鄧開(kāi)野,譚梅唇
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州510225; 2.廣西大學(xué),廣西南寧530004)
透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌分批發(fā)酵工藝條件的研究
鄧開(kāi)野1,譚梅唇2
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州510225; 2.廣西大學(xué),廣西南寧530004)
采用10L小型發(fā)酵罐,對(duì)變異菌株的分批發(fā)酵生產(chǎn)HA的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。分別考察了初糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度、氧的傳遞、HA合成前體UMP的添加對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明,高的初糖濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和HA的合成產(chǎn)生抑制作用,發(fā)現(xiàn)5%的初糖濃度比較合適。比較理想的小罐分批發(fā)酵條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min、pH7.0、培養(yǎng)溫度37℃、通氣量2L/min。HA合成前體UMP的添加可以促進(jìn)菌體的繁殖和大幅度地提高HA的產(chǎn)量。
透明質(zhì)酸,分批發(fā)酵,工藝條件
菌種 實(shí)驗(yàn)室篩選和誘變出的產(chǎn)生透明質(zhì)酸的變異株;種子培養(yǎng)基 2%淀粉葡萄糖水解液,蛋白胨1%,酵母膏 1%,NaNO30.4%,MgSO4·7H2O 0.1%,KH2PO40.2%,調(diào)pH7.0,121℃滅菌20min;發(fā)酵培養(yǎng)基 4%淀粉葡萄糖水解液,蛋白胨1%,酵母膏1%,硝酸鈉0.5%,MgSO4·7H2O 0.1%,KH2PO40.2%,調(diào)pH7.0,121℃滅菌20min。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 斜面與種子培養(yǎng)方法 將篩分的菌種,于斜面培養(yǎng)基上劃線傳代。將斜面試管放在恒溫箱中,在37℃條件下培養(yǎng)14~16h。培養(yǎng)結(jié)束后,用接種針在斜面培養(yǎng)基中挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落2~3環(huán),接入250mL三角燒瓶中,燒瓶?jī)?nèi)裝50mL種子培養(yǎng)基,把接菌后密封好的250mL三角燒瓶,置于以200r/min旋轉(zhuǎn)的搖床中培養(yǎng)16h,培養(yǎng)溫度37℃。
1.2.2 搖瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)結(jié)束后,按10%的接種量計(jì)算,從250mL三角燒瓶中吸取0.2mL已培養(yǎng)好的菌液,接入500mL三角燒瓶中,內(nèi)裝發(fā)酵體培養(yǎng)基20mL。再將此500mL三角瓶置于轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng),在37℃條件下培養(yǎng)24h。
1.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng) 采用10L的發(fā)酵罐(江蘇達(dá)森發(fā)酵設(shè)備有限公司),配有單只圓盤(pán)平槳,配有德國(guó)梅特勒公司的儀表(溶氧探頭和pH探頭,可自動(dòng)控制pH),自動(dòng)控溫等。加入5L發(fā)酵培養(yǎng)基,121℃滅菌30min。接種量為10%(v/v),發(fā)酵過(guò)程中采用2mol/L NaOH自動(dòng)控制pH,初始淀粉的葡萄糖水解液的濃度為 5%,攪拌轉(zhuǎn)速 200r/min,通氣量為2.4L/min,發(fā)酵溫度為37℃。
1.2.4 測(cè)定方法
1.2.4.1 吸光度(OD值)的測(cè)定 發(fā)酵液50mL,在4000r/min條件下離心15min后,在上清液中,加入3倍體積的乙醇,析出的沉淀加入與發(fā)酵液同體積的0.1mol/L NaCl溶液,置于磁力攪拌器中,在196nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度,該吸光度值的大小可以指示發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的高低。
1.2.4.2 菌體含量的測(cè)定 菌體量的測(cè)定:采用干重法。將發(fā)酵液離心后取沉淀,加稀酸溶解碳酸鈣,再離心取沉淀,80℃干燥24h后,稱(chēng)取重量,計(jì)算細(xì)胞濃度。
1.2.4.3 乳酸含量測(cè)定 對(duì)羥基聯(lián)苯法[2]。
1.2.4.4 葡萄糖含量測(cè)定 采用3,5二硝基水楊酸法[3]。
2.1 初糖濃度對(duì)HA發(fā)酵的影響
2.1.1 初糖濃度對(duì)變異菌株菌體生長(zhǎng)的影響 圖1為不同初始淀粉的葡萄糖水解液濃度下,菌體的生長(zhǎng)過(guò)程曲線,圖2為底物消耗曲線。從圖1和圖2可見(jiàn),菌體可以在較大的范圍內(nèi)生長(zhǎng),初糖濃度為3%~8%時(shí),菌體均能很好地生長(zhǎng),最終菌體濃度可以達(dá)到1.71~4.75g/L。但較低初糖濃度時(shí),菌體的生長(zhǎng)延遲期較短,可以高速度生長(zhǎng),菌體進(jìn)入快速糖耗階段的時(shí)間隨初糖濃度的升高而延遲,當(dāng)初糖濃度為8%時(shí),在發(fā)酵初始的10h內(nèi),幾乎沒(méi)有底物的消耗,因此可以認(rèn)為初糖濃度高對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用。
