常用防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌抑菌作用的研究

陳南南，徐 歆，閻永貞，李衛(wèi)芬，*，黃 琴，陳有亮，周緒霞

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院飼料科學(xué)研究所教育部動物分子營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029; 2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029)

常用防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌抑菌作用的研究

陳南南1，徐 歆1，閻永貞1，李衛(wèi)芬1，*，黃 琴1，陳有亮2，周緒霞1

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院飼料科學(xué)研究所教育部動物分子營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029; 2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院動物產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310029)

目的:測定常用食品防腐劑對西式火腿主要腐敗菌的抑制作用。方法:采用微量稀釋法測定不同防腐劑對木糖葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和雷氏普羅威登菌的最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果:對于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚賴氨酸，MIC均為12.5μg/mL;對于地衣芽孢桿菌(G+)，抑菌效果最好的是D-異抗壞血酸鈉、丙酸鈣、檸檬酸和檸檬醛，MIC均為12.5μg/mL;對于雷氏普羅威登菌(G-)，抑菌效果最好的是過氧化氫和檸檬酸，MIC均為25μg/mL。結(jié)論:不同防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌的抑制效果有所差異，應(yīng)復(fù)配使用。

防腐劑，西式火腿腸，腐敗菌，最小抑菌濃度(MIC)，抑菌作用

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用菌株 均為本實(shí)驗(yàn)室從腐敗變質(zhì)的西式火腿腸中分離純化所得，實(shí)驗(yàn)菌株及其培養(yǎng)基見表1;檸檬酸、檸檬醛、脫氫醋酸鈉、山梨酸鉀、紅曲色素、D-異抗壞血酸鈉、尼泊金復(fù)合酯鈉、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、雙乙酸鈉、蘋果酸 杭州大好家添加劑有限公司，食品級;乳酸鈉、30%過氧化氫、丙酸鈣 浙江大學(xué)設(shè)備科，分析純;乳酸鏈球菌素(Nisin) 浙江銀象生物工程有限公司惠贈，食品級;硫酸魚精蛋白 上?？笊锛夹g(shù)有限公司，分析純;溶菌酶 杭州中香化學(xué)有限公司，食品級;那西肽 杭州匯能生物技術(shù)有限公司，分析純;殼聚糖 杭州華東醫(yī)藥股份有限公司，分析純;納它霉素、ε-聚賴氨酸 北京東方瑞德公司，分析純。

AB204-N普及型分析天平、320 pH計 瑞士Mettler Toledo公司;722型分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;超聲波破碎儀 美國Sonic公司;電子數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Multiscan MK3酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo公司。

表1 微生物培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 防腐劑母液的配制及其倍比稀釋 乳酸鈉、雙乙酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣、檸檬酸、檸檬醛、蘋果酸、D-異抗壞血酸鈉、脫氫醋酸鈉和ε-聚賴氨酸溶液:稱取1.28g試劑，無菌水溶解，定容至100mL，搖勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

過氧化氫溶液:量取30%過氧化氫4.27mL，無菌水稀釋，定容至100mL，搖勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯和尼泊金復(fù)合酯鈉溶液:稱取1.28g試劑，無水乙醇溶解，定容至100mL，搖勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

Nisin、硫酸魚精蛋白、溶菌酶和那西肽溶液:稱取1.28g試劑，冰醋酸溶解，定容至100mL，搖勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

殼聚糖溶液:稱取1.28g殼聚糖，稀鹽酸溶解，定容至100mL，搖勻，4℃?zhèn)溆谩?/p>

倍比稀釋:取11支EP管，每管加入0.5mL無菌水，在第1管加入0.5mL母液，混勻，吸取0.5mL混合液至第2管，混勻，再吸取0.5mL混合液至第3管，如此反復(fù)操作直至第11管，濃度依次為6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL。

1.2.2 菌液制備 本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌生長法。將三種腐敗菌置于各自的選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取典型形態(tài)的供試菌落，接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min，培養(yǎng)2～6h至對數(shù)生長期。取適量菌液，用LB液體培養(yǎng)基調(diào)整濃度至105cfu/mL。

