絮凝法處理苯乳酸發(fā)酵液的研究

程 璐，楊 青，繆 銘，張 濤，江 波，沐萬孟

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

絮凝法處理苯乳酸發(fā)酵液的研究

程 璐，楊 青，繆 銘，張 濤，江 波，沐萬孟*

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

對絮凝法處理苯乳酸發(fā)酵液進行了研究。以絮凝率和苯乳酸回收率為指標，研究了7種絮凝劑對苯乳酸發(fā)酵液絮凝效果的影響，并通過單因素實驗和正交實驗對絮凝條件進行優(yōu)化。Al2(SO4)3作為適宜的絮凝劑，其最佳絮凝條件為:pH為3.0，溫度為30℃，絮凝劑用量為8g/L，以100r/min振蕩35min。在此條件下發(fā)酵液脫色率達到60.88%，苯乳酸回收率達到88.13%。

苯乳酸，發(fā)酵液，絮凝

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳 桿 菌 (Lactobacillus sp.SK007;GenBank accession number:DQ534529) 由本實驗室從傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中自篩得到;硫酸鋅、氯化鋁、硫酸鋁、明礬、尿素、殼聚糖、海藻酸鈉(脫乙酰度90%) 均為工業(yè)級產品;其他試劑 均為分析純。

Spectrum721E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;HH-6數顯水浴恒溫振蕩器 蘇州威爾實驗用品有限公司;GL-20B冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;高效液相色譜儀 Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯乳酸的發(fā)酵培養(yǎng) 利用自行篩選的乳酸菌Lactobacillus sp.SK007，以含苯丙酮酸底物(含量為5g/L)的MRS培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，30℃靜置發(fā)酵24h; 4000r/min離心10min，棄菌體，取發(fā)酵上清液為苯乳酸發(fā)酵液進行實驗［9］。

1.2.2 苯乳酸發(fā)酵液熱處理 首先使用冷凍離心，苯乳酸發(fā)酵液在4℃，8000r/min條件下離心15min，取出上清液，上清液加熱到95℃，保持30min，使蛋白質熱變性沉淀，離心，取上清液。

1.2.3 絮凝操作 選擇合適的絮凝劑:取待處理料液100mL，分別加入絮凝劑0.8g，調節(jié)pH為4.0，攪拌10min，在4℃，10000r/min條件下離心15min，取出上清液，稀釋20倍，用721型分光光度計以蒸餾水做空白于600nm處測其OD(optical density)值，同時采用高效液相色譜測定苯乳酸含量。

取25mL苯乳酸發(fā)酵液裝入100mL三角瓶中，用4%的HCl和4%的NaOH溶液調節(jié)pH和溫度，加入所選的絮凝劑(空白不加)，在數顯水浴恒溫振蕩器中以一定轉速振蕩一定時間，靜置30min后取上清液稀釋3倍，備用。

1.3 分析方法

1.3.1 絮凝效果的比較 采用絮凝率(floeculatin ratio，F(xiàn)R)作為衡量絮凝效果的指標。將絮凝液靜置30min后，取1mL上清液稀釋3倍，用721型分光光度計以蒸餾水做空白于600nm處測其OD值，與空白試樣比較，計算FR值。

FR值計算公式:FR(%)=(OD絮凝前-OD絮凝后)/ OD絮凝前×100%，F(xiàn)R值越大，說明絮凝效果越好。

1.3.2 苯乳酸含量的測定 采用高效液相色譜測定;色譜條件:色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18(150mm ×4.6 mm，5μm);流動相:A泵為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B泵為0.05%三氟乙酸水溶液;流速: 1mL/min;進樣量:10μL;柱溫:30℃;檢測波長: 210nm;洗脫方式:梯度洗脫:0～20min(10%A～100% A)，20～23min(100%A)，23～25min(100%A～10% A)，25～30min(10%A)。

苯乳酸回收率的計算公式:苯乳酸回收率(%) =絮凝后發(fā)酵液中苯乳酸總量/絮凝前發(fā)酵液中苯乳酸總量×100%

2 結果與討論

2.1 絮凝劑的選擇

硫酸鋅、氯化鋁、硫酸鋁、明礬、尿素、殼聚糖、海藻酸鈉等是常用的絮凝劑，實驗在相同的條件下對比了這7種絮凝劑對苯乳酸發(fā)酵液的處理效果，以FR值為主要指標，苯乳酸回收率為參考指標進行篩選，作用效果見表1。

表1 7種絮凝劑的比較

由實驗結果可知，采用硫酸鋁絮凝劑時的FR值最大，說明其絮凝效果最好，并且苯乳酸的回收率的也較高。雖然采用殼聚糖或硫酸鋅絮凝劑處理時，苯乳酸回收率大于硫酸鋁絮凝劑，但二者的FR值比硫酸鋁絮凝劑小得多，所以認為硫酸鋁絮凝劑處理苯乳酸發(fā)酵液的效果最好，故選取硫酸鋁做進一步實驗。