圖1 不同初糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
2.1.2 初糖濃度對(duì)HA合成的影響 由表1可以看出,在初糖濃度為8%時(shí),吸光度值最大為2.869,表明發(fā)酵液中HA的含量最多。結(jié)合圖1可見(jiàn),菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的延遲期一致。初糖濃度高,菌體量多,發(fā)酵結(jié)束時(shí)所獲得的HA產(chǎn)量也越高。但高的初糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用,發(fā)酵遲滯期延長(zhǎng),而當(dāng)初糖濃度低時(shí),菌體量和HA產(chǎn)量又偏少。所以實(shí)驗(yàn)在分批發(fā)酵過(guò)程中,采用5%濃度淀粉葡萄糖轉(zhuǎn)化液為發(fā)酵的初糖濃度。
圖2 不同初糖濃度對(duì)葡萄糖消耗的影響
表1 初糖濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響
圖3為該菌株發(fā)酵過(guò)程中乳酸的變化曲線。由圖3可知,在淀粉的葡萄糖水解液的初始葡萄糖濃度為3%、4%、5%、8%時(shí),微生物可將底物的70%~80%轉(zhuǎn)化為乳酸,乳酸相應(yīng)產(chǎn)量可達(dá)23.8、41.9、61.4、75.12g/L。發(fā)酵過(guò)程中,乳酸的合成和菌體的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致,說(shuō)明菌體生長(zhǎng)旺盛,則乳酸的產(chǎn)量也高。在不同的乳酸濃度下同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中HA的量,結(jié)果如圖4所示,表明當(dāng)乳酸濃度達(dá)到40g/L時(shí),HA的合成基本停止。可以認(rèn)為在此濃度之上,乳酸對(duì)HA的合成形成了強(qiáng)烈的抑制,而在此濃度之下,乳酸的抑制作用則大為減弱。通過(guò)以上分析,發(fā)現(xiàn)淀粉的葡萄糖水解液的初始糖濃度,對(duì)該菌種的生產(chǎn)性能有很大的影響:高的初糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成產(chǎn)生抑制,而發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸,隨著初糖濃度的增加而增加,發(fā)酵液中乳酸的量的增加反過(guò)來(lái)又對(duì)HA的合成產(chǎn)生抑制。而當(dāng)初糖濃度小于5%時(shí),菌體量和HA產(chǎn)量又明顯減少,當(dāng)初糖濃度較高時(shí),發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),所以本研究認(rèn)為利用該選育菌株發(fā)酵生產(chǎn)HA,采用初始葡萄糖濃度為5%的淀粉水解液較為適宜。
圖3 不同初糖濃度下乳酸的變化
圖4 不同的乳酸濃度對(duì)HA合成的影響
2.2 pH對(duì)發(fā)酵的影響
2.2.1 pH對(duì)變異菌株菌體生長(zhǎng)的影響 本實(shí)驗(yàn)采用了不同pH的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果見(jiàn)圖5。pH為7.0時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)最好,細(xì)胞量達(dá)到最大,同時(shí)在中性偏酸,即pH在6~7的范圍內(nèi),菌體能較好地生長(zhǎng)。搖瓶發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn),如不對(duì)pH進(jìn)行控制,pH將迅速下降到5.0左右,菌體的生長(zhǎng)和代謝極其有限。pH為8.0時(shí),菌體生長(zhǎng)極為緩慢,pH過(guò)高,以致于限制了微生物的生長(zhǎng)。
圖5 不同pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
2.2.2 pH對(duì)HA合成的影響 由表2可見(jiàn),pH為7.0時(shí),發(fā)酵液的吸光度值最大,表明發(fā)酵液中HA的含量最多。當(dāng)把培養(yǎng)基的pH調(diào)到8.0時(shí),吸光度值最小,發(fā)酵液中HA含量最少,這與不同pH對(duì)菌體生長(zhǎng)影響有相同的趨勢(shì)。由圖6可以看出,本研究篩選得到的突變菌株可以在中性或弱酸性的條件下生長(zhǎng),利用葡萄糖的速度基本一致,在pH6.5時(shí),耗糖速度略快些,而pH8.0時(shí),耗糖的速度慢。
綜合分析以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可見(jiàn)要使突變菌株正常進(jìn)行發(fā)酵,需將pH控制在6.5~7.0范圍內(nèi)。
表2 不同pH對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響
圖6 不同pH下淀粉水解液中葡萄糖的利用曲線
2.3 溫度對(duì)HA發(fā)酵的影響
