基于分子印跡材料的雌酮快速檢測方法研究

王 碩，何 歡，王俊平，姚玉超，宋國欣

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

基于分子印跡材料的雌酮快速檢測方法研究

王 碩，何 歡，王俊平，姚玉超，宋國欣

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

以合成的雌酮分子印跡聚合物為微柱填料，建立了分子印跡聚合物富集雌酮原位顯色反應(yīng)的方法，并對影響測定結(jié)果的顯色劑用量、填料量、上樣流速和上樣時(shí)間等主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，在印跡材料填料量為0.030g，上樣流速為1.0mL·min-1，1.00μg·L-1雌酮-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液富集10.0mL條件下，再加入稀氫氧化鉀-乙醇溶液1.0mL條件下，顯色劑15.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL，在暗處反應(yīng)1h，最低檢出限可達(dá)10.00μg·L-1。為了驗(yàn)證所建立的方法的實(shí)用性，本研究對湖水樣品中的痕量雌酮?dú)埩暨M(jìn)行了檢測分析。通過對檢測為空白的樣品進(jìn)行濃度為10.00，50.00，100.00μg·L-1的添加，以所建立的分析方法進(jìn)行檢測，結(jié)果均有比較明顯的顏色反應(yīng)，從而說明所建立的檢測方法的可行性。

雌酮，分子印跡聚合物，顯色反應(yīng)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌酮 Fluka公司，分析純;丙烯酰胺 Sigma公司，分析純;二甲基丙烯酸乙二醇酯 Organics公司，分析純;偶氮二異丁腈 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純;間二硝基苯 北京通縣育才精細(xì)化工廠，分析純。

紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;RH-KT/C加熱磁力攪拌器 廣州儀科技術(shù)有限公司;SH-III型循環(huán)水式真空泵 浙江黃巖求精真空泵廠;真空干燥箱 天津市三水科學(xué)儀器有限公司; Centrifuge 5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國 Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雌酮分子印跡聚合物MISPE柱的制備 雌酮分子印跡聚合物的制備方法參考Zhixiang Xu等的文獻(xiàn)方法［4］。將所合成的雌酮分子印跡材料裝在一個(gè)空的MISPE柱中，分別用5.0mL甲醇和5.0mL雙蒸水潤洗MISPE柱后備用。

1.2.2 分子印跡聚合物快速富集雌酮原位顯色方法將MISPE柱中的富集了雌酮的分子印跡材料完全抽干，然后加入1.0mL乙醇溶液，使吸附了雌酮后的分子印跡材料完全浸泡于乙醇中，然后加入1.0mL稀氫氧化鉀-乙醇溶液，使其完全反應(yīng)，最后加入15g·L-1純化好的間二硝基苯溶液，在暗處放置1h后，觀察其顏色反應(yīng)。

圖1 分子印跡聚合物快速富集雌酮方法

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物富集雌酮原位顯色反應(yīng)方法優(yōu)化

2.1.1 分子印跡聚合物填料量的優(yōu)化 印跡材料填料量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，上樣濃度為10.00μg·L-1，雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL，上樣時(shí)間控制在10min，即上樣流速為1.0mL·min-1。顯色劑用量為15.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL。印跡材料填料量分別為0.030、0.050、0.080g。

從圖2可以看出，填料量為0.030g時(shí)，顏色已經(jīng)很明顯，說明印跡材料已經(jīng)對雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液得到了較好的吸附，而填料量為0.050，0.080g時(shí)，可以明顯看出有很多印跡材料還沒有顏色，這樣就會(huì)造成印跡材料的浪費(fèi)。

圖2 填料量的優(yōu)化

由于實(shí)驗(yàn)中要求快速檢測，本實(shí)驗(yàn)選取了不同濃度的雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液在1mL·min-1的條件下富集10mL，即在短短10min完成吸附，所以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，以及吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，可以分析出，在最初的10min，本實(shí)驗(yàn)采用的本體聚合合成的分子印跡材料，可以吸附飽和吸附容量的5%，即30mg最多可吸附3mg·L-1。由于本體聚合方法的傳質(zhì)速度的影響，如果填料量過少，在10min不能達(dá)到理想的吸附效果;環(huán)境中的雌激素一般都痕量存在，因此填料量過多，不但會(huì)造成印跡材料的浪費(fèi)，還會(huì)影響上樣時(shí)間，使檢測時(shí)間延長，減低時(shí)效性，所以最終選擇填料量為0.030g。