2.2 絮凝條件的選擇

2.2.1 pH對絮凝效果的影響 取熱處理后的發(fā)酵液，調節(jié)pH為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，添加等量的硫酸鋁(8g/L)，溫度控制在30℃，在振蕩器中以100r/min振蕩15min，研究pH對發(fā)酵液絮凝效果和PLA回收率的影響，結果見圖1。由圖1可知，pH對絮凝作用的影響非常大。發(fā)酵液pH為3.0時，絮凝效果最好，PLA回收率也較高，達到75.6%。在較高和較低的pH下，絮凝效果都不好。pH較低時，苯乳酸分子離解度小，溶液中酸根負離子少，對鋁離子的吸附也少;隨著pH升高，離解度增大，酸根負離子增多，對陽離子的吸附增大，即與鋁離子絡合作用增加。pH較高時，雖然PLA回收率繼續(xù)增加，但由于OH-的濃度增加，出現(xiàn)了氫氧化鋁沉淀或形成氫氧化鋁凝膠，絮凝效果明顯變差，因此，pH太高或太低對絮凝都不利，應把發(fā)酵液控制在合適的pH，權衡兩個指標，選擇pH為1.0、2.0、3.0作為正交實驗的因素水平。

圖1 pH對苯乳酸發(fā)酵液絮凝效果的影響

2.2.2 溫度對絮凝效果的影響 將熱處理后的發(fā)酵液pH調至3.0，添加等量的硫酸鋁(8g/L)，設計溫度為25、30、35、40、45、50℃，在振蕩器中以100r/min振蕩15min，研究溫度對發(fā)酵液絮凝效果和PLA回收率的影響，結果見圖2。由圖2可見，溫度是影響絮凝效果的又一重要因素。隨著溫度的升高，F(xiàn)R值逐漸增大，在40℃時達到最高值，絮凝效果最好。溫度升高發(fā)酵液的粘度減小，分子運動加快，有利于絮凝團的形成和沉淀。但是溫度過高，F(xiàn)R值將減小，原因可能是絮凝反應的速度過快，形成的絮凝團細小，并使絮凝團的水和作用增加，絮凝效果變差。綜合考慮FR值和PLA回收率，選擇30、40、50℃作為正交實驗的因素水平。

圖2 溫度對苯乳酸發(fā)酵液絮凝效果的影響

2.2.3 絮凝劑用量對絮凝效果的影響 將熱處理后的發(fā)酵液pH調至3.0，添加不同用量的硫酸鋁至6、7、8、9、10g/L，溫度控制在 40℃，在振蕩器中以100r/min振蕩15min，研究絮凝劑用量對發(fā)酵液絮凝效果和PLA回收率的影響，結果見圖3。從圖3可知，硫酸鋁濃度在低于8g/L時，因硫酸鋁量不足以滿足絮凝要求，故絮凝效果隨著絮凝劑的用量增加而增大。但當絮凝劑用量達到一定值(8g/L)時，F(xiàn)R出現(xiàn)峰值，再增加用量，絮凝效果效果反而下降，這可能是由于高濃度的硫酸鋁在水中生成了一系列的水解產物，形成了氫氧化鋁沉淀或膠體，從而對絮凝不利。另外硫酸鋁濃度高于8g/L后，PLA回收率也較高，保持在87%左右。因此選擇用量7、8、9g/L作為正交實驗的因素水平。

圖3 絮凝劑用量對苯乳酸發(fā)酵液絮凝效果的影響

2.2.4 水浴振蕩速度對絮凝效果的影響 將熱處理后的發(fā)酵液pH調至3.0，添加等量的硫酸鋁(8g/L)，溫度控制在40℃，取振蕩器振蕩速度分別為100、150、200、250r/min，振蕩15min，研究水浴振蕩速度對發(fā)酵液絮凝效果和PLA回收率的影響，結果見圖4。從圖4可知，振蕩速度對絮凝效果有一定影響，原因可能是如果振蕩速度太低，絮凝劑和發(fā)酵液不能充分混合，從而影響絮凝效果。而如果振蕩速度過大，則會使形成的絮凝團破碎，也會影響絮凝效果?？紤]到100r/min時，絮凝效果最好，而且PLA回收率可達到86.3%，因此為節(jié)省成本，選擇100r/min為最佳水浴振蕩速度。

圖4 水浴振蕩速度對苯乳酸發(fā)酵液絮凝效果的影響

2.2.5 水浴振蕩時間對絮凝效果的影響 將熱處理后的發(fā)酵液pH調至3.0，添加等量的硫酸鋁(8g/L)，溫度控制在40℃，以100r/min的速度振蕩，設計振蕩時間為10、15、20、25、30、35min，研究水浴振蕩時間對發(fā)酵液絮凝效果和PLA回收率的影響，結果見圖5。由圖5可知，一定范圍內，振蕩時間越長，絮凝效果越好，但隨著時間的延長，PLA回收率下降明顯。權衡兩個指標，選擇振蕩時間為35min。

