、ＴＣ－１１、ＴＣ－１２、ＴＣ－１３共８株可分解纖維素的菌株，對其進(jìn)行纖維素酶活力（CMCA）和濾紙酶活力（FPA）的測定。結(jié)果表明，菌株ＴＣ－１１產(chǎn)生的兩種酶的酶活力均較高，可作為進(jìn)一步研究的試驗菌株。

關(guān)鍵詞：纖維素；降解菌；纖維素酶活力；濾紙酶活力

中圖分類號：Ｑ９３－３３１文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）15－3072-02

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｅｍｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｐｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｈａｎ，ＹＵＡＮ Ｍａｏ－ｌｉｎ，ＨＥ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＲＥＮ Ｇｕｉ－ｍｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎａｎ ７１６０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓｔａｃｋｅｄ ｃｏｗ ｄｕｎｇ ａｎｄ ｓｔｒａｗ ｆｏｒ ａ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ， ａｎｄ ｅｉｇｈｔ ｓｔｒａｉｎｓ （ＴＣ－２， ＴＣ－４， ＴＣ－５， ＴＣ－６， ＴＣ－８， ＴＣ－１１， ＴＣ－１２， ＴＣ－１３） ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ by Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ＨａｏＱｉＸｕｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒｌｙａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒｌｙａｓｅ ｏｆ ＴＣ－１１ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １．０ ＩＵ indicating ｔｈａｔ ＴＣ－１１ ｗａｓ ａ ｖａｌｕａｂｌｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ worth ｔｏ ｂｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｆｕｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ sｔｒａｉｎ； ＣＭＣＡ； ＦＰＡ

進(jìn)入２１世紀(jì)以來，能源危機(jī)問題日趨嚴(yán)重。而大量的植物秸稈的主要成分——纖維素經(jīng)過處理后可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)燃料、飼料、肥料等，取代目前由化工燃料合成生產(chǎn)的部分有機(jī)產(chǎn)品［１－３］。

纖維素的微生物降解已經(jīng)取得了一定的成果［４－８］，但由于目前篩選得到的大多數(shù)纖維素降解菌產(chǎn)生的纖維素酶活力（CMCA）低下，成為制約該技術(shù)推廣應(yīng)用的重要原因之一。因此，篩選產(chǎn)生高活性纖維素酶的菌株有著重要的意義。本研究從陜北地區(qū)堆積秸稈和牛糞的土壤中篩選出可高效降解纖維素的菌株，對其進(jìn)行酶活力測定，以期為解決秸稈轉(zhuǎn)化醇類及菌肥的制造奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試土樣采自延安市寶塔區(qū)楊家灣長期堆積牛糞和秸稈的腐殖土。

１．１．２藥品羧甲基纖維素鈉（ＣＭＣ－Ｎａ）、溴百里藍(lán)、剛果紅、3，5-二硝基水楊酸（ＤＮＳ）試劑，均為分析純。

１．１．３儀器隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０*５０－ＢＳ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、紫外分光光度計（ＵＶ－１２４０，日本島津）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江陰濱江醫(yī)療儀器廠）、氣浴式振蕩器（ＺＪＳ－１３２０，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

１．１．４培養(yǎng)基ＰＤＡ培養(yǎng)基、ＬＢ培養(yǎng)基、ＣＭＣ培養(yǎng)基［９］、剛果紅培養(yǎng)基［１０］、赫奇遜培養(yǎng)基［１１］、產(chǎn)酶培養(yǎng)基［９］。

