食品中大腸桿菌O157:H7的兩種檢測方法研究

宋宏新，孫 斌，薛海燕，徐大鵬

(1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021; 2.徐州市睢寧縣職業(yè)教育中心，江蘇徐州221200)

食品中大腸桿菌O157:H7的兩種檢測方法研究

宋宏新1，孫 斌1，薛海燕1，徐大鵬2

(1.陜西科技大學生命科學與工程學院，陜西西安710021; 2.徐州市睢寧縣職業(yè)教育中心，江蘇徐州221200)

研究食品中大腸桿菌O157∶H7的兩種檢測方法，PCR法引物針對特異性粘附毒素基因(eaeA)擴增檢測，雙抗夾心ELISA采用雞抗O157∶H7特異性脂多糖(LPS)抗體(IgY)檢測，結(jié)果顯示兩種方法對純培養(yǎng)物的檢測靈敏度都在103～104cfu/mL之間，特異性能滿足食品檢測需求;PCR法的敏感度較ELISA法高，且較省時。經(jīng)以牛奶為參考的食品模擬樣品(37℃增菌14h)驗證兩種檢測方法的最低檢出限均為2.5cfu/25mL樣品。

大腸桿菌O157∶H7，食源性病原菌檢測，雙抗夾心ELISA，PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

E.coli O157∶H7 EDL 933株 由中國疾病預防控制中心饋贈;普通大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌、枯草桿菌 均為陜西科技大學生化實驗室保藏;Anti-E.coli O157∶H7 LPS-IgY及其酶標抗體(HRP-IgY) 前期實驗制備［4-5］;TMB、新生霉素增菌肉湯 均購于西安羅森伯科技有限公司;柱式基因組DNA抽提試劑盒、Easy PCR擴增試劑盒以及BIOWEST ARGROSE 均購于北京天根生物科技有限公司;引物合成 北京奧科生;市售牛奶 購于西安市農(nóng)場。

MK3型酶標儀 荷蘭Wellscan-MK-3;酶標板西安舟鼎國;移液槍 德國Eppendorf;PCR儀 美國MJ RESEARCH;水平電泳槽 北京六一;凝膠成像分析系統(tǒng) 南京捷達科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR檢測方法 PCR引物針對E.coli O157∶H7的特異性粘附毒素基因(eaeA)［6］應用軟件Primer5.0設計引物，結(jié)果見表1。

表1 PCR引物及相關產(chǎn)物

表2 棋盤滴定法測定包被抗體和酶標抗體結(jié)果

PCR模板用柱式基因組DNA抽提試劑盒提取大腸桿菌O157∶H7基因組DNA，DNA含量測定用紫外分光光度法，模板的純度用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR過程參考Easy PCR試劑盒說明書。

1.2.2 雙抗夾心ELISA檢測方法［7］

1.2.2.1 雙抗體夾心 ELISA 法檢測大腸桿菌O157∶H7 捕獲抗體采用雞抗O157∶H7特異性脂多糖(LPS)抗體(IgY)，其酶標抗體(HRP-IgY)作為檢測抗體。

1.2.2.2 棋盤滴定法同時測定包被抗體和酶標抗體的工作濃度 包被抗體的濃度分別用包被緩沖液稀釋為25、12.5、6.25μg/mL，在每種包被濃度又分別進行強陽性抗原(E.coli O157∶H7 108cfu/mL)、弱陽性抗原(E.coli O157∶H7 104cfu/mL)和陰性對照液三種實驗;將酶標IgY按1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280進行稀釋。

1.2.3 檢測方法的敏感性實驗 將大腸桿菌O157∶H7純培養(yǎng)物的濃度調(diào)整為1.0×109cfu/mL，分為兩份，一份用于測定雙抗體夾心ELISA法敏感性，一份用于PCR敏感性的檢測，同時以普通大腸桿菌作對照。

1.2.4 牛奶模擬參考樣品的檢測 于25mL巴氏滅菌牛奶中分別接種濃度為104、103、102、10、5、2.5、1.25cfu/mL的大腸桿菌O157∶H7液制成模擬樣品，以生理鹽水做陰性對照，然后將其加入225mL新生霉素增菌肉湯中，37℃培養(yǎng)14h。再將每一稀釋度各取兩份反復離心洗滌，一份煮沸10min進行雙抗夾心ELISA實驗，一份用于提取基因組DNA進行PCR實驗，比較這兩種方法在模擬樣品中的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙抗夾心ELISA的建立