2.2.6 正交實驗確定絮凝的最佳工藝條件 根據以上單因素實驗，以pH、溫度、絮凝劑用量為考察因素，采用三因素三水平L9(33)正交設計法確定苯乳酸發(fā)酵液最佳絮凝的工藝條件。因素水平設計及正交實驗結果見表2，絮凝率和PLA回收率極差分析見表3。

圖5 水浴振蕩時間對苯乳酸發(fā)酵液絮凝效果的影響

表2 正交實驗設計與實驗結果

表3 絮凝率和PLA回收率極差分析表

從表2、表3可以看出，影響發(fā)酵液絮凝效果的各因素主次順序為:溫度＞pH＞絮凝劑用量。影響PLA回收率的各因素主次順序為:pH＞絮凝劑用量＞溫度。綜合2個指標，根據直觀極差分析，最佳工藝參數組合為A3B1C2，即在pH為3.0，溫度為30℃，硫酸鋁絮凝劑用量為8g/L下，水浴恒溫振蕩器中以100r/min振蕩35min。在此條件下進行驗證實驗，F(xiàn)R值為60.88%，PLA回收率為88.13%，好于其他條件的結果。

3 結論

本實驗比較了7種絮凝劑對苯乳酸發(fā)酵液的脫色率和回收率，最終選擇硫酸鋁作為合適的絮凝劑，再通過單因素實驗和正交實驗確定了最佳工藝條件為:pH為3.0，溫度為30℃，硫酸鋁絮凝劑用量為8g/L，在水浴恒溫振蕩器中以100r/min振蕩35min。在此條件下發(fā)酵液脫色率達到60.88%，苯乳酸回收率達到88.13%。

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Study on the flocculation of phenyllactic acid fermentation broth

CHENG Lu，YANG Qing，MIAO Ming，ZHANG Tao，JIANG Bo，MU Wan-meng*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The flocculation of phenyllactic acid fermentation broth was studied.The flocculation effect of seven kinds of flocculants on phenyllactic acid fermentation broth was studied and the flocculation experiments were carried out by single factor experiments and orthogonal experiments，based on the flocculation ratio and the recovery ratio of phenyllactic acid.Al2(SO4)3was proven to be optimal among the seven flocculants，whose best flocculation conditions were determined as follows:pH3.0，temperature 30℃，8g/L flocculant addition，vibration speed 100r/min and vibration time 35min.The results showed that under these conditions，the flocculation ratio reached 60.88%and phenyllactic acid recovery ratio reached 88.13%.

phenyllactic acid;fermentation broth;flocculation

TS201.1

B

1002-0306(2011)03-0256-04

苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)，也稱β-苯乳酸或3-苯基乳酸，即2-羥基-3-苯基丙酸，分子式為C9H10O3。由于乳酸菌具有GRAS(generally recognized as safe)資格，可廣泛用于發(fā)酵食品的生產［1］，而苯乳酸作為乳酸菌等微生物產生的一種天然新型的小分子抗菌物質，具有安全性高，抑菌能力強、抑菌譜廣、理化性質好等特點［2-6］，因此當前，乳酸菌來源的苯乳酸是研究的一大熱點，其作為一種新型的生物防腐劑具有廣闊的開發(fā)前景。由于苯乳酸發(fā)酵液是一種非常復雜的多元混合體系，其中除了目標產物外，還含有大量的菌體、細胞碎片、未消耗完的培養(yǎng)基，以及蛋白質、鹽分、色素等雜質，雜質的存在不但妨礙了后續(xù)的提取和精制，而且影響到產品的質量和收率。絮凝技術由于具有促使顆粒結合成團，容易沉降、過濾、離心、提高固液分離速度和液體澄清度等一系列特點而成為研究的熱點。絮凝劑在發(fā)酵過程下游加工中，主要用于發(fā)酵液預處理、初步純化等，絮凝作用在某些絮凝劑存在下，改變發(fā)酵液的性質，在懸浮粒子之間產生架橋作用而使細胞或溶解的大分子聚集成較大的絮凝團［7-8］。本實驗通過比較幾種絮凝劑對苯乳酸發(fā)酵液絮凝的效果，選擇合適的絮凝劑，然后考慮了pH、溫度、絮凝劑用量、振蕩速度、絮凝時間對絮凝的單因素影響，然后通過正交實驗對影響因素進行優(yōu)化，確定適宜的絮凝條件。

2010-07-05 *通訊聯(lián)系人

程璐(1989-)，女，本科，研究方向:食品科學與工程。

“十一五”國家863資助項目(2006AA10Z334)資助。