熱老化對柞蠶絲蛋白二級結構的影響

李歡歡，傅吉全

(北京服裝學院 材料科學與工程學院，北京 100029)

熱老化對柞蠶絲蛋白二級結構的影響

李歡歡，傅吉全

(北京服裝學院 材料科學與工程學院，北京 100029)

利用ATR-FTIR光譜技術和紅外光譜去卷積擬合計算蛋白質(zhì)二級結構百分含量，研究熱老化對柞蠶絲纖維二級結構的影響，并用XRD技術分析測定了老化后柞蠶絲的結晶度。結果表明：一定溫度下，隨著老化時間的延長，柞蠶絲β-sheet結構的相對百分含量下降，而α-helix結構和Random結構的相對百分含量上升；老化溫度越高，柞蠶絲破壞的速度越快，β-sheet結構的相對百分含量下降得也越快，結晶度下降得也更加明顯。

柞蠶絲；熱老化；傅里葉紅外光譜；二級結構

柞蠶絲是中國特有的天然紡織原料，它是一種天然蛋白質(zhì)纖維，容易受酸、堿、光、熱等環(huán)境因素的影響而老化，導致柞蠶絲產(chǎn)品很難長期保存。因此，對柞蠶絲纖維老化過程的研究，是防止和延緩其老化的理論基礎，對柞蠶絲的保護有著重要的意義。

目前很多學者從力學性能、黃變和結晶度的角度，定性分析了環(huán)境溫度的升高對于蠶絲纖維的老化影響：周靜潔等[1]通過熱老化對桑蠶絲力學性能和結晶度的影響研究，證明了熱老化會使桑蠶絲黃變失重，力學性能下降，并且在一定時間內(nèi)會破壞其結晶區(qū)；武宜鳴等[2]通過熱老化對天蠶絲的影響研究，進一步證明，熱老化是先發(fā)生在天蠶絲纖維非結晶區(qū)而后進入結晶區(qū)的。但對于柞蠶絲纖維經(jīng)熱老化后其絲蛋白二級結構的變化研究，國內(nèi)鮮有報道。本研究借鑒計算機擬合技術，通過紅外光譜分析，半定量討論了環(huán)境溫度升高對柞蠶絲蛋白二級結構的影響。

研究絲纖維蛋白二級結構在老化過程中的變化，紅外光譜和X射線衍射光譜是2種有效手段，也是目前研究最為廣泛采用的方法。其中，X射線衍射光譜可以通過結晶度指數(shù)評估老化過程，而紅外光譜，隨著20世紀80年代末期Susi[3]和Byler[4]將紅外光譜的二階導數(shù)理論應用于蛋白質(zhì)二級結構的研究，之后又將去卷積的方法應用于蛋白質(zhì)二級結構分析，使得紅外光譜開始進入了定量化分析階段。90年代末，Giuliano等[5]用紅外光譜分析得出一定溫度條件下，柞蠶絲絲素膜蛋白的二級結構發(fā)生從Random結構到β-sheet結構的轉(zhuǎn)變。最近，陳華鋒等[6]利用二階導數(shù)法研究了古代絲綢蛋白質(zhì)的二級結構，半定量分析了古代絲綢和現(xiàn)代絲綢中絲蛋白β-sheet結構和Random結構百分含量的區(qū)別。由此可見，紅外二階導數(shù)技術可以半定量分析二級結構的含量，為了解蠶絲蛋白二級結構提供了很好的技術基礎，可以更深入地研究蠶絲的老化機理。

1 試 驗

1.1 材料及儀器設備

材料：市售脫膠白色柞蠶絲。

儀器設備：DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(美國尼高力Nicolet iS10型，smart–ITR附件)，掃描范圍4 000～500 cm-1，以波數(shù)為橫坐標，以吸光度為縱坐標，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為64次；X射線粉末衍射儀(理學D/max-rb和飛利浦X’Pert MDP型)，Cu靶，管壓40 kV，管流50 mA，λ＝1.540 6 nm)，測試衍射角范圍為：5°～45°，掃描步長0.02(°)/s，掃描速度6(°)/min。