１．２方法

１．２．１纖維素降解菌的篩選①富集：將土樣加到ＰＤＡ液體培養(yǎng)基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ，培養(yǎng)３ ｄ后取培養(yǎng)液以體積為５％的接種量接入ＰＤＡ液體培養(yǎng)基中，重復(fù)３次。②初篩：取０．５ ｍＬ富集液加入到ＣＭＣ培養(yǎng)基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ，培養(yǎng)３ ｄ后劃線分離，將得到的菌株轉(zhuǎn)接在ＬＢ斜面上，４ ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。③?fù)篩：將初篩的菌株接種到ＣＭＣ培養(yǎng)基上，選出長勢較好的菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基上，選擇透明圈大且清晰的菌株，接入經(jīng)處理過的濾紙條［１２］的赫奇遜液體培養(yǎng)基中，２８ ℃、培養(yǎng)４ ｄ后，根據(jù)濾紙的裂解程度，選出引起濾紙裂解效果較好的菌株作為下一步的試驗菌株。

１．２．２酶活力的測定①粗酶液的制備。取試驗菌株培養(yǎng)液，以體積為５％的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ、培養(yǎng)一定時間后，取適量培養(yǎng)液，４ ℃、５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，上清即為粗酶液。②酶活力定義及測定方法［１２］。酶活力定義：在ｐＨ值５．０、５０ ℃條件下，１ ｍＬ粗酶液在１ ｍｉｎ內(nèi)水解ＣＭＣ－Ｎａ生成１．０ μｇ的葡萄糖，稱為１個纖維素酶酶活力單位（μｇ／ｍｉｎ，ＩＵ）；相同條件下，１ ｍＬ粗酶液在１ ｍｉｎ內(nèi)水解濾紙（經(jīng)過去淀粉處理）生成1 μｇ葡萄糖，稱為１個濾紙酶酶活力（ＦＰＡ）單位

（μｇ／ｍｉｎ，ＩＵ）。酶活力的測定：用ＣＭＣ－Ｎａ作底物，５０ ℃恒溫水浴，粗酶液水解３０ ｍｉｎ，用ＤＮＳ法測定還原糖含量［１３］，利用還原糖的量來計算酶的活力。

２結(jié)果與分析

２．１纖維素降解菌的篩選

經(jīng)過連續(xù)３次的富集、分離純化，共得到１７株菌株；經(jīng)剛果紅培養(yǎng)基和赫奇遜培養(yǎng)基復(fù)篩后，選擇在剛果紅培養(yǎng)基上出現(xiàn)的透明圈大且清晰，在赫奇遜液體培養(yǎng)基中濾紙的裂解效果較好的８株產(chǎn)酶試驗菌株，分別為：ＴＣ－２、ＴＣ－４、ＴＣ－５、ＴＣ－６、ＴＣ－８、ＴＣ－１１、ＴＣ－１２、ＴＣ－１３。

２．２酶活力測定結(jié)果

２．２．１ 纖維素酶酶活力由圖１可知，在所有試驗菌株中，ＴＣ－１１的ＣＭＣ酶活力最大，１２ ｈ時酶活力即達(dá)到所有菌株酶活力的最大值（０．９９ ＩＵ）；菌株ＴＣ－１３到２４ ｈ時酶活力達(dá)０．７８ ＩＵ；而菌株ＴＣ－２、ＴＣ－５、ＴＣ－８的酶活力變化不大，同時這３株菌株的酶活力均低于０．１９ ＩＵ；其余３株菌株的酶活力隨培養(yǎng)時間的延長而緩慢增加。

２．２．２濾紙酶活力由圖２可知，除菌株ＴＣ－２、ＴＣ－５、ＴＣ－８外，其余５株菌株的濾紙酶活力均呈現(xiàn)隨培養(yǎng)時間的延長而增加的趨勢，到６０ ｈ時ＴＣ－１１的酶活力最大，為１．０５ ＩＵ；ＴＣ－６、ＴＣ－１２和ＴＣ－１３的酶活力也較高，為０．57～０．７1 ＩＵ。

綜合以上結(jié)果，菌株ＴＣ－１１產(chǎn)生的纖維素酶和濾紙酶都有較高的酶活力，因此，選擇該菌株作為下一步制作菌肥、分解纖維素產(chǎn)醇等研究的試驗菌株。

３討論

１）在用剛果紅培養(yǎng)基和赫奇遜培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)