1.2.3 MIC測定 無菌條件下，依次將不同防腐劑的各倍比稀釋溶液按稀釋度從低到高加入到無菌96孔板的第1列至第11列，每孔50μL，每個稀釋度3個重復(fù)，第12列為陽性對照，加等量無菌水。隨后每孔再加入50μL菌液，密封混勻。此時，第1列至第11列防腐劑終濃度分別為3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL。用酶標(biāo)儀測定0h的OD630值，然后將96孔板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再次測定OD630值。通過對比0h與24h時菌液的OD630值，確定不同防腐劑對各主要腐敗菌的MIC，以此衡量抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

各種常用食品防腐劑對西式火腿腸的主要腐敗菌的抑制作用見表2。

表2 不同防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌的MIC

由表2可見，在本抑菌實(shí)驗(yàn)中所用的20種防腐劑中，大部分防腐劑僅對一種或二種受試菌抑制效果較好，而對三種受試菌均具有良好抑菌效果(MIC≤200μg/mL)的只有4種，檸檬酸、檸檬醛、脫氫醋酸鈉和ε-聚賴氨酸。對于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚賴氨酸，MIC為12.5μg/mL;其次是硫酸魚精蛋白、溶菌酶和那西肽，MIC均為25μg/mL;再次是檸檬醛和脫氫醋酸鈉，MIC均為50μg/mL;較差的有乳酸鈉和山梨酸鉀，MIC均為1600μg/mL;最差的是丙酸鈣、對羥基苯甲酸甲酯，MIC均為3200μg/mL。對于地衣芽孢桿菌(G+)，抑菌效果最好的是丙酸鈣、檸檬酸、檸檬醛和D-異抗壞血酸鈉，MIC均為12.5μg/mL;其次是山梨酸鉀和脫氫醋酸鈉，MIC均為25μg/mL;再次是雙乙酸鈉、硫酸魚精蛋白、ε-聚賴氨酸和那西肽，MIC均為50μg/mL;較差的是殼聚糖，MIC均為3200μg/mL;最差的是過氧化氫，其在本次實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)未能表現(xiàn)出抑菌作用。對于雷氏普羅威登菌(G-)，抑菌效果最好的是過氧化氫和檸檬酸，MIC均為25μg/mL;其次是檸檬醛，MIC為50μg/mL;再次是ε-聚賴氨酸，MIC為100μg/mL;較差的是那西肽，MIC分別為3200μg/mL;最差的是Nisin、D-異抗壞血酸鈉和溶菌酶，它們在本次實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)未能表現(xiàn)出抑菌作用。

3 討論

3.1 Nisin

Nisin對許多G+菌，包括葡萄球菌、李斯特氏菌、鏈球菌、微球菌、分枝桿菌、棒桿菌和乳桿菌等，具有明顯的抗菌活性;一些產(chǎn)孢子的G+菌，如芽孢桿菌、梭菌對Nisin尤其敏感，而它們的孢子比營養(yǎng)細(xì)胞更敏感;但Nisin對G-菌、酵母菌和霉菌沒有作用［2］。張百剛等［3］對Nisin的抑菌作用進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，在相同的處理?xiàng)l件下，Nisin對枯草芽孢桿菌(G+)的抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌(G+)的抑菌效果也較好，但是對大腸桿菌(G-)的抑茵效果最差。本實(shí)驗(yàn)中，Nisin對木糖葡萄球菌(G+)與地衣芽孢桿菌(G+)均表現(xiàn)出了很好的抑菌效果，而對雷氏普羅威登菌(G-)無抑菌作用。雖然本實(shí)驗(yàn)與前一實(shí)驗(yàn)所用菌種有所不同，但再一次證明了Nisin對G+菌具有優(yōu)異的抑菌活性，但也存在對G-菌抑菌活性差的缺點(diǎn)。因此，在設(shè)計復(fù)配防腐劑配方時，可將Nisin與對G-菌具有良好抑菌活性的防腐劑進(jìn)行組合。