1.2 樣品制備過程

在鼓風烘箱中，將柞蠶絲在80，110，140，170，200 ℃條件下烘干24 h，取出分析。重新調(diào)節(jié)烘箱溫度，將柞蠶絲在80 ℃的條件下，老化30 d。

2 結果分析

2.1 紅外光譜定性分析

分子處于一定的能態(tài)下，分子本身在不停地運動，構成分子的原子相對于鍵的平衡位置在不斷振動，當絲纖維試樣受到紅外光的照射時，絲纖維分子吸收一部分能量轉(zhuǎn)變?yōu)檎駝幽芎娃D(zhuǎn)動能，從而產(chǎn)生了分子的躍遷，引起分子偶極矩的變化，使得譜帶上某些波長的紅外光強度發(fā)生變化，得到紅外吸收光譜[7]。

很多學者對蠶絲的紅外光譜進行了相關研究，使得柞蠶絲的各個紅外吸收峰有了較明確的歸屬。目前比較統(tǒng)一的說法為：柞蠶絲在3 300～3 290 cm-1處有—NH伸縮振動所產(chǎn)生的特征吸收，主要代表沒有形成氫鍵的自由的—NH的振動，為較強的—OH吸收峰；1 575～1 480 cm-1處有—NH變形振動所產(chǎn)生的特征吸收譜帶，主要代表形成氫鍵的—NH的振動，為酰胺Ⅱ帶特征峰；1 690～1 600 cm-1處有C＝O伸縮振動所產(chǎn)生的特征吸收譜帶，為酰胺Ⅰ帶特征峰；1 301～1 229 cm-1處有—CN和—NH的伸縮、彎曲振動所產(chǎn)生的吸收譜帶，為酰胺Ⅲ帶特征峰[8-9]。

將柞蠶絲纖維原樣和熱老化處理后的樣品分別做紅外分析。圖1為柞蠶絲未老化樣品和經(jīng)過80 ℃熱老化處理后的樣品出現(xiàn)主要信號峰波數(shù)范圍內(nèi)的紅外譜圖。圖2為柞蠶絲在不同溫度下老化24 h，樣品出現(xiàn)主要信號峰波數(shù)范圍內(nèi)的紅外譜圖。從圖中可以看出，隨老化時間延長，3 272 cm-1吸收峰和1 513 cm-1(酰胺Ⅱ帶)吸收峰強度有所下降；而柞蠶絲的特征吸收譜帶964 cm-1吸收峰的強度也有所下降；同時代表酪氨酸的酚羥基的振動吸收峰1 167 cm-1的強度變小，說明酪氨酸等大分子側(cè)基與主鏈切斷，有資料顯示[10]，酪氨酸側(cè)基的變化是造成柞蠶絲纖維黃變的主要原因；酰胺Ⅴ帶代表N—H彎曲振動的690 cm-1處的紅外吸收峰，吸收峰面積變寬。隨老化溫度升高，紅外信號峰也會出現(xiàn)上述變化。以上數(shù)據(jù)與文獻中的描述大致相符[11]，說明熱老化到一定程度已經(jīng)使得大分子鏈與主鏈斷裂[12]，自由的—NH增加，而形成氫鍵的—NH減少，導致其黃變，并且結晶區(qū)部分遭到破壞。

圖1 柞蠶絲80 ℃老化樣品隨時間變化紅外光譜Fig.1 Infrared spectrum of the samples at 80 ℃with time change

圖2 柞蠶絲熱老化24 h樣品隨溫度變化紅外光譜Fig.2 Infrared spectrum of the 24 h thermal aging samples with temperature change

從以上可以定性地看出，柞蠶絲隨環(huán)境溫度升高而老化，但是具體絲纖維的結構發(fā)生了哪些變化還不得而知，為了進一步地探討柞蠶絲在熱老化過程中二級結構的變化，需要對其紅外譜圖做進一步分析。

