宮頸癌組織中CD146和MMP-14表達(dá)的意義及相關(guān)性分析

朱 燕 楊其昌 劉宏斌 劉曼華 張曉娟 沈 屹

黏附分子CD146(Mel-CAM)是新近發(fā)現(xiàn)的新生血管標(biāo)志物，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，其過度表達(dá)能促進(jìn)腫瘤血管生成及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellularmatrix，ECM)及基膜(basementmembrane，BM)成分，是促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的1種重要的酶類，其中主要成員有MMP-14等。本文通過檢測CD146、MMP-14在宮頸鱗癌中聯(lián)合表達(dá)情況，旨在探討它們在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院1998年～2008年手術(shù)切除的82例宮頸鱗癌標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，該組患者術(shù)前均未給予化療和放療，年齡32～81歲，中位年齡53歲。按照Broders分類標(biāo)準(zhǔn)分類［1］:鱗癌Ⅰ級 24 例(29.27%);Ⅱ級33 例(40.24%);Ⅲ級 25 例(30.49%)。按照 FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期［2］:Ⅰ期 +Ⅱ期 61例(74.39%)，Ⅲ期 +Ⅳ期 21 例(25.61%)。按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組:無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例(75.61%);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例(24.39%)。參照文獻(xiàn)方法［3］，82 例宮頸癌按間質(zhì)浸潤情況分組:侵及或未侵及淺肌層25例(30.49%);侵至深肌層 57例(69.51%)。收集同期慢性宮頸炎24例及CIN 48例(CINⅡ級27例，Ⅲ級21例)作為對照組。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診。

1.2 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)處理，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)SP法染色，鼠抗人單克隆抗體CD146(工作濃度1∶30)、MMP-14(工作濃度1∶60)均購自北京中杉金橋生物有限公司。用 PBS液取材一抗作為陰性對照，用試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

CD146陽性表達(dá)呈棕黃色細(xì)顆粒，主要定位于癌及癌旁組織的血管內(nèi)皮，部分表達(dá)于癌細(xì)胞。CD146標(biāo)記的微血管數(shù)量用MVD值表示。MVD測定參照Weidner［4］方法，首先在低倍鏡( ×40)下觀察全部視野，在每張切片上選擇3個(gè)富含血管組織的“熱點(diǎn)”區(qū)，即棕黃染色密度最高的區(qū)域，然后，在高倍鏡(×100)下計(jì)數(shù)熱區(qū)CD146表達(dá)的血管數(shù)目，凡單個(gè)或聚集在一起的數(shù)個(gè)被染為棕黃色或棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞，只要與鄰近血管、腫瘤細(xì)胞和其他結(jié)締組織成分清楚分開的即為1個(gè)能夠計(jì)數(shù)的微血管。肌層太厚及血管腔面積大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管均不計(jì)數(shù)。取3個(gè)視野的微血管數(shù)，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)標(biāo)記及分析，并求和取平均值作為該例MVD。

MMP-14免疫組化陽性染色為棕黃色顆粒，位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)。陽性反應(yīng)的分級參照文獻(xiàn)［5］采用兼顧陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比的判斷標(biāo)準(zhǔn):每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，首先按陽性細(xì)胞所占百分比評分:陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;再按染色強(qiáng)度評分:無色為0，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;最后按兩者乘積分?jǐn)?shù)分為4個(gè)等級:－(0、1、2分)，+(3、4 分)，++(6、8 分)，+++(9、12 分)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用美國計(jì)算機(jī)研究中心研制的Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。MVD值以s表示。不同組間的MVD比較采用t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析用列聯(lián)相關(guān)系數(shù)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組織中CD146蛋白表達(dá)的情況

CD146表達(dá)主要定位于癌組織及癌旁組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，部分表達(dá)于癌細(xì)胞。CD146在CIN中呈不同程度的表達(dá)，在正常宮頸上皮中表達(dá)較弱。不同宮頸病變組織中CD146標(biāo)記的MVD結(jié)果見表1。

表1 不同宮頸病變組織中CD146標(biāo)記的MVD比較(s)

表1 不同宮頸病變組織中CD146標(biāo)記的MVD比較(s)

注:F*為單因素方差分析

組別 例數(shù) CD146標(biāo)記的MVD F*P 82 33.76 ±7.32 96.37 0.000宮頸上皮內(nèi)瘤變 48 24.49 ±4.21慢性宮頸炎宮頸鱗癌24 5.81 ±2.43

由表1可見，3組CD146標(biāo)記的MVD存在顯著差異，進(jìn)一步分析顯示，宮頸鱗癌組織 CD146標(biāo)記的MVD顯著高于CIN及慢性宮頸炎組織(P＜0.01)。

