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    p16基因在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中甲基化的研究

    2011-11-15 07:38:00范昭葉靜龍霞張信
    實(shí)用癌癥雜志 2011年1期
    關(guān)鍵詞:浸潤性細(xì)胞周期甲基化

    范昭 葉靜 龍霞 張信

    腫瘤表觀遺傳學(xué)是一門新興科學(xué),主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、基因組印跡和非編碼RNA調(diào)控等幾個(gè)方面。其中,DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)。近年來,日益增多的研究表明腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移與DNA甲基化密切相關(guān)。p16基因作為抑癌基因,其第1外顯子5'啟動子區(qū)域CpG島的甲基化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法(methylation-specific PCR,MSP),檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及乳腺非癌組織中p16基因的甲基化狀態(tài),以探討p16基因甲基化在乳腺癌發(fā)生中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    收集我院甲狀腺乳腺外科2007年3~10個(gè)月,手術(shù)切除的新鮮乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織共42例,作為癌癥組;對照組為21例乳腺良性病變旁正常乳腺組織,包括纖維腺瘤19例和乳管內(nèi)乳頭狀瘤2例,此外,對照組還包括癌旁正常乳腺組織3例。所有病例均為女性,年齡19~70歲,平均35.6歲,術(shù)前均未接受過放化療,并經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí),-80℃速凍保存。

    1.2 方法

    1.2.1 組織DNA提取 按照QIAamp DNA Mini Kits 51304試劑盒(Qiagen公司)說明書進(jìn)行操作,紫外分光光度儀檢測其含量和純度。

    1.2.2 甲基化修飾 所有標(biāo)本DNA均取1.0μg進(jìn)行甲基化修飾,操作流程參照CpGenome TM DNA Modification Kit S7820(Chemicon公司)甲基化試劑盒說明書,修飾后的DNA分裝儲存。

    1.2.3 MSP擴(kuò)增 PCR反應(yīng)試劑盒為2×PCR Master mix K0171(Fermentas公司):2×PCR Master mix 12.5 μl,上下游引物各 1 μl(10 pmol/μl),甲基化后的DNA2 μl,用水補(bǔ)至 25 μl。p16 基因擴(kuò)增采用巢式PCR,第一輪PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,循環(huán) 35 個(gè)周期后,最后 72℃ 延伸 8 min。巢式 PCR引物,F(xiàn):5'-GAAGAAAGAGGAGGGTTGG-3',R:5'-CTACAAAC CCTCTACCCACC-3'。取 PCR 產(chǎn)物 0.3 μl做第二輪PCR,p16(甲基化與非甲基化)擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)30個(gè)周期,最后72℃延伸8 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。p16甲基化引物,MF:5'-TTATTAGAGG GTGGGGCGGATCGC-3',MR:5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3',片段大小為 150 bp;非甲基化引物,UF:5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3',UR:5'-CAACCCCAAACCA CAACCATAA-3',片段大小為151 bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS13.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,應(yīng)用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    42例散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中,有18例檢測到p16基因啟動子甲基化,甲基化率為42.9%;24例乳腺非癌組織中檢測到2例(均為乳腺纖維腺瘤)甲基化,甲基化率為8.3%;其中3例癌旁正常組織甲基化均為陰性,對應(yīng)的癌組織有2例甲基化陽性,1例甲基化陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p16基因啟動子的甲基化率乳腺癌組與非癌組比較差異有顯著性(χ2=8.619,P <0.05),見圖 1。

    圖1 p16基因在乳腺癌和非癌組織中的甲基化情況

    3 討論

    乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與細(xì)胞周期調(diào)控異常密切相關(guān),特別是G1期相關(guān)的各種因子,包括正向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶;負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白依賴性因子、抑癌基因產(chǎn)物,這些蛋白可以獨(dú)立或協(xié)同促進(jìn)或抑制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。p16基因是人類發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因,屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因家族,是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控基因。p16蛋白能與周期蛋白競爭結(jié)合細(xì)胞周期素依賴酶(CDK4、6),從而抑制細(xì)胞周期素D與CDK復(fù)合物的活性,阻止細(xì)胞進(jìn)入G1/S期,對細(xì)胞周期起反向調(diào)節(jié)作用,抑制細(xì)胞的分裂與增殖。若失去p16蛋白的抑制作用,細(xì)胞會異常增生、分裂,最終失去控制,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