篩時，由于細(xì)胞沒有裂解，胞內(nèi)酶難以釋放至細(xì)胞外，因此可能會把在胞內(nèi)產(chǎn)纖維素酶的菌株淘汰掉，利用離心法得到的粗酶液也基本上為胞外酶。因此，本試驗測定的酶活力主要為胞外酶的活性。

２）纖維素降解菌大多來自地表覆土，為好氧菌，本試驗采用的是靜置培養(yǎng)分解濾紙，試驗得到的濾紙酶活力較低的菌株可能是由于缺氧，生長不佳所致，改變?nèi)苎蹩赡軙惯@些菌株的濾紙酶活力增強(qiáng)。

３）本試驗僅是在固定條件下，對試驗菌株產(chǎn)酶的情況進(jìn)行了研究，而酶的產(chǎn)生和酶活力受諸多因素的影響。因此，得到的試驗菌株的產(chǎn)酶條件還有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 李英． 高活性纖維素降解菌產(chǎn)酶條件和酶的性質(zhì)及應(yīng)用研究［Ｄ］． 成都：四川師范大學(xué)，２００５．

［２］ 劉翔，何國慶． 利用木素纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的微生物代謝工程［Ｊ］． 糧油加工與食品機(jī)械，２００３（８）：６７－６９．

［３］ 史玉英，沈其榮，婁無忌，等． 纖維素分解菌群的分離和篩選［Ｊ］． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，１９９６，１９（３）：５９－６２．

［４］ 文少白，李勤奮，侯憲文，等． 微生物降解纖維素的研究概況［Ｊ］． 中國農(nóng)學(xué)通報，２０１０，２６（１）：２３１－２３６．

［５］ ＷＯＯＤ Ｂ Ｅ， ＢＥＡＬＬ Ｄ Ｓ， ＩＮＧＲＡＭ Ｌ Ｏ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ａｓ ａ ｃｏｐｒｏｄｕｃｔ ｗｉｔｈ ｅｔｈａｎｏｌ ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｉｌ ＫＯＩＩ［Ｊ］． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， １９９７，５５（３）：５４７－５５５．

［６］ ＺＨＯＵ Ｓ Ｄ， ＤＡＶＩＳ Ｆ Ｃ， ＩＮＧＲＡＭ Ｌ Ｏ． Ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ＣｅＩＹ（ｃｅｌＹ） ａｎｄ ＣｅＩＺ （ｃｅＩＺ） ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｃａｃｙｔｏｃａ Ｐ２［Ｊ］． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００１，６７（１）：６－１４．

［７］ ＸＩＡＯ Ｚ， ＷＡＮＧ Ｔ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ Ⅲ（ＥＧⅢ） ｇｅｎｅ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖａｓｉａｅ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２００１，４１（４）：３９１－３９６．

［８］ 吳顯榮，穆小民． 纖維素酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展及趨向［Ｊ］． 生物工程進(jìn)展，１９９４，１４（４）：２５－２７．

［９］ 夏金蘭，張瑞永，張倩，等． 一株纖維素降解菌的分離、鑒定及降解特性初步研究［Ｊ］． 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，２００８，

３1（４）：８６－９０．

［１０］ 盧月霞，尹會蘭，黃慧敏，等． 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及其相互作用研究［Ｊ］． 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，２０１０（１）：５９－６２．

［１１］ 高春，孟建宇，馮福應(yīng)． 纖維素降解菌的分離篩選及酶活研究［Ｊ］． 畜牧與飼料科學(xué)， ２００８（４）：１７－２０．

［１２］ 魏桃員，張素琴，邵林廣，等． 一株纖維素降解細(xì)菌的分離及特性研究［Ｊ］． 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，２００４，２７（５）：１－２．

［１３］ 王玉萬，徐文玉． 木質(zhì)纖維素固體基質(zhì)發(fā)酵物中半纖維素、纖維素和木素的定量分析程序［Ｊ］． 微生物學(xué)通報，１９８７，１４（２）：８１－８４．