2.3.1 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響 本研究考察了不同的發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響情況,結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明,隨著溫度的升高,細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快。33℃時(shí),細(xì)胞量?jī)H為2.2g/L,39℃時(shí)細(xì)胞含量最多,可達(dá)到3.94g/L。
圖7 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
2.3.2 溫度對(duì)HA合成的影響 由表3可見(jiàn),溫度為33℃時(shí),發(fā)酵液中HA的量不多,而在39℃時(shí),HA的量最小??梢?jiàn)高溫雖然對(duì)菌體生長(zhǎng)有利,但不利于HA的合成,由于在高溫時(shí),菌體將培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分大部分用來(lái)菌體生長(zhǎng),而到了產(chǎn)物合成階段,已經(jīng)沒(méi)有養(yǎng)分可以利用,所以嚴(yán)重影響了產(chǎn)物的合成。而發(fā)酵溫度為35℃時(shí),發(fā)酵液的吸光度值最大,表明HA的含量最高。因此,35℃是較為合適的小罐發(fā)酵溫度。
表3 溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響
2.4 氧的供給對(duì)HA發(fā)酵的影響
2.4.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)HA生產(chǎn)的影響 表4表明,采用10L小型發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵時(shí),轉(zhuǎn)速小于200r/min時(shí),發(fā)酵液的吸光度值隨著轉(zhuǎn)速的增加而增加,表明發(fā)酵液中HA的含量也隨著攪拌速度的增加而增加,這是因?yàn)椋琀A的形成使發(fā)酵液的粘度顯著增高。而采用高的攪拌速度,HA含量反而下降,造成這一結(jié)果的原因可能是較大的攪拌速度對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生傷害,導(dǎo)致細(xì)胞合成HA的能力下降。分析上述結(jié)果認(rèn)為,小罐的分批發(fā)酵可采用200r/min的攪拌速度。
表4 攪拌速度對(duì)HA發(fā)酵的影響
2.4.2 通氣量對(duì)HA發(fā)酵的影響 由表5可知,通過(guò)增加通氣量來(lái)提高發(fā)酵液中溶解氧的濃度,改善氧傳遞的效果呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。當(dāng)氣流速度大時(shí),再依靠增加通氣量的手段來(lái)提高氧的傳質(zhì)效率的效果并不明顯,還起到反作用。結(jié)果表明,通氣量低,對(duì)合成HA有利,所以,分批發(fā)酵時(shí),采用2L/min的通氣量較為理想。
表5 通氣量對(duì)HA發(fā)酵的影響
2.5 分批發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化與控制
綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,各單因素實(shí)驗(yàn)得到的較優(yōu)條件是:初糖濃度5%,pH7.0,培養(yǎng)溫度35℃,攪拌轉(zhuǎn)速200r/min,通氣量2L/min,利用該較優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果如表6所示。
表6 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵的影響
由表6可見(jiàn),較優(yōu)條件下發(fā)酵,并不能得到最好的結(jié)果,也就是說(shuō)各項(xiàng)較優(yōu)條件并不能表現(xiàn)為簡(jiǎn)單的加和,較優(yōu)條件時(shí)所測(cè)得的發(fā)酵液吸光度值低于單因素實(shí)驗(yàn)中所得的結(jié)果。所以,研究改變溫度,將最后實(shí)驗(yàn)條件確定為:初糖濃度5%,pH7.0,培養(yǎng)溫度37℃,攪拌轉(zhuǎn)速200r/min,通氣量2L/min。
2.6 尿苷-磷酸(UMP)對(duì)發(fā)酵的影響
在配制好發(fā)酵培養(yǎng)基后,在接種時(shí),把0.8g/L的UMP,加入到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。本研究考察了兩種初始葡萄糖濃度情況下對(duì)HA合成的影響。待發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)量發(fā)酵液中的菌體含量和196nm處的吸光度,結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 加入U(xiǎn)MP對(duì)發(fā)酵的影響
由表7可見(jiàn),加入U(xiǎn)MP可以明顯地提高HA的產(chǎn)量。在低葡萄糖初始濃度下,產(chǎn)量提高了7%左右,而菌體量的變化不大。在5%的初始葡萄糖濃度下,HA的產(chǎn)量提高了近30%,而菌體量提高的幅度也較為明顯。產(chǎn)量完全提高的原因可能是由于鏈球菌的三羧酸循環(huán)不完全,外源UMP的加入為HA的合成提供了前體,并直接參與HA合成的次級(jí)代謝反應(yīng),從而促進(jìn)HA的產(chǎn)量和菌體量的提高。
