響應(yīng)面法玉米蛋白肽鋅制備條件的優(yōu)化

唐軍虎，康瑋麗，任志艷，敬思群

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

響應(yīng)面法玉米蛋白肽鋅制備條件的優(yōu)化

唐軍虎，康瑋麗，任志艷，敬思群*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

以玉米蛋白粉為原料，堿性蛋白酶酶解制得玉米肽，與硫酸鋅螯合后，得到玉米蛋白肽鋅。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Minitab15.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法優(yōu)化制備玉米蛋白肽鋅的工藝。結(jié)果表明:最佳的制備條件為反應(yīng)時(shí)間90min、pH為5、溫度63℃、蛋白肽與鋅的摩爾比為2∶1，在此條件下，螯合率為57.9%。

玉米蛋白肽鋅，制備，響應(yīng)面分析法，優(yōu)化

玉米蛋白粉 由新疆天達(dá)生物有限公司提供;玉米醇溶性蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制;堿性蛋白酶 北京諾維信公司;化學(xué)試劑 均為分析純。

微型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)，數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，水浴鍋，酸度計(jì)，離心機(jī)，電子天平，凱氏定氮儀，冷凍干燥機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的酶解 玉米醇溶蛋白→90℃熱變性處理→冷卻至50℃→調(diào)pH至9.0→加入堿性蛋白酶→酶解5h→滅酶(90℃/20min)→離心(5000r/min)→玉米蛋白酶解液

1.2.2 玉米蛋白肽鋅的制備

1.2.2.1 玉米蛋白肽鋅的工藝流程 玉米蛋白酶解液→測(cè)水解度→加入ZnSO4→攪拌→調(diào)節(jié)溫度→調(diào)節(jié)pH→螯合→濃縮→冷凍干燥→玉米蛋白肽鋅

1.2.2.2 玉米蛋白肽鋅制備的單因素實(shí)驗(yàn) 以玉米蛋白肽鋅的螯合率作為指標(biāo)，分別考察pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間、蛋白肽與鋅的摩爾比四個(gè)因素對(duì)玉米蛋白肽鋅制備的影響，每個(gè)因素設(shè)定5個(gè)梯度，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.3 玉米蛋白肽鋅制備條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以pH、溫度、蛋白肽與鋅的摩爾比三個(gè)因子為自變量(分別以X1，X2，X3表示)，以螯合率(%，以A表示)為響應(yīng)值設(shè)計(jì)了三因素三水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)零點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)因素水平如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 玉米蛋白肽鋅的定性分析 采用硫化鈉法。

1.2.3.2 過(guò)氧化值(POV)的測(cè)定 采用 GB/ T5009.37-2003測(cè)定樣品中的POV值。

1.2.3.3 螯合率測(cè)定 取10mL螯合液，按1∶8的體積比加入80mL的無(wú)水乙醇，經(jīng)充分?jǐn)嚢韬箅x心，用EDTA滴定上層的醇層［5］。

螯合率(%)=(金屬離子總量-游離離子含量)/金屬離子總量×100%=C(V2-V1)/CV2× 100%=(V2-V1)/V2×100%

其中:C-EDTA的摩爾濃度;V1-滴定未螯合金屬離子所用EDTA的體積;V2-滴定總加入金屬離子所用EDTA的體積;

1.2.3.4 鋅含量的測(cè)定 采用EDTA滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米蛋白肽鋅制備條件的優(yōu)化

2.1.1 pH對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 pH條件是影響多肽螯合微量元素形成螯合物的重要因素。在pH較低的酸性條件下，H+將與鋅離子競(jìng)爭(zhēng)供電子基團(tuán)，不利于多肽微量元素螯合物的生成:在pH較高的條件下，羥基與供電子基團(tuán)爭(zhēng)奪了鋅離子而優(yōu)先生成氫氧化鋅沉淀。

選取pH4.5～6.5，溫度50℃，時(shí)間1h，蛋白肽與鋅鹽的摩爾比2∶1的條件下，探討pH對(duì)螯合反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