3.2 山梨酸鉀

在本實(shí)驗(yàn)中，山梨酸鉀對地衣芽孢桿菌(G+)具有很強(qiáng)的抑菌活性，對雷氏普羅威登菌(G-)的抑菌活性一般，而對木糖葡萄球菌(G+)抑菌活性較差，這與前人的研究成果相符。裴家偉等［4］研究了山梨酸鉀對5株羊肉腐敗菌株的抑菌效果，結(jié)果表明，0.25‰以上山梨酸鉀能夠有效抑制105cfu/mL G+短芽孢桿菌的生長，但對G+球菌、G-螺旋菌和腸桿菌效果不明顯?？梢?，山梨酸鉀的抑菌作用具有一定的針對性和局限性，不宜單獨(dú)用于肉與肉制品的防腐保鮮［5-6］。

3.3 檸檬酸和檸檬醛

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明檸檬酸和檸檬醛具有廣譜的抑菌作用，這與他人的報道較一致。石玉新發(fā)現(xiàn)檸檬酸對嗜水氣單胞菌(G-)、副溶血弧菌(G-)和熒光假單胞菌(G-)的MIC分別為1100、800、1250μg/mL［7］。檸檬醛屬于開鏈單萜，具有檸檬醛a(香葉醛)和檸檬醛b(橙花醛)兩種順反異構(gòu)體，其對金黃色葡萄球菌(G+)、大腸桿菌(G-)、傷寒桿菌(G-)和痢疾桿菌(G-)有較高的抑菌活性［8］。林翠梧等報道毛葉木姜子葉油(含有檸檬醛)在1000μg/mL的情況下，可以完全抑制枯草桿菌(G+)、白葡萄球菌(G+)和四鏈球菌(G+)的繁殖，對大腸桿菌(G-)也有一定的抑制作用［9］。

3.4 硫酸魚精蛋白

硫酸魚精蛋白，又稱精蛋白、魚精蛋白、魚精蛋白硫酸鹽，是從成熟雄魚的精囊組織中提取的一種低分子量強(qiáng)堿性蛋白，對G+菌、酵母菌、霉菌均有良好的抑菌活性，但對G-菌的抑制作用較差。王南舟等［10］研究發(fā)現(xiàn)魚精蛋白對食品常見污染菌的生長有很強(qiáng)的抑制效果，MIC均在1000μg/mL以下，對G+菌效果更好。王陸玲等［11］的結(jié)果顯示，魚精蛋白對供試G+菌有很好的抑制作用，其MIC均小于100μg/mL，但對供試革蘭氏陰性菌作用較弱，其 MIC均大于1500μg/mL，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

3.5 脫氫醋酸鈉和雙乙酸鈉

本實(shí)驗(yàn)中，脫氫醋酸鈉對木糖葡萄球菌(G+)、地衣芽孢桿菌(G+)與雷氏普羅威登菌(G-)的MIC分別為50、25和200μg/mL，表明其是一種高效、廣譜抑菌的食品防腐劑，這與黎婉園等的研究結(jié)果一致［12］。而肖紅等［13］的研究表明，雙乙酸鈉需要較高濃度(25g/L)才對細(xì)菌有抑制作用，這可能與所用菌種及菌液初始濃度不同有關(guān)。

3.6 ε-聚賴氨酸

本實(shí)驗(yàn)中，ε-聚賴氨酸對三種西式火腿腸主要腐敗菌的MIC均低于100μg/mL，表現(xiàn)出高效廣譜的抑菌活性，這與前人的研究結(jié)果相符。秦蕓樺等［13］的研究表明，ε-聚賴氨酸的抑菌譜很廣，除枯草桿菌和蠟狀芽孢桿菌對其的耐受性比較好外，其它細(xì)菌對其的敏感性均比較強(qiáng)，MIC都不高于25mg/L。李誠等［14］研究表明，ε-聚賴氨酸對大腸桿菌(G-)、金黃色葡萄球菌(G+)和保加利亞乳桿菌(G+)的MIC均為12.5mg/L，對枯草芽孢桿菌(G+)為25mg/L。值得注意的是，ε-聚賴氨酸作為新型的天然防腐劑，還具有水溶性好、安全性高、熱穩(wěn)定性好、抑菌pH范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［15］。

