鵝細小病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及應用

董 浩，徐楠楠

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，長春 130118;3.長春市農(nóng)業(yè)學校，長春 130102)

小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雛鵝的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病，傳染性強、病程短且死亡率高。它多發(fā)生于出殼后20日齡左右的雛鵝，其中3～5日齡雛鵝為多發(fā)日齡，發(fā)病雛鵝經(jīng)數(shù)天就波及全群，死亡率可高達70%～95%。由于該病病程短促且有較強的傳染、傳播、致死亡能力，目前已成為影響?zhàn)B鵝業(yè)健康發(fā)展的危害最為嚴重的傳染病，同時也給養(yǎng)殖戶和社會造成了巨大的經(jīng)濟損失。感染的病鵝或番鴨可通過排出帶有大量病毒的糞便，直接或間接接觸將小鵝瘟病毒傳播給健康鵝群，從而導致本病迅速傳播。該病毒也可通過垂直傳播，成年鵝尤其是產(chǎn)蛋種鵝在傳播中成為隱性感染者、病毒攜帶者，它可通過鵝蛋將病毒傳播給易感的雛鵝，所以產(chǎn)蛋種鵝是重要的傳染源，也是新生雛鵝爆發(fā)小鵝瘟的重要原因。開展GPV在產(chǎn)蛋種鵝體內定植規(guī)律研究，可為從源頭上防控小鵝瘟提供科學依據(jù)，是深入開展小鵝瘟感染、致病和復制機制研究的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 小鵝瘟病毒 SP株［1］、鵝副黏病毒、鵝禽流感、鵝的鴨瘟病毒均由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院實驗室保存。

1.1.2 試驗動物 產(chǎn)蛋種鵝為產(chǎn)前15日齡吉林白鵝，購于長春某鵝廠。

1.1.3 主要試劑與載體 DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、dNTPs、ExTaq DNA 聚合酶、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒等均購自TaKaRa(大連公司)。T-GPV-VP3質粒由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院實驗室在pMD-18T載體基礎上構建的帶有VP3的陽性質粒。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設計 根據(jù)GPV SP株VP3基因序列(GenBank登陸號:FJ158588)，選擇VP3保守基因序列，設計一對熒光定量PCR引物和Taq Man探針。引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成，序列如表1所示。

表1 名稱、序列及擴增片段長度

1.2.2 熒光定量PCR檢測GPV VP3基因的標準曲線的建立 取2 μL T-GPV-VP3質粒，加入18 μL雙蒸餾水稀釋為原濃度的1×10-1，依次10倍梯度稀釋為1 ×10-2、1 ×10-3、1 ×10-4、1 ×10-5濃度的重組質粒DNA。每個稀釋度設3組重復，設置一個對照組，以雙蒸餾水為模板，進行Taq Man熒光定量檢測。PCR反應各組分如下:Premix Ex TagTM(2 ×)12.5μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，熒光探針溶液 1 μL，模板 2 μL，補雙蒸水至25 μL。具體反應條件為:95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，共40個循環(huán)。檢測完畢后，啟用隨機軟件，分別錄入相應陽性質?？截悢?shù)，通過收集的熒光曲線和Ct值判定結果，繪制標準曲線。

1.2.3 熒光定量PCR檢測VP3特異性試驗 以種鵝常見病毒性疾病鵝副黏病毒、鵝禽流感、鵝的鴨瘟病毒為模板，應用上述已建立的熒光定量PCR方法，檢測此方法的特異性。

1.2.4 熒光定量PCR檢測VP3靈敏性試驗 將已知拷貝數(shù)的標準質粒做10倍梯度稀釋至3.5×102個拷貝/μL，以各梯度稀釋液為模板進行PCR反應。最低起始模板濃度即為此PCR反應的靈敏度。