由圖1可知，pH偏高或偏低都會(huì)對(duì)螯合率產(chǎn)生較大的影響，在pH為5.5左右時(shí)，螯合率最高，因此，采用pH5.0、5.5、6.0進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 蛋白肽與鋅的摩爾比對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 在溫度50℃，時(shí)間1h和pH 5.0時(shí)，探討蛋白肽與鋅的摩爾比對(duì)螯合反應(yīng)的影響，蛋白肽的摩爾數(shù)取蛋白肽水解液中的游離氨基的摩爾數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，蛋白肽與鋅的摩爾比對(duì)螯合反應(yīng)的影響很大，當(dāng)比值過(guò)大時(shí)，蛋白肽鋅的螯合率較小，且造成原料浪費(fèi);過(guò)小，則不利于螯合反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)比值為2∶1時(shí)，螯合率最大。因此實(shí)驗(yàn)中選取摩爾比值為1∶1、2∶1、3∶1進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

圖2 蛋白肽與鋅的摩爾比對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 選取溫度50℃，pH 5.5，蛋白肽與鋅的摩爾比為2∶1進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合反應(yīng)影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

從圖3可以看出，在螯合反應(yīng)的前60min，螯合率雖有增加，但是增長(zhǎng)不大，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到90min以后，螯合率變化趨于穩(wěn)定，因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇90min作為反應(yīng)條件，并且不將反應(yīng)時(shí)間作為響應(yīng)面分析法的考察因素。

2.1.4 溫度對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響 在時(shí)間90min，pH5.5時(shí)，蛋白肽與鋅的摩爾比為2∶1的條件下，進(jìn)行溫度對(duì)螯合反應(yīng)影響實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)玉米蛋白肽鋅螯合率的影響

由圖4可以看出，溫度對(duì)螯合反應(yīng)有顯著的影響。螫合率隨著溫度的增加而升高，當(dāng)溫度達(dá)到60℃后，螯合率變化趨于平緩，因此，在研究中選50、60、70℃進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

2.1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米蛋白肽鋅的制備條件 實(shí)驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，以螯合率作為響應(yīng)值用Minitab15.0程序進(jìn)行分析，并得出響應(yīng)面分析圖、回歸擬合方程以及方差分析表。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Minitab15.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表3得出擬合二次多項(xiàng)式方程為:

表4 方差分析

表2 三因素三水平中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 三因素三水平中心組合參數(shù)估計(jì)

由表3可知，對(duì)方程影響顯著程度由大到小依次為摩爾比、溫度、pH，溫度和摩爾比對(duì)方程影響最顯著，說(shuō)明這二者直接關(guān)系螯合率的大小，而pH的影響在一定范圍內(nèi)并不是很顯著，并且得知方程大多數(shù)一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)的影響都是顯著的，各因素之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。

由表4可知，模型的回歸顯著，交互作用較好;失擬項(xiàng)F值很小，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此可以用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

同時(shí)做出中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得的三組響應(yīng)面曲面圖(圖5～圖7)。響應(yīng)面圖形是特定的響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)的因素X1、X2、X3構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對(duì)響應(yīng)值的影響。圖中可看到擬合曲面有最大值，對(duì)擬合方程求偏導(dǎo)，可得出模型最大值，即為最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方案。

圖5 pH和摩爾比對(duì)螯合率影響的響應(yīng)面分析

圖6 pH和溫度對(duì)螯合率影響的響應(yīng)面分析

圖7 溫度和摩爾比對(duì)螯合率影響的響應(yīng)面分析

為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的值，利用上述分析進(jìn)行最優(yōu)工藝的推導(dǎo)，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)為零并整理得:

聯(lián)立上述三個(gè)方程求解，得到 X1=-0.1390，X2=0.2829，X3=0.2161。換算后得到最佳工藝條件是pH為5.4、溫度62.83℃、摩爾比為2.2∶1?？傻抿下实念A(yù)測(cè)值為58.3%。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件再重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，考慮到實(shí)際操作的便利，將工藝參數(shù)修正為:pH為5、溫度63℃、摩爾比為2∶1。在此條件下玉米蛋白肽鋅的螯合率達(dá)到57.9%，相對(duì)誤差為0.6%，證明了方程可靠性與響應(yīng)面分析法的有效性。

2.2 硫化鈉法鑒定分析的結(jié)果

氨基酸螯合物是氨基酸基團(tuán)中的C和N原子與金屬離子配位，形成環(huán)狀的螯合分子結(jié)構(gòu)。金屬硫化物的穩(wěn)定常數(shù)遠(yuǎn)大于螯合物的穩(wěn)定常數(shù)，當(dāng)加入硫化鈉時(shí)，S2-與穩(wěn)定螯合物中的金屬離子反應(yīng)，生成了更穩(wěn)定的金屬硫化物沉淀，從而使螯合物中的氨基酸或肽游離出來(lái)，與茚三酮發(fā)生顯色反應(yīng)，可以利用這一性質(zhì)來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行定性鑒定［6-7］。