3.7 那西肽

那西肽屬于含硫多肽類抗生素，由一種從阿根廷土壤中分離出的放射菌培養(yǎng)生成，對細(xì)菌等病原微生物有抑制、殺滅作用。周善湘等［15］比較了國產(chǎn)和進(jìn)口那西肽的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)兩者抑菌效果一致，對葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬及四聯(lián)球菌屬的14株革蘭氏陽性菌均有明顯的抑制作用，各菌的MIC均不高于1μg/mL，部分僅為0.001μg/mL;而對腸桿菌科、假單胞菌屬及不動桿菌屬等革蘭氏陰性菌的抑制作用不理想，各菌的MIC＞125μg/mL。本實(shí)驗(yàn)中，那西肽對木糖葡萄球菌(G+)與地衣芽孢桿菌(G+)均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用，而對雷氏普羅威登菌(G-)的抑制作用很弱，這與前人的研究結(jié)果一致。綜上所述，那西肽僅能有效抑制G+菌，因此適合與抗G-菌的防腐劑配合使用。

3.8 主要腐敗菌對不同防腐劑的敏感性

G+菌和G-菌的結(jié)構(gòu)差異表現(xiàn)在細(xì)胞壁上。G+菌細(xì)胞壁較厚，肽聚糖含量豐富，但組成簡單，通透性較高;而G-菌細(xì)胞壁較薄，肽聚糖含量少，但組成復(fù)雜，包含磷脂、蛋白質(zhì)和脂多糖(LPS)等成分，結(jié)構(gòu)致密，僅允許分子量小于600的分子通過。由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)存在上述顯著不同，導(dǎo)致這兩類細(xì)菌在染色性、抗原性、毒性和藥物敏感性等方面都存在很大的差異［17］。本實(shí)驗(yàn)中，不同防腐劑對主要腐敗菌的MIC直接反映了主要腐敗菌對不同防腐劑的敏感性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，受試G+菌與G-菌對大部分防腐劑的敏感性確實(shí)存在一定的差異?？梢姡茉嚲募?xì)胞壁結(jié)構(gòu)直接影響了防腐劑的抑菌效果。

雖然木糖葡萄球菌和地衣芽孢桿菌同屬于G+菌，但兩者對本實(shí)驗(yàn)所用防腐劑的敏感性也不盡相同。木糖葡萄球菌對Nisin、尼泊金復(fù)合酯鈉、過氧化氫、硫酸魚精蛋白、ε-聚賴氨酸、溶菌酶、那西肽和殼聚糖的敏感性高于地衣芽孢桿菌。在上述防腐劑中，僅尼泊金復(fù)合酯鈉和過氧化氫是分子量小于200的化學(xué)防腐劑，其他皆為天然防腐劑，且分子量均在1000以上。而地衣芽孢桿菌對雙乙酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、檸檬酸、檸檬醛、D-異抗壞血酸鈉和脫氫醋酸鈉較為敏感，這些防腐劑大多為分子量不超過220的化學(xué)防腐劑?？梢姡咎瞧咸亚蚓鷮Ψ肿恿枯^高的天然防腐劑較為敏感，而地衣芽孢桿菌對分子量較低的化學(xué)防腐劑較為敏感，這可能與G+球菌和桿菌的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及組成不同有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中，對雷氏普羅威登菌具有良好抑菌效果(MIC≤200μg/mL)的防腐劑有對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸甲酯、過氧化氫、檸檬酸、檸檬醛和ε-聚賴氨酸6種，其中僅ε-聚賴氨酸為天然防腐劑，其他皆為化學(xué)防腐劑。而前文提及僅分子量小于600的分子能通過G-菌的細(xì)胞壁。因此推斷，雷氏普羅威登菌對上述化學(xué)防腐劑敏感可能是由于它們的分子能穿透細(xì)胞壁而作用于細(xì)菌胞體。至于ε-聚賴氨酸，可能是以某種特殊的方式穿透雷氏普羅威登菌的細(xì)胞壁，其主要抑菌機(jī)理是抑制細(xì)菌的呼吸作用，同時作用于細(xì)胞膜和蛋白合成系統(tǒng)，與核糖體結(jié)合抑制蛋白和酶的合成，從而達(dá)到殺菌目的［15，18］。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)測定了19種常用食品防腐劑對3種西式火腿主要腐敗菌的MIC。對于木糖葡萄球菌(G+)，抑菌效果最好的是Nisin和ε-聚賴氨酸，MIC均為12.5μg/mL;對于地衣芽孢桿菌(G+)，抑菌效果最好的是D-異抗壞血酸鈉、丙酸鈣、檸檬酸和檸檬醛，MIC均為12.5μg/mL;對于雷氏普羅威登菌(G-)，抑菌效果最好的是過氧化氫和檸檬酸，MIC均為25μg/mL。同時，不同防腐劑對西式火腿腸主要腐敗菌的抑制效果有所差異，應(yīng)復(fù)配使用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)的西式火腿腸安全復(fù)配型防腐劑的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style ham-sausages