1.2.5 人工感染種鵝試驗 將購買的產(chǎn)前15日種鵝30只(經(jīng)瓊脂擴散試驗檢測為GPV陰性)隨機分為2組，試驗組20只，對照組10只。試驗組皮下注射接種GPV SP株鴨胚尿囊液，對照組接種生理鹽水，每只接種0.5 mL。從病毒感染試驗后開始，分別在第1、3、7、15、30 天進行采樣，每個時間段捕殺4只試驗組種鵝、2只對照組種鵝，采取十二指腸、空腸、盲腸、心臟、肝臟、腎臟、卵巢、輸卵管等組織臟器，十二指腸、空腸、盲腸、輸卵管取1 cm長，心臟、肝臟、腎臟、卵巢取500 mg，研磨處理病料，加入PBS緩沖液，制成勻漿，反復凍融三次，分離上清液。

1.2.6 種鵝GPV定植規(guī)律研究 提取1.2.5項上清液中病毒DNA，按照1.2.2項的體系和條件進行熒光定量PCR，繪出熒光擴增曲線圖，根據(jù)結果分析得出各個樣品的Ct值，按照標準曲線計算出樣品的起始拷貝數(shù)和樣品的病毒濃度。從而得到GPV在產(chǎn)蛋種鵝體內的定植規(guī)律。

2 結果

2.1 熒光定量PCR檢測VP3標準曲線建立結果采用Taq Man實時熒光定量PCR方法，檢測標準品的連續(xù)5個不同稀釋度擴增時的熒光信號，反應結束后系統(tǒng)自動生成模板濃度擴增反應的動力學曲線(圖1)。以Ct值為縱坐標，不同標準品梯度稀釋的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，獲得標準曲線(圖2)，標準曲線的相關系數(shù)均大于0.99(R2＞0.99)，可見real-time PCR在稀釋度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。從而根據(jù)未知樣品的相對應基因的Ct值，即可得出起始模板的精確拷貝數(shù)，進而對樣品進行定量分析。

圖1 T-GPV-VP3的擴增曲線(各曲線按Ct值

圖2 GPV-VP3的標準曲線

2.2 熒光定量PCR檢測GPV特異性試驗結果根據(jù)PCR的擴增特性和陰性對照的熒光信號強度確定Ct值。Ct值小于30，確定為陽性樣品;Ct值大于35，為陰性樣品;Ct值在30～35之間判為可疑，應重復試驗，重復后大于30，即判為陰性。特異性熒光PCR擴增曲線結果如圖3所示，重組質粒Ct值小于29為陽性，而鵝副黏病毒、禽流感病毒、鵝的鴨瘟病毒為模板DNA的Ct值均大于35為陰性，表明該檢測體系對GPV為特異性擴增。

圖3 T-GPV-VP3的特異性擴增曲線

2.3 熒光定量PCR檢測GPV靈敏性試驗結果當模板濃度為3.5×103個拷貝/μL時，熒光定量PCR可以擴增出特異性產(chǎn)物，因此，該PCR方法檢測靈敏度為3.5 ×103個拷貝/μL。

2.4 重復性試驗結果 對于不同濃度的模板，4個平行樣品之間的Ct值差異不顯著，表明該方法具有很好的重復性。

圖4 部分樣品的擴增曲線

2.5 人工感染種鵝熒光定量PCR檢測結果 對試驗組種鵝各個臟器DNA進行熒光定量PCR擴增，擴增曲線如圖4所示。根據(jù)擴增曲線中樣品的Ct值，按照標準曲線的公式計算出樣品的起始病毒含量(表2)。

表2 不同感染時間各部位病毒含量/2 μL組織 DNA(Lg，n=3)