2.2 二級結構分析

目前用于紅外譜圖分析二級結構的方法，主要有因數(shù)分析法(FA)、奇值分析法(SVD)、傅里葉去卷積法(FSD)、二階導數(shù)法(SD)及曲線擬合[13]等，本研究主要應用了FSD、SD及曲線擬合法。首先將紅外譜圖利用傅里葉去卷積技術解析重疊峰，使得信號峰形變窄，并且保持峰的位置和面積不發(fā)生變化[14]。再利用OMNIC V8.0數(shù)據(jù)處理軟件校正基線，最后采用ORIGIN 8.0數(shù)據(jù)處理軟件選用Causse函數(shù)對二階導數(shù)譜和傅里葉去卷積譜圖進行曲線擬合，使得殘差最小，并根據(jù)積分面積計算各二級結構的相對百分含量。

絲纖維的紅外吸收光譜主要由一系列的酰胺帶組成，其中酰胺Ⅰ(1 700～1 600 cm-1)為紅外吸收強峰，對二級結構的研究最有影響，但是由于水在1 640 cm-1附近有較強的吸收峰，所以對其準確定量會造成很大的影響。而酰胺Ⅲ(1 330～1 220 cm-1)帶雖然信號較弱，但是水在此吸收帶沒有吸收，并且二級結構的光譜性質(zhì)特征明顯[9]。因此本文主要研究了經(jīng)熱老化后，柞蠶絲纖維酰胺Ⅲ帶的分子構象變化。

將老化處理后樣品的紅外吸收譜圖酰胺Ⅲ帶去卷積，并且根據(jù)二階導數(shù)的峰位置對去卷積譜進行高斯擬合，結果如圖3、圖4所示。由于1 218 cm-1和1 340 cm-1分別對應較強的峰位置，為使擬合相對準確，選取擬合范圍1 340～1 190 cm-1，將此二峰一并擬合，但是計算絲纖維蛋白質(zhì)二級結構時不計入此峰[15]。

圖3 80 ℃條件下酰胺Ⅲ帶Guassian擬合結果Fig.3 Gaussian fi tting chart of silk amide Ⅲ at 80 ℃

圖4 不同溫度下酰胺Ⅲ帶Guassian擬合結果Fig.4 Gaussian fi tting chart of silk amide Ⅲ at different temperatures

柞蠶絲經(jīng)80 ℃條件下老化的紅外譜圖擬合結果為圖3所示。從圖3可以看出，在酰胺Ⅲ帶中，隨著老化時間延長，歸屬于β-sheet結構的1 235cm-1[16]峰，擬合后吸收峰的面積逐漸減小，并且峰的位置有向大波數(shù)移動的趨勢；歸屬于Random結構的1 260 cm-1峰，擬合后吸收峰的面積逐漸變大；歸屬于α-helix結構的1 305 cm-1峰，擬合后吸收峰的強度有所增大。圖4為柞蠶絲在24 h內(nèi)隨溫度升高，酰胺Ⅲ帶內(nèi)歸屬于不同結構的吸收峰的擬合結果。從圖4可以看出，在80 ℃和110 ℃的條件下，歸屬于各個結構的吸收峰的面積未發(fā)生明顯變化，也未發(fā)生峰位置的明顯移動；但是當溫度繼續(xù)升高(140 ℃以上)的時候，β-sheet結構的歸屬峰面積明顯下降，而相對的Random結構的歸屬峰的面積開始變大，α-helix結構的歸屬峰強度也開始變大。