    研究證實(shí)在原發(fā)性腫瘤中p16基因突變、缺失率相對較低,而甲基化發(fā)生頻率很高?;虍惓<谆侨祟惸[瘤早期發(fā)生的1個(gè)重要事件,p16基因甲基化存在于大多數(shù)腫瘤中,如子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、肺癌及白血病中都有報(bào)道。Wong等[2]采用MSP方法,對48例乳腺癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行檢測,p16基因甲基化率為27.1%,有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的甲基化率高于無轉(zhuǎn)移的甲基化率。發(fā)生甲基化的標(biāo)本p16蛋白失表達(dá)率高于非甲基化病例,認(rèn)為p16基因超甲基化是乳腺癌中常見的分子生物學(xué)改變之一,其超甲基化和乳腺癌浸潤及轉(zhuǎn)移有相關(guān)性;甲基化是p16基因失活的主要方式之一。但該研究沒有對非癌組織進(jìn)行甲基化檢測。在Jing等研究中同樣證明了乳腺癌中p16基因超甲基化是其mRNA和蛋白失表達(dá)的主要原因[3]。隨后,Dominguez等[4]和 Munot等[5]也采用 MSP 方法對大量乳腺癌患者進(jìn)行p16基因的甲基化檢測,甲基化率分別為19%(19/100)和 50%(100/200)。Vallian 等[6]采用MSP和重復(fù)序列PCR(PCR-REP)2種方法,對伊朗乳腺癌患者進(jìn)行p16基因甲基化檢測,甲基化率分別為35.7%和40%,2種方法研究結(jié)果相差不大,他們認(rèn)為在伊朗乳腺癌患者中p16基因超甲基化是早期常見的事件,可將p16基因甲基化狀態(tài)用在伊朗乳腺癌患者診斷和治療上。在我們研究中,p16基因在散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中甲基化率為42.9%,與大多數(shù)研究結(jié)果一致。我們在24例乳腺非癌組織中除了2例乳腺纖維腺瘤檢測出甲基化,其余均未發(fā)生甲基化,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明p16基因甲基化對于乳腺癌的臨床早期診斷具有一定指導(dǎo)意義。由于收集的癌組織標(biāo)本均為浸潤性導(dǎo)管癌,并且多數(shù)為Ⅰ期,故未進(jìn)行甲基化與臨床病理特性相關(guān)性分析。

    近年來,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿中存在來源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA,在癌癥發(fā)生過程中涉及一系列基因突變及甲基化的改變,為診斷提供分子標(biāo)記。血漿DNA具有取材方便和無創(chuàng)性等特點(diǎn),通過檢測這些分子標(biāo)記為腫瘤的早期診斷及病情監(jiān)控提供可行性。p16基因在乳腺癌患者外周血中甲基化檢測的研究也有報(bào)道。同時(shí)收集61例乳腺癌患者血漿與相應(yīng)組織標(biāo)本,應(yīng)用MSP技術(shù),檢測p16基因甲基化狀態(tài)。61例乳腺癌患者血漿和相應(yīng)癌組織中,p16基因的甲基化檢出率分別為44.3%和46.2%,兩者檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[7]。Feng等[8]研究檢測到 p16基因在散發(fā)性乳腺癌患者血漿標(biāo)本中甲基化率為25.4%,與相應(yīng)癌組織標(biāo)本中甲基化率28.6%相差不大,進(jìn)一步說明p16基因很可能成為乳腺癌診斷的分子標(biāo)記物,具有臨床應(yīng)用的價(jià)值。

    [1]Bian YS,Osterheld MC,F(xiàn)ontolliet C,et al.p16 inactivation by methylation of the GDKN2A promoter occurs early during neop1astic pmgression in Barrett’s esophagus〔J〕.Gastroente-rology,2002,l22(4):1113.

    [2]Wong SC,Chan J K,Lee K C,et al.Differential expression of p16/p21/p27 and cyclin D1/D3,and their relationships to cell proliferation,apoptosis,and tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.J Pathol,2001,194(1):35.

    [3]Jing F,Jun L,Yong Z,et al.Multigene methylation in serum of sporadic Chinese female breast cancer patients as a prognostic biomarker〔J〕.Oncology,2008,75(1-2):60.

    [4]Dominguez G,Silva J,Garcia JM,et al.Prevalence of aberrant methylation of p14ARF over p16INK4a in some human primary tumors〔J〕.Mutat Res,2003,530(1 ~2):9.

    [5]Munot K,Bell SM,Lane S,et al.Pattern of expression of genes linked to epigenetic silencing in human breast cancer〔J〕.Hum Pathol,2006,37(8):989.

    [6]Vallian S,Sedaghat M,Nassiri I,et al.Methylation status of p16INK4A tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(8):991.

    [7]今 毅,謝 文,余小萍,等.乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的定量分析〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(11):1024.

    [8]Feng J,Hu LH,Lu J,et al.Diagnostic value of BRCA1 and p16 gene methylation in sporadic breast cancer〔J〕.Chin J Cancer,2009,28(4):436.

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