2.2 CD146標(biāo)記的MVD與宮頸鱗癌臨床病理因素的關(guān)系(表2)

表2 CD146標(biāo)記的MVD與宮頸鱗癌臨床病理因素的關(guān)系(s)

t P年齡(歲)臨床病理因素 例數(shù) CD146標(biāo)記的MVD≤53 39 32.47 ±6.52＞53 43 34.91 ±7.92 －1.51 0.13浸潤深度≤淺肌層 25 25.76 ±6.32＞深肌層 57 38.59±4.48 －10.48 0.00組織學(xué)分級Ⅰ級 24 24.82 ±5.29Ⅱ級 33 32.38 ±7.27Ⅲ級 25 39.75 ±5.62 13.38 0.00淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無62 28.27 ±5.46有20 39.72 ±3.19 －8.87 0.00 FIGO分期Ⅰ +Ⅱ期 61 28.59 ±5.91Ⅲ+Ⅳ期21 41.52 ±6.72 －8.34 0.00

由表2可見，CD146標(biāo)記的MVD與腫瘤浸潤深度、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期顯著相關(guān)(P＜0.01)，CD146標(biāo)記的 MVD與患者年齡無關(guān)(P＞0.05)。

2.3 各組織中MMP-14蛋白的表達(dá)情況

MMP-14蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色。宮頸鱗癌組中72例(87.80%)呈陽性表達(dá)，CIN組中27例(56.25%)呈陽性表達(dá)，慢性宮頸炎組中2例呈弱陽性表達(dá)(8.33%)，3組陽性率比較差異顯著(P＜0.01)。組間分析結(jié)果顯示，MMP-14陽性率宮頸鱗癌組與CIN及慢性宮頸炎組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，MMP-14表達(dá)與宮頸鱗癌浸潤深度、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期呈正相關(guān)，與患者年齡無相關(guān)性(表3)。

2.4 CD146與MMP-14蛋白表達(dá)的相關(guān)性

按照宮頸鱗癌中CD146標(biāo)記的MVD均值30為界，分為LCD146(MVD≤30)(48例)和HCD146(MVD＞30)(34例)。用列聯(lián)相關(guān)系數(shù)分析其與MMP-14表達(dá)的相關(guān)性(表4)。

表3 MMP-14表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理因素的關(guān)系(例)

表4 宮頸鱗癌中CD146標(biāo)記的MVD與MMP-14蛋白表達(dá)的相關(guān)性(例，%)

由表4可見，宮頸鱗癌組織中 CD146標(biāo)記的MVD，與MMP-14蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(P＜0.01)，列聯(lián)系數(shù) Cramer＇s V 和 Goodman-Kruskal的 gamma均 ＞0。

3 討論

CD146是1種Ca2+非依賴性細(xì)胞黏附分子的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族(Igsf)成員，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，有助于局部黏連聚集、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞形態(tài)的維持及細(xì)胞游走和增殖的調(diào)控［6］。近來研究發(fā)現(xiàn)CD146在許多惡性腫瘤組織中高表達(dá)，提示其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為判斷腫瘤預(yù)后的參考指標(biāo)［7，8］。MMPs是一組 Zn2+依賴性的蛋白水解酶，能夠降解多種基膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。MMPs包含許多成員，其中MMP-14能活化細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的活性且能激活其它的MMPs，既可以直接和(或)間接降解ECM和BM，也可以誘導(dǎo)腫瘤血管生成，維持腫瘤的不斷生長，并為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移提供條件。

我們的研究結(jié)果顯示:CD146在宮頸鱗癌中表達(dá)主要定位于癌及癌旁組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在宮頸上皮內(nèi)瘤變中見不同程度的表達(dá)，而在慢性宮頸炎上皮中表達(dá)較少。宮頸鱗癌組織中CD146標(biāo)記的MVD顯著高于其它各組。本研究結(jié)果顯示，以CD146標(biāo)記的宮頸鱗癌組MVD與患者年齡無關(guān)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組CD146標(biāo)記的MVD顯著高于淋巴結(jié)陰性組。說明宮頸鱗癌淋巴道轉(zhuǎn)移中伴有大量血管形成。其原因是腫瘤中大量新生血管形成，增加了腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)，使腫瘤細(xì)胞呈指數(shù)生長，并向周圍浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，同時(shí)CD146通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附聚集、增殖參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移過程。我們的結(jié)果提示CD146蛋白參與、促進(jìn)宮頸上皮從癌前病變、原位癌到浸潤癌的發(fā)生發(fā)展過程，其表達(dá)情況可作為判斷宮頸癌發(fā)展進(jìn)程的參考指標(biāo)。這與馬建華等［9］在前列腺中的研究結(jié)果及張龍?jiān)频龋?0］在卵巢癌中的研究結(jié)果基本一致。文獻(xiàn)報(bào)道CD146在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤中呈高水平表達(dá)，且表達(dá)水平與這些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、血管生成及預(yù)后相關(guān)［9～12］，但也有文獻(xiàn)報(bào)道［13］乳腺癌中CD146表達(dá)呈下調(diào)，與我們的結(jié)果及上述文獻(xiàn)中CD146呈過表達(dá)相反，范嫏娣等認(rèn)為這反映了腫瘤生物學(xué)的總體復(fù)雜性。