經(jīng)老化處理后的絲纖維二級結構百分含量的具體變化見表1/表2。表1為80 ℃條件下柞蠶絲被老化后各結構百分含量的變化，從表1可以看出，柞蠶絲的β-sheet結構相對百分含量由于熱老化的影響而下降，α-helix結構和Random結構相對百分含量相對升高。在老化10 d之后，變化開始明顯。從擬合數(shù)據(jù)可以看出隨著老化時間延長，熱老化作用逐漸開始破壞β-sheet結構，斷裂分子間的氫鍵，將β-sheet結構分解破壞成Random結構和α-helix結構，使得β-sheet結構的相對百分含量發(fā)生下降，Random結構的相對百分含量發(fā)生明顯上升。而且在老化前期，β-sheet結構的相對百分含量變化并不明顯，說明在熱老化初期，主要破壞排列不整齊結構疏松非結晶區(qū)，并未進攻到以β-sheet結構為主的結晶區(qū)[17]。由表2可見，在同樣的老化時間內(nèi)(24 h)，140 ℃以上就會導致β-sheet結構的百分含量明顯下降，Random結構的百分含量明顯上升。將表1和表2中的β-sheet結構百分含量的變化數(shù)據(jù)進行綜合比較后發(fā)現(xiàn)，當溫度達到200 ℃的時候，24 h就已經(jīng)開始破壞結晶區(qū)，導致β-sheet結構相對百分含量明顯下降，破壞程度與柞蠶絲在80℃條件下老化30 d相似。說明熱老化溫度越高，柞蠶絲的老化速度越快，破壞結晶區(qū)的能力越強，導致其β-sheet結構相對百分含量下降得也越快。

表1 80℃熱老化柞蠶絲蛋白二級結構相對百分含量 %Tab.1 Percentages content of thermal aging tussah silk protein at 80 ℃

表2 熱老化24 h柞蠶絲蛋白二級結構相對百分含量 %Tab.2 Percentages content of 24 h thermal aging tussah silk protein

通過FTIR二級結構分析可以看出，在一定的溫度范圍內(nèi)，熱老化會導致柞蠶絲β-sheet結構的百分含量下降，隨時間延長，這種破壞更加明顯。由于β-sheet結構在很大程度上組成了蠶絲纖維蛋白的結晶區(qū)域[18]，那么若β-sheet結構的百分含量會發(fā)生變化，絲纖維的結晶度也會發(fā)生相應變化。

柞蠶絲在80 ℃條件下，隨時間變化的XRD譜圖如圖4所示。從圖4可以看出，柞蠶絲纖維蛋白特征衍射峰2θ＝17.1，20.4, 24.5和34.4的吸收峰[19]，隨老化時間延長未發(fā)生明顯變化，說明蠶絲蛋白的結晶種類未發(fā)生變化。但是，蠶絲纖維的特征吸收峰強度隨時間延長發(fā)生了變化，說明樣品的結晶度大小發(fā)生了變化。經(jīng)過D/Max圖形處理系統(tǒng)分峰后，柞蠶絲80 ℃老化樣品結晶度分別為：41.9%(未老化)，41.5%(5 d)，40.7%(10 d)，36.3%(20 d)，30.9%(30 d)。表明隨老化時間延長結晶度下降，在老化初期結晶度變化并不明顯，10 d之后，柞蠶絲樣品的結晶度開始比較明顯地下降，說明熱老化已經(jīng)侵入到結晶區(qū)了。結晶度在10 d之后發(fā)生明顯下降，說明β-sheet結構的百分含量也會下降，這與以上FTIR分析二級結構的結構是相符的。

圖4 柞蠶絲80 ℃老化樣品隨時間變化XRD譜圖Fig.4 X-ray diffraction patterns of the samples at 80 ℃ with time change

3 結 語

利用紅外光譜技術分析了柞蠶絲熱老化樣品的二級結構變化，并且對部分樣品進行了結晶度分析。結果表明在一定溫度下，老化時間延長會導致柞蠶絲蛋白β-sheet結構的相對百分含量下降，而Random結構和α-helix結構的相對百分含量上升，經(jīng)結晶度分析發(fā)現(xiàn)，上述變化在結晶度發(fā)生大幅度下降時表現(xiàn)得更明顯；在一定時間內(nèi)，老化溫度越高，β-sheet結構的相對百分含量下降越明顯，對蠶絲結構破壞的速度越快，破壞程度越大。

[1] 周靜潔，林紅，陳宇岳，等.熱處理對桑蠶絲纖維結構與性能的影響[J].南通大學學報：自然科學版，2007，6(1)：55-61.

[2] 武宜嗚，安琳，朱文俊.熱處理對天蠶絲結構與性能的影響[J].國際紡織導報，2010(1)：26-28.

[3] SUSI H, BYLER D M.Protein structure by fourier transform infrared spectroscopy：second derivative spectra[J].Biochem Biophys Res Commun .1983, 115(1): 391-397.