2.1.2 顯色劑間二硝基苯用量的優(yōu)化 顯色劑用量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，印跡材料的填料量為0.030g，上樣濃度為100.00μg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL，上樣時(shí)間控制在10min，即上樣流速為1.0mL·min-1。顯色劑用量分別為 5.00、10.00、15.00g·L-1間二硝基苯溶液各1.0mL。

從圖3可以看出，5.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL基本上沒有顏色，而10.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL用肉眼可以觀察到很淺的顏色，而15.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL可以明顯觀察出顏色，最終選擇顯色劑用量為 15.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL。

圖3 顯色劑用量的優(yōu)化

2.1.3 上樣流速和時(shí)間的優(yōu)化 上樣流速和時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，印跡材料的填料量為0.030g，上樣濃度為10.00μg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL，顯色劑用量為15.00g·L-1間二硝基苯溶液1.0mL。上樣時(shí)間分別為1(采用注射器直接注射雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液)、10、20min，即上樣流速分別為10.0、1.0、0.5mL·min-1。

從圖4可以看出，當(dāng)采用注射器直接注射時(shí)，顏色基本上沒有變化，而采用10.00μg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液10min富集10.0mL，即1.0mL·min-1時(shí)，從顏色上與采用 10.00μg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液 20min富集10.0mL，即0.5mL·min-1的對比，可以判斷，基本上已經(jīng)達(dá)到完全吸附，最終選擇10.00μg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液10min富集10.0mL，即流速1.0mL·min-1為最佳上樣時(shí)間和流速。

圖4 上樣流速和時(shí)間的優(yōu)化注:上樣流速從左到右依次為10.0、1.0、0.5mL·min-1。

2.2 分子印跡材料與非印跡材料的比較

從圖5看出，當(dāng)左邊的MISPE柱填入0.030g分子印跡聚合物，右邊的MISPE柱填入0.030g非印跡聚合物，分別用5.0mL甲醇和雙蒸水來潤洗MISPE柱，然后分別添加50.00μg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0mL，上樣時(shí)間控制在10min，上樣流速為1.0mL·min-1，加入稀氫氧化鉀-乙醇溶液 1.0mL，最后加入濃度為15.00g·L-1顯色劑間二硝基苯溶液1.0mL，在暗處反應(yīng)1h后，可以明顯看到，印跡聚合物材料呈現(xiàn)出紫紅色，說明印跡材料與非印跡材料相比有明顯的顯色反應(yīng)。

圖5 分子印跡材料與非印跡材料的比較注:雌酮濃度均50.00μg·L-1。

2.3 實(shí)際樣品的測定結(jié)果

為了評價(jià)所建立方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，以天津科技大學(xué)校園內(nèi)的湖水為樣品(經(jīng)液相檢測未檢測到含有雌酮)固相萃取與Zimmermann反應(yīng)來檢測實(shí)際樣品中的雌酮的研究，采用三個(gè)濃度(10.00、50.00、100.00μg·L-1)添加，并分別進(jìn)行了顯色反應(yīng)，見圖6。結(jié)果表明:三種濃度下樣品具有比較明顯的顯色反應(yīng)。

湖水經(jīng)過0.2μm水系膜過濾后，放入瓶中備用。

將10.00mg·L-1雌酮標(biāo)準(zhǔn)溶液5、25、50μL添加到湖水樣品中，分別定容至50mL容量瓶中，混勻，4℃保存。

分別將MISPE小柱中裝入0.030g分子印跡材料，分別用5.0mL甲醇和5.0mL雙蒸水潤洗，然后將三個(gè)濃度添加到小柱中，每種濃度富集10.0mL，然后進(jìn)行顯色反應(yīng)。

從圖6中可以看到，濃度從左到右為10.00、50.00、100.00μg·L-1的MISPE小柱的顏色是逐漸加深的。由于湖水有些發(fā)黃，所以導(dǎo)致顏色要比較深。

由圖6可知，所建立的方法對湖水中添加的雌酮具有比較高的靈敏度、準(zhǔn)確性和實(shí)用性。湖水樣品除濾膜過濾外未進(jìn)行其他前處理，表明這種方法用于測定環(huán)境中的實(shí)際樣品時(shí)，幾乎沒有基質(zhì)的影響作用，可以省去傳統(tǒng)方法需要去除復(fù)雜樣品基質(zhì)的影響過程。