CHEN Nan-nan1，XU Xin1，YAN Yong-zhen1，LI Wei-fen1，*，HUANG Qin1，CHEN You-liang2，ZHOU Xu-xia1
(1.Key Laboratory of Molecular Animal Nutrition Ministry of Education，Institute of Feed Science，College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China; 2.Laboratory of Animal Product Processing，College of Animal Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:The bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style hamsausages was studied.Methods:The minimal inhibition concentration(MIC)of different preservatives for Staphylococcus xylosus，Bacillus licheniformis and Providencia rettgeri was determined by mean of micro-dilution assay.Results:The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=12.5μg/mL)to Staphylococcus xylosus(G+cocci)were Nisin and ε-poly-L-lysine.The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=12.5μg/mL)to Bacillus licheniformis(G+bacillus)were D-Sodium isoascorbiate，calcium propionate，citric acid and citral.The preservatives with the best inhibitory effect(MIC=25μg/mL)to Providencia rettgeri(G-bacillus)were hydrogen peroxide，citric acid and ε-poly-L-lysine.Conclusion:The bacteriostasis of common preservatives for major spoilage bacteria in western-style ham-sausages was irregular and it’s better to use compound preservatives.

preservative;western-style ham-sausages;spoilage bacteria;minimal inhibition concentration (MIC);bacteriostasis

TS202.3

A

1002-0306(2011)03-0343-04

微生物大量繁殖是引起食品腐敗變質(zhì)的最主要因素［1］。為了延長食品的保藏期，人們在食品加工過程采用各種手段使微生物喪失活性、延緩或阻止其生長。添加防腐劑是其中一種非常方便、有效的食品防腐方法，因而被普遍采用。食品防腐劑根據(jù)其來源和性質(zhì)分為化學(xué)防腐劑和天然防腐劑兩大類。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及檢測手段的完善，人們逐漸發(fā)現(xiàn)一些化學(xué)防腐劑存在誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題。而天然防腐劑具有抗菌性強(qiáng)、安全無毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等化學(xué)防腐劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，不但對人體健康無害，而且還具有一定的營養(yǎng)價值。因此開發(fā)高效、安全、穩(wěn)定的天然防腐劑已成為食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前已被國家批準(zhǔn)使用的天然防腐劑有乳酸鏈球菌素(Nisin)、溶菌酶、ε-聚賴氨酸、殼聚糖等。本實(shí)驗(yàn)室分析了西式火腿腸主要腐敗菌的菌相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西式火腿腸在25℃下保存28d開始變質(zhì)，主要腐敗菌為:腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、葡萄球菌、弧菌和李斯特菌，分別占細(xì)菌總數(shù)的33%、14%、12%、9%、3%和0.9%，其中鑒定的腐敗菌有9株，分別為雷氏普羅威登菌、鮑氏不動桿菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯菌、傷口埃希菌、河生腸桿菌、木糖葡萄球菌、淺金黃色單胞菌和地衣芽孢桿菌。并測定了19種常用食品防腐劑對木糖葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和雷氏普羅威登菌3種西式火腿主要腐敗菌的最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration，MIC)，旨在為西式火腿腸安全復(fù)配型防腐劑的研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2010-02-25 *通訊聯(lián)系人

陳南南(1982-)，男，碩士研究生，主要從事微生物方面的研究。

浙江省重大科研專項(xiàng)(2006C12066)。