我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-14在宮頸鱗癌患者中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明宮頸鱗癌的侵襲性增強(qiáng)與MMP-14高表達(dá)有關(guān)，MMP-14在不同臨床分期和不同組織學(xué)分級的宮頸鱗癌組織中，Ⅲ+Ⅳ期MMP-14表達(dá)強(qiáng)度顯著高于Ⅰ+Ⅱ期;Ⅲ級MMP-14表達(dá)顯著高于Ⅰ、Ⅱ級。提示MMP-14是宮頸鱗癌發(fā)生中1種重要的蛋白水解酶，能夠降解多種基膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，使宮頸鱗癌細(xì)胞易于穿透血管壁，由血循環(huán)進(jìn)入淋巴循環(huán)，形成淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。Yamashita等［14］證實(shí)MMP-14在食管癌的進(jìn)展期起關(guān)鍵作用。本組結(jié)果與他們研究結(jié)論一致，提示MMP-14可以作為反映宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)標(biāo)志物。

我們研究結(jié)果還顯示，CD146表達(dá)與MMP-14表達(dá)密切相關(guān)。腫瘤轉(zhuǎn)移過程需要腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管系統(tǒng)，CD146陽性的腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過與腫瘤細(xì)胞上的CD146配體結(jié)合，參與腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管系統(tǒng)。所以，血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的 CD146，為CD146配體陽性的腫瘤細(xì)胞進(jìn)出血管提供了途徑。腫瘤細(xì)胞中CD146-CD146配體間的相互作用則引起了腫瘤細(xì)胞的聚集，這些細(xì)胞團(tuán)引起血管堵塞，繼而黏附于血管內(nèi)皮，CD146陽性的內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織。另外，CD146介導(dǎo)形成的腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞間的相互作用，分泌生長因子，也促進(jìn)了腫瘤的生長。CD146參與腫瘤細(xì)胞的黏附、轉(zhuǎn)移及新病灶的形成。而MMP蛋白能降解細(xì)胞外基質(zhì)及基膜成分，亦能誘導(dǎo)腫瘤血管生成，目前研究表明MMP-14在多種腫瘤組織中呈過度表達(dá)，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)腫瘤的生長和血管生成，協(xié)同參與多種腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程。由此可知兩者在腫瘤發(fā)展中確實(shí)存在著一定的相關(guān)性?？傊?，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因損傷、多級因子相互作用的復(fù)雜過程。

［1］Broders AC(2002).Squamous cell epithelioma of the skin.A study of 256 cases〔J〕.Ann Surg，2002，73:141.

［2］Tavassoil FA，Soares J.Myoepithelial Lesions.In:Tavassoil FA，Devilee P〔M〕.World Health Organization Classification of Tumors.In:WHO，ed.Pathology and genetics of tumors of the breast and female genital organs.Lyon:ILAC Press，2003.

［3］江忠清，朱鳳川，曲軍英，等.宮頸癌組織CD105表達(dá)與局部血管生成、癌細(xì)胞增殖侵襲的關(guān)系〔J〕.中華婦產(chǎn)科雜志，2003，6(38):374.

［4］Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors〔J〕.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):168.

［5］姚廣裕，林 鵬，王軍業(yè)，等.MMP-14在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.腫瘤防治研究，2005，32(5):267.

［6］Anfosso F，Bardin N，F(xiàn)rances V，et al.Activation of human endothelial cells via S-endo-1 antigen(CD146)stimulates the tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase P125(FAK)〔J〕.J Biol Chem，1998，273(41):26852.

［7］Yan X，Lin Y，Yang D，et al.A novel anti-CD146 monoclonal antibody，AA98，inhibits angiogenesis and tumor growth〔J〕.Blood，2003，102(1):184.

［8］Wu GJ，Varma VA，Wu M W，et al.Expression of a human cell adhesion molecule，MUC18，inprostate cancer cell lines and tissues〔J〕.Prostate，2001，48(4):305.

［9］馬建華，白進(jìn)良，傅 梧，等.CD146與前列腺癌微血管生成關(guān)系的研究〔J〕.中國男科學(xué)雜志，2005，19(4):12.

［10］張龍?jiān)疲瑢O 彤.卵巢上皮性腫瘤中三維能量超聲血流成像與MVD、CD146表達(dá)的研究〔J〕.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，34(4):413.

［11］Garcia S，Dalès JP，Charafe-Jauffret E，et al.Poor prognosis in breast carcinomas correlates with increased expression of targetable CD146 and c-Met and with proteomic basal-like phenotype〔J〕.Hum Pathol，2007，38(6):830.

［12］Loges S，Clausen H，Reichelt U，et al.Determination of microvessel density by quantitative real-time PCR in esophageal cancer:correlation with histologic methods，angiogenic growth factor expression，and lymph node metastasis〔J〕.Clin Cancer Res，2007，13:76.

［13］Shih I M，Hsu M Y，Palazzo J P，et al.The cell-cell adhesion receptor Mel-CAM acts as a tumor suppressor in breast carcinoma〔J〕.Am J Pathol，1997，151(3):745.

［14］Yamashita K，Tanaka Y，Mimori K，et al.Differential expression of MMP and uPA systems and prognostic relevance of their expression in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2004，110:201.