3.1 采用10L小型發(fā)酵罐,對(duì)所篩選誘變后獲得的變異菌株的分批發(fā)酵生產(chǎn)HA的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。分別考察了初糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度、氧的傳遞等對(duì)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明,高的初糖濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和HA的合成產(chǎn)生抑制作用,發(fā)現(xiàn)5%的初糖濃度比較合適。
3.2 采用單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。獲得的比較理想的小罐分批發(fā)酵條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min、pH7.0、培養(yǎng)溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min、通氣量2L/min。
3.3 考察了HA的合成前體加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,對(duì)發(fā)酵的影響,結(jié)果表明,HA合成前體UMP的添加可以促進(jìn)菌體的繁殖和大幅度地提高HA的產(chǎn)量。
[1]汪蠑,張?jiān)崎_(kāi),韋航,等.透明質(zhì)酸徽生物發(fā)酵法生產(chǎn)工藝條件的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2001(4):190-192.
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Study on the technology of batch fermentation for hyaluronic acid producing strain
DENG Kai-ye1,TAN Mei-chun2
(1.College of Light Industry and Food Technology,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China;2.Guangxi University,Nanning 530004,China)
Batch fermentation condition was determined by using 10L fermenter.The effective factors to the fermentation were discussed,such as initial glucose concentration,pH value,temperature,oxygen impressing,adding synthesized precursor.The results showed that the higher initial glucose concentration could restrain the bacterial growth and HA synthesizing,and 5% initial glucose concentration was suitable.The ideal batch fermentation conditions were stirring speed 200r/min,pH7.0,cultural temperature 37℃,aeration volume 2L/min.The adding of precursor could promote the reproduce of bacterial and enhance the HA yield.
hyaluronic acid;batch fermentation;process conditions
TS201.3
A
1002-0306(2011)03-0221-04
在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)pH變化很大,如不能對(duì)其進(jìn)行很好地控制,發(fā)酵液的pH會(huì)迅速降低(5.0左右),使得搖瓶發(fā)酵過(guò)程中,HA在發(fā)酵液中的積累不是很多,在紫外分光光度計(jì)上,吸光度值平均只有2.256左右。由于小型發(fā)酵罐的易操作性,可以通過(guò)控制溶氧濃度、溫度、pH等來(lái)控制發(fā)酵,同時(shí)分批操作也是工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ),因此,對(duì)分批發(fā)酵過(guò)程及條件的研究有助于揭示微生物發(fā)酵的本質(zhì),了解發(fā)酵的規(guī)律。實(shí)驗(yàn)采用10L小型發(fā)酵罐,考察了該菌種分批發(fā)酵的生產(chǎn)條件,研究了發(fā)酵條件對(duì)HA產(chǎn)量的影響,提出了較為適宜的分批發(fā)酵培養(yǎng)條件,為建立HA分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型和對(duì)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化和控制打下了基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2010-03-15
鄧開(kāi)野(1968-),女,博士,副教授,研究方向:發(fā)酵工程。