用棋盤滴定法同時測定包被抗體和酶標抗體的濃度，測定結(jié)果見表2。

包被抗體和酶標抗體的濃度是雙抗夾心ELISA中必須控制的兩個關鍵要素。由表2可知，包被抗體的最適工作濃度為12.5μg/mL，酶標抗體的最適工作濃度為1∶160，兩個指標在同一反應中確定可消除同種動物抗體對抗原表位的競爭所產(chǎn)生的交互影響作用。

2.2 PCR方法的建立

2.2.1 PCR模板制備結(jié)果 基因組DNA用試劑盒提取后，經(jīng)紫外分光光度計測得OD260值為0.051，可計算提取基因組DNA的濃度為0.64μg/μL;瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度(見圖1中的泳道9)，由檢測結(jié)果可見，經(jīng)試劑盒提取的DNA得率和純度都較高，完全滿足PCR需求。

圖1 引物及模板濃度對PCR影響注:1.DNA分子量標準;9.模板DNA; 2～4模板量依次為:0.16、0.32、0.64(μg); 5～8引物濃度依次為:10、15、20、25(μmol/L)。

2.2.2 PCR反應體系的優(yōu)化 由于采用試劑盒PCR擴增體系，僅對引物濃度和模板濃度進行確定，其結(jié)果見圖1。

由圖1可知，模板加量為0.16μg時，PCR條帶已較清楚，故選模板的最適量為0.16μg;在此模板加量，引物濃度在15μmol/L有清晰的條帶出現(xiàn)，故選取該條件為最適PCR反應體系。

2.3 檢測方法的敏感性實驗結(jié)果

大腸桿菌O157∶H7純培養(yǎng)物的雙抗夾心ELISA檢測結(jié)果見表3，PCR檢測結(jié)果見圖2。

表3顯示雙抗體夾心ELISA法檢測大腸桿菌O157∶H7的敏感度小于104cfu/mL;圖2表明PCR檢測的敏感度為103cfu/mL，可見兩種檢測方法的敏感度相當，PCR法較雙抗夾心ELISA要靈敏。目標基因及其引物通過Blast搜索，所得分值較高的一些菌有可能造成假陽性結(jié)果，但食源性微生物中僅以普通大腸桿菌較為常見，實驗結(jié)果顯示普通大腸桿菌經(jīng)PCR實驗沒有條帶出現(xiàn)。作者已研究過食品中常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌的免疫反應特性，IgY與普通大腸桿菌有較強的交叉反應，與其它幾種菌的交叉反應較弱［8］，對兩種檢測方法特異性的研究還有待深入。

表3 雙抗夾心ELISA敏感性檢測

表4 牛奶模擬樣品中大腸桿菌O157∶H7的ELISA檢測結(jié)果

圖2 PCR檢測方法敏感性檢測

2.4 食品模擬樣品的檢測

將巴氏滅菌牛奶中接入不同濃度的大腸桿菌O157∶H7，制備成模擬樣品，以牛奶樣品為對照，經(jīng)14h選擇性增菌培養(yǎng)來考察檢測的敏感性及實用性，雙抗體夾心ELISA法的結(jié)果見表4，PCR方法的結(jié)果見圖3。

圖3 牛奶樣品的PCR檢測結(jié)果

由表4和圖3可見，雙抗夾心ELISA法和PCR法檢測牛奶樣品的最低檢出限均為2.5cfu/25mL樣品，表明兩種檢測方法的靈敏度相當，這一結(jié)果與趙志晶等［9］所用雙抗夾心ELISA檢測結(jié)果(0.1cfu/mL樣品)相同，比Nathalie Y.Fortin等［10］人用PCR法檢測的結(jié)果(1cfu/mL樣品)要高，可用于食品樣品的檢測。