把不加硫化鈉的樣液加熱至沸騰，用茚三酮試劑檢測(cè)，溶液顏色沒(méi)有發(fā)生改變;加入過(guò)量的硫化鈉用玻璃棒攪勻靜置一段時(shí)間后，溶液中有白色沉淀生成;過(guò)濾后濾液用茚三酮試劑檢測(cè)，濾液變?yōu)樗{(lán)紫色。即原待測(cè)物質(zhì)的溶液中沒(méi)有游離的蛋白肽，在生成金屬無(wú)機(jī)鹽沉淀后，又有了游離的蛋白肽。這說(shuō)明待測(cè)物質(zhì)是蛋白肽和金屬形成的一種特殊物質(zhì)，它不像蛋白肽金屬鹽那樣在水中以離子狀態(tài)存在，也不像無(wú)機(jī)沉淀那樣不溶于水，即其穩(wěn)定性大于可溶性無(wú)機(jī)鹽，而小于無(wú)機(jī)沉淀。初步判斷該物質(zhì)為玉米蛋白肽鋅螯合物。

3 結(jié)論

硫化鈉法鑒定分析結(jié)果表明，本研究所制備螯合物是玉米蛋白肽鋅。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以pH、溫度、蛋白肽與鋅的摩爾比三個(gè)因子為自變量，采用響應(yīng)面分析法，得到回歸方程，研究這3個(gè)因子的主效應(yīng)和交互效應(yīng)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，以得到提高產(chǎn)品質(zhì)量的最佳參數(shù)，使原料得到充分的利用。玉米蛋白肽鋅的最佳制備工藝為:pH為5、溫度63℃、摩爾比為2∶1，反應(yīng)時(shí)間為90min，在此條件下螯合率可以達(dá)到57.9%。

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Optimization of the preparation of corn-peptide-zinc

TANG Jun-hu，KANG Wei-li，REN Zhi-yan，JING Si-qun*
(College of Life Sciences＆Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Corn peptide was obtained via alkali protein enzyme enzymolysis with corn gluten meal as raw material，and then chelated with ZnSO4and corn-peptide-zinc(CPZ)was produced.The preparation process of CPZ was optimized according to Box-Behnken central composition design principle.The method of response surface analysis with 3 factors and 3 levels combined with Minitab15.0-statistical data analysis software was adopted. According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows:reaction time 90min，pH5，temperature 63℃，mol ratio 2∶1.Under these conditions，the chelating rate was up to 57.9%.

corn-peptide-zinc;preparation;response surface methodology(RSM);optimization

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0294-04

玉米蛋白粉(Corn gluten meal，CGM)是玉米淀粉生產(chǎn)味精的副產(chǎn)品。據(jù)官方統(tǒng)計(jì)，新疆玉米種植面積約800萬(wàn)畝，產(chǎn)地分布南北疆各地，年產(chǎn)量可達(dá)360～400萬(wàn)t。新疆天達(dá)生物工程有限公司以玉米為原料，現(xiàn)年產(chǎn)味精3.6萬(wàn)t，同時(shí)產(chǎn)生蛋白粉4200t，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)含量高達(dá)61.5%，是制備玉米短肽、氨基酸的良好原料，具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值［1-2］。近年來(lái)，出現(xiàn)了有關(guān)于植物蛋白為原料，生產(chǎn)具有穩(wěn)定性好、吸收率高、生物效價(jià)高、毒性小等優(yōu)點(diǎn)的小肽螯合鹽的報(bào)道［3-4］，但玉米蛋白肽鋅的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在玉米蛋白肽鋅的制備過(guò)程中，螯合條件的確定是至關(guān)重要的。傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)雖然能夠同時(shí)考慮幾種因素，并確定最佳組合，卻不能找出因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，即回歸模型，從而無(wú)法找到全部水解因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。本研究通過(guò)Minitab15.0軟件，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化酶解玉米蛋白制備玉米蛋白肽鋅的工藝，通過(guò)建立數(shù)學(xué)模型，以期獲得最優(yōu)的生產(chǎn)工藝參數(shù)，獲得最佳制備工藝，為玉米蛋白肽鋅的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2010-03-26 *通訊聯(lián)系人

唐軍虎(1984-)，男，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。

新疆維吾爾自治區(qū)科技科技支疆項(xiàng)目資助(200991236)。