[4] BYLER D M. SUSI H.Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra[J].Biopolymers.1986, 25(2): 469-487.

[5] GIULIANO F, PATRIZIA M, MASANOBU N. Structure and molecular conformation of tussah silk fi broin fi lms[J].Journal of Applied Polymer Science ,1997(35): 841-847.

[6] 陳華鋒，龔德才，劉博.二階導數(shù)二階導數(shù)紅外光譜分析遼代絲綢的降解特征[J].絲綢，2011，48(1)：1-4.

[7] 王炳強.儀器分析-光譜與電化學分析技術[M].北京：化學工業(yè)出版社，2010：19-32.

[8] 高紅艷，許強，楊志懷.FT-IR在研究蛋白質(zhì)二級結構中的應用[J].寶雞文理學院學報：自然科學版，2009，29(3)：47-53.

[9] 周文，陳新，邵正中.紅外和拉曼光譜用于對絲蛋白構象的研究[J].化學進展，2006，18(11)：1514-1522.

[10] 鄭今歡，邵建中，劉今強.蠶絲絲素纖維中氨基酸在絲素纖維的徑向分布研究[J].高分子學報，2002(6)：818-823.

[11] 張曉梅，原思訓.老化絲織品的紅外光譜分析研究[J].光譜學與光譜分析，2004，24(12)：1528-1532.

[12] 張曉梅，黃潔，原思訓.絲織品在老化過程中及老化后在水、乙醇、丙酮中的失重行為[J].文物保護與考古科學，2004，16(1)：13-20.

[13] 盧雁，張瑋瑋，王公軻.FTIR用于變性蛋白質(zhì)二級結構的研究進展[J].光譜學與光譜分析，2008，28(1)：88-93.

[14] 張聚華，傅吉全，李秀艷.柞蠶絲織物水解老化過程的結構分析[J].北京服裝學院學報：自然科學版，2010，31(2)：28-35.

[15] GRIEBENOWA K, SHIOYA M. Characterization of microvoids in mulberry and tussah silk fibers using stannic acid treatment [J]. Journal of Applied Polymer Science ,1999(73):363-367.

[16] BYLER D, BROUILLETTE J.Quantitative studies of protein structure by FTIR spectra deconvolution and curve- fi tting[J].Spectroscopy, 1986,1(3):29-32.

[17] 王芳芳，傅吉全.柞蠶絲纖維人工加速老化損失研究[J].北京服裝學院：自然科學版，2009，29(4)：38-43.

[18] ZHOU C Z, CONFALONIER F, JACQUET M. Silk fi broin:structural implications of a remarkable amino acid sequence [J].Proteins,2001(4): 119-122.

[19] 張曉梅，原思訓.利用X射線衍射光譜研究絲織品的老化[J].文物保護與考古科學，2010，30(1)：262-265.

Effects of heat aging on the secondary structure of tussah silk protein

LI Huan-huan, FU Ji-quan
(School of Materials Science & Engineering, Beijing Institute of Fashion Technology, Beijing 10029, China)

With the technology of ATR-FTIR spectroscopy and the approaches of Fourier self-deconvolution fitting to calculate quantitatively the percentage of the secondary structure of protein, the effects of heat aging on the secondary structure of tussah silk protein was investigated in this paper, combined with the analysis of the crystallinity of tussah silk by X-ray diffraction. The results showed that: under certain temperature, the β-sheet structure of silk percentage content will decrease, while the percentage content of α-helix structure and Random structure will increase, with the prolonged aging; the higher of temperature, the faster of decrease of β-sheet structure percentage content, and the more obvious decline in crystallinity will occur.

Tussah silk; Heat aging; Fourier transform infrared spectroscopy; Secondary structure

TS102.332

A

1001-7003(2011)11-0008-04

2011-07-10；

2011-09-28

北京市教育委員會資金支持項目(KM20080012003)

李歡歡(1987－ )，女，碩士研究生，研究方向為絲織品老化機理。通訊作者：傅吉全，教授，fujq010@sina.com。