3 結(jié)論

綜上所述，實驗研究的食品中大腸桿菌O157∶H7的雙抗夾心ELISA和PCR檢測方法的靈敏度都較高，對大腸桿菌O157∶H7的純培養(yǎng)物的檢測都在103～104cfu/mL之間，模擬樣品增菌后的檢測兩種檢測方法的檢測限都為2.5cfu/25mL樣品;雙抗夾心ELISA和普通大腸桿菌有交叉，兩種方法對食品中其它常見菌株有良好的選擇性。ELISA方法要比PCR成本低，且易于普及推廣;不包括樣品增菌時間，ELISA檢測需要約6h，PCR檢測僅為3.5h左右，PCR方法省時。對兩種方法的特異性及應用方法學(試劑盒化、重復性)等方面的問題還有待深入研究。

［1］Riley L W，Remis R S，Helgerson S D，et al.Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype［J］.The New England Journal of Medicine，1983，308:681-685.

［2］Chapman P A，Siddons C A，Cerdan Malo A T，et al.A 1-year study of E.coli O157 in cattle，sheep，pigs and poultry［J］. Epidemiology and Infection，1997，119:245-250.

［3］Carol A P.The epidemiology，detection and control of Escherichia coli O157［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79:1367-1381.

［4］宋宏新，劉曉陽，程軍，等.特異性抗腸出血性大腸桿菌O157∶H7內(nèi)毒素及卵黃抗體的制備［J］.食品科學，2007，28 (1):164-167.

［5］宋宏新，劉曉陽，李宏.酶標記抗E.coli O157∶H7雞卵黃抗體的制備與特性研究［J］.臨床檢驗雜志，2007，25(4): 290-292.

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［8］宋宏新，韓燕，劉曉陽，等.抗大腸桿菌E.coli O157∶H7特異性IgY的免疫反應特性初探［J］.中華微生物與免疫學雜志，2008(1):23.

［9］趙志晶，劉秀梅.大腸桿菌O157多克隆抗體及食品中雙抗ELISA測定方法的研究［J］.衛(wèi)生研究，2003，32(6):606-609.

［10］Nathalie Y F，Ashok M，Chen W.Use of Real-Time olymerase Chain Reaction and MolecularBeaconsforthe Detection ofEscherichia coliO157∶H7［J］.Analytical Biochemistry，2001，289:281-288.

Comparison of two methods on detecting Escherichia Coli O157∶H7 strain in foods

SONG Hong-xin1，SUN-Bin1，XUE Hai-yan1，XU Da-peng2
(1.College of Life Science＆Engineering，Shaanxi University of Science＆Technology，Xi’an 710021，China; 2.Vocational Education Center of Suining，Xuzhou 221200，China)

To detect Escherchia Coli O157∶H7 in foods，two methods such as the double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay and PCR were developed.A specific primer had been successfully designed to amplify eaeA gene in PCR detection.In the double sandwich antibody ELISA，the specific anti-E.coli O157∶H7 LPS-IgY was used.As a result，the limits of tow detections were 103～104cfu/mL in pure culture of E.coli O157∶H7 and the PCR was a little higher and faster than ELISA.In analogue milk detection，the detection limits of two methods were all 2.5cfu/25mL after 14h enrichment.

Escherchia Coli O157∶H7;food borne pathogen detection;double-antibody sandwich ELISA;PCR

TS207.4

A

1002-0306(2011)03-0402-03

大腸桿菌O157∶H7是近年來出現(xiàn)的嚴重危害人類身體健康的一種食源性病原微生物，它是腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli EHEC)的一個主要血清型。自1983年美國Riley等［1］人首次報道以來，相繼在世界許多國家都出現(xiàn)爆發(fā)性和散發(fā)性流行性病例。牛等反芻動物是該菌的主要攜帶者［2］，而人類被感染的主要來源是直接或間接食用被污染的這些動物食品。人感染EHEC O157∶H7輕度者將會出現(xiàn)短暫腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀，嚴重者導致劇烈腹痛、出血性結(jié)腸炎、溶血性貧血癥、血小板減少性紫癜和溶血性尿毒綜合癥［3］。本文就酶聯(lián)免疫分析技術(ELISA)及PCR技術對食品中的大腸桿菌O157∶H7進行檢測研究。

2010-02-26

宋宏新(1959-)，男，教授，碩士，研究方向:食品免疫檢測技術。

陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目(2009K02-09);陜西省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項目(09JC19)。