猴痘病毒PCR檢測(cè)方法的建立

張 睿，陳國(guó)強(qiáng)，張敬友，朱 娜，蔣 原，姜 焱，唐泰山

（江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南京 210001）

1958年，人們就已在實(shí)驗(yàn)獼猴中發(fā)現(xiàn)猴痘病毒[1]。自1970年首次報(bào)導(dǎo)扎伊爾地區(qū)出現(xiàn)人的猴痘病例以后，非洲中西部雨林國(guó)家都有零星病例發(fā)生[2]，特別是1996年2月至1997年10月在剛果發(fā)生了有史以來(lái)的最大的一次疫情暴發(fā)，確診病例達(dá)511人[3-4]，2003年5月美國(guó)威斯康星州報(bào)導(dǎo)有猴痘病例的發(fā)生[5-6]，至此猴痘引起了人們的高度關(guān)注。

猴痘是動(dòng)物傳播的一種以皮膚出疹為特征的熱性病毒性疾病，通過(guò)直接密切接觸，可由動(dòng)物傳染給人，并可在人與人之間傳染，屬人畜共患傳染病。猴痘病毒檢測(cè)方法有血清學(xué)方法，但猴痘病毒與痘病毒之間存在抗原交叉，特異性不夠，不能準(zhǔn)確檢測(cè)猴痘病毒，此外還有病原分離方法，但檢測(cè)周期太長(zhǎng)，且猴痘病毒被分類為生物安全Ⅲ級(jí)生物因子，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求極高。因此，兩種方法在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性。利用PCR方法對(duì)猴痘病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，快速僅需幾小時(shí)即可得到結(jié)果，國(guó)外也已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)[7-10]，但國(guó)內(nèi)就此方面的報(bào)道還為數(shù)不多。本試驗(yàn)旨在建立更敏感和特異的猴痘病毒PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

猴痘陽(yáng)性模板為人工合成的MPV（AF380138）F3L基因片段（48 048~48 509 bp），插入質(zhì)粒pUC57，由南京生興生物技術(shù)公司合成。小鼠出血熱病毒、小鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、鼠痘病毒、鼠仙臺(tái)病毒、鼠肝炎病毒、鼠肺炎病毒、呼腸孤病毒、腦脊髓炎病毒、多瘤病毒、細(xì)小病毒、猴皰疹病毒Ⅰ型、羊痘、雞痘、鴿痘等滅活病毒，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化室。

Taq酶、dNTP Mixture、溴化乙錠（EB）、Marker DL-2000、瓊脂糖等試劑均由Takara公司生產(chǎn)；PCR凝膠回收試劑盒、HincⅡ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連Takara公司 。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)猴痘陽(yáng)性模板的序列，利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成。合成的引物用雙蒸水稀釋至10 pmol/μL，-20℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增目的片段為301 bp，引物序列如下。

上游引物：5'TTCCGTCAATGTCTACACAGGCA 3'；

下游引物：5'TACAGTTCCGACGATACTCCTC C 3'。

1.3 DNA提取

取陰性對(duì)照滅活病毒200μL，加入400μL裂解液、600μL的酚/氯仿混合液混勻，4℃12 000 r/min離心3~5 min；取上清加入600μL的氯仿混勻，4℃12 000 r/min離心5 min；取上清；加入0.8倍體積的異丙醇混勻，4℃10 000 r/min離心10 min，盡量?jī)A去上清液；加入70%乙醇洗滌，離心3~5 min，晾干后加入50μL TE溶解沉淀。

1.4 質(zhì)粒濃度的測(cè)定

取4μL提取的質(zhì)粒，加入96μL的蒸餾水對(duì)待測(cè)的樣品進(jìn)行稀釋，以蒸餾水作為空白，在波長(zhǎng)260 nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零。加入質(zhì)粒的稀釋液，測(cè)定260 nm處的吸光值，記錄OD260的值通過(guò)計(jì)算確定濃度dsDNA=50×OD260×稀釋倍數(shù)（濃度單位為：mg/mL）。

1.5 PCR反應(yīng)

采用 20μL 的反應(yīng)體系：2μL 10×buffer、0.4μL的25 mmol/LMgCl2、0.2μLTaq DNA聚合酶、上下游引物各 0.4μL、0.4μL 2.5 mmol/L dNTP、模板 0.5μL，用雙蒸水補(bǔ)至20μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min后；95℃1 min，51℃1 min，72℃1 min共 35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。

1.6 PCR產(chǎn)物鑒定及序列測(cè)定

根據(jù)設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增序列，利用premier 5.0軟件進(jìn)行酶切位點(diǎn)的分析，其中HincⅡ?yàn)閱蚊盖形稽c(diǎn)，所以采用此酶進(jìn)行酶切分析。預(yù)期酶切成179 bp和122 bp 2個(gè)DNA片段。并同時(shí)將PCR產(chǎn)物送大連寶生物工程公司測(cè)序并用DNAstar軟件分析。

1.7 敏感性

取陽(yáng)性模板質(zhì)粒4μL并按上面的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)出其質(zhì)粒濃度為59.3 ng/μL，并將陽(yáng)性模板作10倍系列稀釋，按照上述的方法分別取各稀釋度的陽(yáng)性模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)靈敏性。

1.8 特異性

按上述試驗(yàn)方法提取雞痘等滅活病毒的DNA，在相同的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定其特異性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

經(jīng)過(guò)對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、退火溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化后，用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)目的片段大小一致的特異性條帶（圖1）。

2.2 PCR產(chǎn)物酶切鑒定結(jié)果

用HincⅡ進(jìn)行酶切分析，得到與預(yù)期一致的179 bp和122 bp 2個(gè)DNA片段（圖2）。

2.3 敏感性

將陽(yáng)性模板作10倍系列稀釋，分別取各稀釋度的陽(yáng)性模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色檢測(cè)靈敏性。結(jié)果表明PCR檢測(cè)方法可檢測(cè)的下限為0.3 pg（圖3）。

2.4 特異性

分別提取雞痘等滅活病毒的DNA，在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)除猴痘模擬陽(yáng)性模板出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶外，其它病毒均沒(méi)有擴(kuò)增條帶（圖4）。

2.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與GenBank的F3L片段基因核苷酸序列完全一致，同源性達(dá)到100%。

3 討論

猴痘是一種以皮膚出疹為特征的病毒性疾病，雖然在我國(guó)至今尚無(wú)猴痘的報(bào)道，但未雨綢繆，做好技術(shù)儲(chǔ)備，很有必要。因此在我國(guó)發(fā)展一種快速特異的猴痘病毒感染的分子診斷方法，對(duì)預(yù)防和控制猴痘病毒的傳入有重要意義。限于我國(guó)尚無(wú)猴痘病毒的毒種，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11-12]人工合成了含特異檢測(cè)猴痘病毒靶基因的F3L片段，并插入質(zhì)粒，作為猴痘病毒檢測(cè)的模擬陽(yáng)性模板。

本文就針對(duì)F3L片段序列分別設(shè)計(jì)出特異性引物，建立了可對(duì)猴痘病毒進(jìn)行快速診斷與檢測(cè)的PCR方法。該方法具有快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果和酶切結(jié)果均證實(shí)了PCR反應(yīng)的特異性。在日常檢測(cè)中的應(yīng)用酶切試驗(yàn)，可確保PCR檢測(cè)結(jié)果的特異性。該方法的建立將有助于猴痘病的快速檢測(cè)。

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