3 討論

目前國內外開展了GPV在雛鵝和雛番鴨分布規(guī)律研究，但未見開展病毒在種鵝體內定植研究。有相關報道稱，小鵝瘟病毒可垂直傳播［2-3］，小鵝瘟病毒只感染雛鵝，死亡率很高;種鵝是成年鵝，不表現(xiàn)臨床癥狀，但可攜帶病毒，并能排毒撒毒，污染周圍環(huán)境。檢測病毒的方法很多，包括免疫學檢測和分子生物學檢測，免疫學的方法有一定的誤差，更精確的檢測需要進入分子生物學的研究，熒光定量PCR是分子生物學研究中常用和可靠的方法［4-6］。熒光定量PCR的方法很多，本實驗選擇Taq Man探針熒光定量PCR，Taq Man探針是一種核苷酸探針，探針長度在15～45 bp(最好是20～30 bp)，在探針的 5’端帶有熒光物質——FAM，3’端帶有熒光淬滅物質——Eclipse。當探針與靶序列相交時，F(xiàn)AM和Eclipse接近，熒光基團被淬滅，沒有熒光信號，PCR反應到延伸階段時，聚合酶的外切酶活性將探針切開，F(xiàn)AM和Eclipse分開，F(xiàn)AM重新發(fā)出熒光信號，此信號被收集。Taq Man探針法所使用的引物和探針是針對一種核酸設計的，具有高度的特異性，并避免了普通PCR出現(xiàn)假陽性的可能。Taq Man探針法結果直觀、清晰，減少了普通PCR產(chǎn)物電泳觀察所帶來的危害和麻煩，同時具有穩(wěn)定性、可靠性和重復性。

通過檢測結果可以看出，人工感染成年種鵝24 h后，能夠在腸段、糞、心、肝、脾臟、腎臟、輸卵管和卵巢中檢測到病毒DNA，雖然沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀，GPV可以通過皮下接種的方式進入機體，并在上述器官中增殖;在病毒感染72～168 h出現(xiàn)病毒感染的高峰期，并且在肝臟、脾臟、糞便、腸道和輸卵管中病毒含量持續(xù)較高水平，腸道中的含量最高;隨后，病毒的增殖明顯減少，病毒感染360 h后，減少最快的是在心臟和腎臟中，已經(jīng)檢測不到病毒的存在;在病毒感染720 h后，在腸道、輸卵管和卵巢中檢測不到GPV病毒DNA;在病毒感染15 d后，可在輸卵管和卵巢中檢測到微量的GPV，本實驗的實驗鵝為開產(chǎn)前15日的成年種鵝，在產(chǎn)蛋時，可能隨著卵巢和輸卵管將GPV帶到鵝蛋中，使小鵝瘟傳播。本研究為臨床更好地診斷和監(jiān)測小鵝瘟病毒提供了精密準確的手段，為合理使用小鵝瘟疫苗提供了一定的理論依據(jù)。

［1］董 浩，馬 磊，單曉楓，等.霍爾多巴吉白鵝小鵝瘟病毒的分離與鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46(10):49-50.

［2］薛 霜，獨軍政，高閃電，等.實時熒光定量PCR技術研究進展及其在獸醫(yī)學中的應用［J］.中國農(nóng)學通報，2010，8(12):69-73.

［3］畢建敏.鵝細小病毒熒光定量PCR檢測方法的建立與應用及其VP3基因序列分析［D］.山東農(nóng)業(yè)大學，2007，6(15):98-101.

［4］XU Qiu ying，PENG Sheng quan，LIU Yamin，et al.The Utilization of Fluorgenic Quantitative PCR in the Effects Evaluation of Hepatitis B Treatment by Herbal Medicine［J］.NewHerbal Physic，2002，34(10):71-72.

［5］Bustin S A，Mueller R.Real-time Reverse Transcription PCR(RT-PCR)and Its Potential Use in Clinical Diagnosis［J］.Clinical Science，2005，10(9):365-379.

［6］Huang Y，Kong D，Yang Y，et al.Real-time Quantitative Assay of Telomerase Activity Using the Duplex Scorpion Primer［J］.Biotechnol Lett，2004，26(11):891-895.