圖6 湖水樣品檢測濃度注:雌酮濃度從左到右為10.00、50.00、100.00μg·L-1。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用本體聚合法合成的印跡材料，具有操作條件易于控制，實(shí)驗(yàn)裝置簡單，便于普及等特點(diǎn)，所以是理想的合成吸附材料，將其作為固相萃取材料，通過Zimmermann反應(yīng)，對雌酮的檢測進(jìn)行了定性分析。本研究成功建立了具有高選擇性和高靈敏度檢測雌酮的方法，可用于水中雌酮的快速測定，為測定環(huán)境中雌激素污染物提供了一條有效途徑。

［1］D’Ascenzog，Di Corcia A，Gentili A，et al.Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities［J］.Science of The Total Environment，2003，302 (1-3):199.

［2］Lewis R J.Carcinogenically Active Chemicals［M］.NewYork: Van Nostrand Reinhold Company，1990:133.

［3］Zimmermann W.Method of determination of 17-ketosteroids［J］.Z Vitamhorm Fermentforsh，1951，4(5):456-466.

［4］Wang S，Xu ZX，F(xiàn)anggZ，et al.Separation and Determination of Estrone in Environmental and Drinking Water by Molecularly Imprinted Cartridge Coupled withhPLC［J］.Journal of Separation Science，2008，31(6-7):1181-1188.

Rapid determination estrone method on the basis of molecular imprinted polymer

WANG Shuo，HE Huan，WANG Jun-ping，YAO Yu-chao，SONG Guo-xin
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety Ministry of Education，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China)

A method to detect trace estrone in environment was developed with a novel molecularly imprinted polymer as enrichment sorbent for situ enrichment of estrone by color reaction.The parameters affecting the procedure including the color reagent，the weight of MIPs，loading flow rate and time were optimized.With a loading flow rate of 1.0mL·min-1for sampling 10.0mL of 1.00μg·L-1estrone-methanol solution，then add in watery KOH-ethanol solution 1.0mL and color reagent 1.0mL of m-Dinitrobenzene 15.00g·L-1reacted 1h in dark.The detection limit was 10.00μg·L-1.To evaluate the usefulness of the novel imprinted sorbent，the samples of lake water from Tianjin University of Science＆Technology，determined to be free of estrone，were spiked with three levels of estrone(10.00，50.00 and 100.00μg·L-1)and analyzed after simple pretreatment under optimal experimental conditions.At each concentration，evident change of color in lake water，respectively.It is proved that the detection of estrone in environment is feasible in this method.

estrone;molecularly imprinted polymer;color reaction

TS207.3

A

1002-0306(2011)03-0393-03

雌酮是人體及動(dòng)物自身分泌的一種雌性激素，近年來由于環(huán)境污染的加劇，雌酮在環(huán)境中、食品中殘留問題受到廣泛關(guān)注。雌酮已經(jīng)被證實(shí)在很低的濃度下就會(huì)干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，危害人體的生殖功能，阻礙卵細(xì)胞生長，抑制精子產(chǎn)生，因此，建立環(huán)境和食品中雌酮的檢測方法特別是快速檢測方法對于加強(qiáng)雌酮?dú)埩舻谋O(jiān)控具有重要意義［1-2］。目前，檢測環(huán)境中的雌酮常用方法主要有儀器分析法和免疫分析法。儀器分析法雖然靈敏度高，操作簡單，但費(fèi)用比較昂貴。而免疫分析法雖然靈敏度高，快速簡便，費(fèi)用低，但天然抗體存在制備復(fù)雜、對檢測環(huán)境的溫度和pH等多種條件要求嚴(yán)格，應(yīng)用受到限制。分子印跡技術(shù)是當(dāng)前發(fā)展高選擇性材料主要的方法之一，分子印跡聚合物可以選擇性吸附模板分子，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種難以分離化合物的選擇性分離、富集，是目前國際研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用分子印跡技術(shù)的本體聚合法制備了對雌酮具有特異性吸附的分子印跡聚合物，并應(yīng)用Zimmermann顯色反應(yīng)［3］建立了環(huán)境中的雌酮的快速檢測方法。

2010-01-26

王碩(1969-)，男，博士，教授，研究方向:食品安全檢測。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30571532)。