枯草芽孢桿菌M6和木霉10對(duì)番茄灰霉病的防治效果研究

徐升運(yùn) ，趙文娟 ，馬齊 ，張強(qiáng) ，任平 ，秦濤

（1.陜西省科學(xué)院酶工程研究所，西安，710600；2.陜西省酶工程技術(shù)中心）

番茄灰霉病是一種世界性的重要病害，且為害較重，番茄灰霉病的防治已成為保證生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵性措施[1]。目前防治番茄灰霉病主要采用化學(xué)藥劑，如苯并咪唑類(lèi)的多菌靈、甲基硫菌靈，二甲酰亞胺類(lèi)的腐霉利、異菌脲以及N-苯氨基甲酸酯類(lèi)的乙霉威[2]。長(zhǎng)期、連續(xù)使用化學(xué)藥劑使病原菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性，影響防治效果，同時(shí)易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題[3，4]。據(jù)張傳清等[5]報(bào)道，設(shè)施蔬菜灰霉病菌對(duì)百菌清、多菌靈、腐霉利、異菌脲、乙霉威、嘧霉胺均產(chǎn)生不同程度的抗藥性。因此，利用拮抗菌防治番茄灰霉病日益受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視，國(guó)內(nèi)在這一方面陸續(xù)有研究報(bào)道，以枯草芽孢桿菌為主，也有用木霉防治番茄灰霉病的研究[6]。但單獨(dú)用細(xì)菌或真菌防治番茄灰霉病容易受到病菌的變異影響，降低防效，而應(yīng)用拮抗細(xì)菌和拮抗真菌聯(lián)合防治番茄灰霉病，則可有效提高防治效果。

本研究以本課題組分離出的1株木霉10（Trichoderma10）和1株枯草芽孢桿菌M6（BacillussubtilisM6）菌株的發(fā)酵液，及2種菌的發(fā)酵液混合后制得的復(fù)合菌劑W為材料，對(duì)番茄灰霉病進(jìn)行了防治試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

木霉10菌株與枯草芽孢桿菌M6菌株由陜西省科學(xué)院酶工程研究所從土壤中分離保存。有效活菌數(shù)，枯草芽孢桿菌 M6 為 1.0×1010億個(gè)/mL，木霉 10 為1.0×1010億個(gè)/mL，將 2 種菌的發(fā)酵液按 1∶1 比例配成復(fù)合菌劑W，自行生產(chǎn)。對(duì)照藥劑為75%百菌清可濕性粉劑。

番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌MB1從臨潼地區(qū)的番茄病果上分離、純化得到。

番茄品種毛粉802由西安市蔬菜所培育。

試驗(yàn)地點(diǎn)在西安市臨潼區(qū)任留鄉(xiāng)的無(wú)公害蔬菜示范基地。試驗(yàn)期間大棚溫度15～25℃。

1.2 番茄灰霉病的抑制試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將灰葡萄孢菌MB1配制成濃度為1.0×109cfu/mL菌液，并制成含菌平板。將木霉10、枯草芽孢桿菌M6和混合菌劑W分別接種在平板上，于25℃培養(yǎng)5 d后分別測(cè)定抑菌圈直徑，并計(jì)算抑菌率。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.3 復(fù)合菌劑W防治番茄灰霉病的最佳濃度的研究

吸取混合菌劑W培養(yǎng)液2 mL至18 mL滅菌后的PDA培養(yǎng)基中，制成不同濃度的含菌平板，以加入2 mL無(wú)菌水的處理為對(duì)照。

將制備好的灰葡萄孢菌MB1菌盤(pán)移植到上述平板中，每皿1塊，4次重復(fù)，倒置，于25℃培養(yǎng)24 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，計(jì)算抑菌率。

1.4 田間防治試驗(yàn)

①田間小區(qū)設(shè)計(jì) 田間試驗(yàn)中將復(fù)合菌劑W稀釋成800倍液、1 000倍液、2 000倍液使用，噴施2次，每次藥液用量30L/667m2；對(duì)照藥劑75%百菌清可濕性粉劑800倍液，用量170 g/667 m2，分2次噴施。以清水處理為空白對(duì)照。共5個(gè)處理，4次重復(fù)，每小區(qū)面積為12 m2。小區(qū)間及試驗(yàn)田間周?chē)O(shè)保護(hù)行。

②施藥時(shí)間 于2010年4月15日第1次施藥（發(fā)病初期），2010年5月10日第2次施藥。

③病情調(diào)查方法 分別在噴藥前1 d和噴藥后1周調(diào)查葉片上的病害嚴(yán)重程度，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。每小區(qū)在對(duì)角線上取5點(diǎn)，每點(diǎn)調(diào)查2株，調(diào)查各植株全部葉片。

分級(jí)方法，0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積21%～40%；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積40%以上[7]。

計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總數(shù)×9），防治效果（%）=[1-（CK0×PT1/CK1×PT0）]×100%。

其中，CK0為空白對(duì)照小區(qū)施藥前病情指數(shù)，CK1為空白對(duì)照小區(qū)施藥后病情指數(shù)，PT0為藥劑處理小區(qū)施藥前病情指數(shù)，PT1為藥劑處理小區(qū)施藥后病情指數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 木霉10、枯草芽孢桿菌M6及復(fù)合菌劑W對(duì)番茄灰霉病的抑制作用結(jié)果

平板培養(yǎng)結(jié)果表明，木霉10和枯草芽孢桿菌M6對(duì)灰葡萄孢菌MB1的抑菌圈平均直徑分別為15.04 mm 和 23.26 mm，抑菌率分別為18.3%和26.8%。而復(fù)合菌劑W對(duì)灰葡萄孢菌MB1的抑菌圈平均直徑為 32.72 mm，抑菌率為 62.2%。

研究發(fā)現(xiàn)，木霉10和枯草芽孢桿菌M6單獨(dú)使用時(shí)均對(duì)番茄灰霉病具有一定的防效，且枯草芽孢桿菌M6的抑制效果明顯比木霉10好，即其防治效果更好。

另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2種菌混合使用時(shí)，抑菌率較單一菌劑顯著提高，對(duì)番茄灰霉病防治效果更好。這可能是因?yàn)?種菌協(xié)同作用，從不同的防治機(jī)理方面抑制了番茄灰霉病的發(fā)展。

2.2 復(fù)合菌劑W防治番茄灰霉病的最佳濃度

通過(guò)表1可以看出，不同濃度的復(fù)合菌劑W對(duì)灰霉病菌菌絲的生長(zhǎng)均有抑制作用，當(dāng)濃度大于105cfu/mL時(shí)，均對(duì)灰霉病菌具有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率均達(dá)到了100%，但當(dāng)濃度為104cfu/mL時(shí)，對(duì)灰霉病菌抑制作用明顯下降，不能達(dá)到防治目的。因此，復(fù)合菌劑W的濃度應(yīng)不低于105cfu/mL。

2.3 田間防治試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)表2可以看出，田間試驗(yàn)中，復(fù)合菌劑W對(duì)番茄灰霉病具有較好的防治作用，并且防效隨濃度的增大而提高，以800倍液的防治效果最佳。以復(fù)合菌劑W 800倍液和1 000倍液每7 d噴1次，連續(xù)噴 2次，防效分別可達(dá) 80.75%和 68.30%，75%百菌清液800倍液防效為69.84%，復(fù)合菌劑W 800倍液防效顯著優(yōu)于75%百菌清800倍液的，而復(fù)合菌劑W 1 000倍液防效與75%百菌清800倍液差異不顯著。當(dāng)復(fù)合菌劑W的稀釋倍數(shù)大于2 000時(shí)，對(duì)番茄灰霉病的防治效果明顯較差。

3 結(jié)論與討論

木霉10和枯草芽孢桿菌M6對(duì)灰葡萄孢菌MB1的抑菌率分別為18.3%和26.8%，而復(fù)合菌劑W對(duì)灰葡萄孢菌MB1的抑菌率為62.2%，2種菌劑混合使用效果更佳，這可能是因?yàn)?種菌在防治時(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用。

復(fù)合菌劑W對(duì)番茄灰霉病具有良好的防治效果，復(fù)合菌劑W 800倍液防效達(dá)到80.75%，防效顯著優(yōu)于75%百菌清液800倍液；復(fù)合菌劑W 1 000倍液防效與75%百菌清液800倍液相當(dāng)；復(fù)合菌劑W稀釋倍數(shù)大于2 000時(shí)防效明顯下降。因此，復(fù)合菌劑W 800倍液和1 000倍液完全可代替化學(xué)藥劑，其中以800倍液的效果更好，可減小農(nóng)殘和環(huán)境污染。

表1 不同濃度復(fù)合菌劑W對(duì)灰霉病菌的抑制效果

表2 復(fù)合菌劑W田間試驗(yàn)結(jié)果

[1]葛紹榮，牛莉娜，李銘.番茄灰霉病害及其微生物防治的研究進(jìn)展[J].生物加工過(guò)程，2007，5（3）：15-19.

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[7]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所生測(cè)室.農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）[M].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1993，45-51.