大黃中α-淀粉酶抑制因子的研究

宋彥顯，閔玉濤，劉 江，馬慶一，*

(1.中州大學(xué)，河南鄭州450044; 2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450002)

大黃中α-淀粉酶抑制因子的研究

宋彥顯1，閔玉濤1，劉 江2，馬慶一2，*

(1.中州大學(xué)，河南鄭州450044; 2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450002)

采用甲醇粗提、石油醚、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、乙醇索氏極性梯度提取、pH梯度萃取以及硅膠制備板純化并結(jié)合各組分α-淀粉酶抑制活性跟蹤方法對大黃中α-淀粉酶抑制因子的分布進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，乙酸乙酯和乙醇組分對α-淀粉酶的抑制率分別為35.0%和26.9%;前者的pH梯度萃取組分為NaHCO3、Na2CO3、NaOH、剩余乙酸乙酯，對α-淀粉酶的抑制率依次為:66.5%、46.7%、58.1%和49.0%。其中NaHCO3組分用硅膠制備板純化并水解，經(jīng)薄層分析認(rèn)定其苷元是大黃酸。純化后對α-淀粉酶的抑制率不升反降的事實(shí)暗示了粗樣中雜質(zhì)的協(xié)同作用。

大黃，α-淀粉酶，抑制因子，糖尿病

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大黃 鄭州中藥城;豬胰α-淀粉酶 自制;試劑 均為國產(chǎn)分析純。

80-1離心機(jī)，721分光光度計(jì)，HH-S11-2電熱恒溫水浴鍋，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，IOTA-1電熱鼓風(fēng)干燥箱，新飛BCD-245D冰箱，GL21高速冷凍離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 相關(guān)試劑的配制和材料制備

1.2.1.1 明膠試劑 10g氯化鈉，1g明膠，加水定容至100mL。

表1 測定加樣表

1.2.1.2 三氯化鐵試劑 5%三氯化鐵的水溶液或醇溶液。

1.2.1.3 溴甲酚綠試劑 0.1%溴甲酚綠乙醇液。

1.2.1.4 顯色劑的配制 精確稱取1.66g鄰苯二甲酸、0.93g苯胺，將其溶于100mL水飽和的正丁醇中。

1.2.1.5 展開劑 正丁醇∶冰醋酸∶水(3∶1∶1)。

1.2.1.6 0.7%的CMC溶液的配制 稱取羧甲基纖維素0.7g，量取蒸餾水100mL，先加入5mL蒸餾水潤濕泡開的羧甲基纖維素，再緩緩加水，邊加水邊用牛角勺攪拌以防止溶液中出現(xiàn)大的懸浮顆粒，若溶液中還存在顆粒，應(yīng)適當(dāng)加熱溶化，無CMC顆粒時，加入剩余的蒸餾水混勻備用。

1.2.1.7 DNS試劑的配制 酒石酸鉀鈉18.2g，溶于50mL蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.03g、NaOH 2.1g、苯酚0.5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100mL，貯于棕色瓶中，室溫保存。

1.2.1.8 薄層分析板的制備和活化 稱取7g薄層層析用硅膠于研缽中，量取22mL配制好的CMC溶液加入其中，慢慢碾磨使兩者充分混合，并防止混入氣泡，將8塊小玻片(2.5cm×7.5cm)并排放置，將混合均勻的硅膠傾于小玻璃片上，用玻璃棒將其反復(fù)推鋪均勻(玻璃棒比小玻璃片高出2mm左右)，拿起小玻璃片在手上顛至均勻后，放平，令其自然陰干。將晾干的板置于烘箱中，緩慢升溫至115℃，活化1h后取出，放于玻璃干燥器皿中自然冷卻即可。

1.2.2 大黃中α-淀粉酶抑制因子的提取 稱取烘干粉碎至40目的大黃粉200g，甲醇回流提取(固液比1∶5)三次，抽濾后合并提取液，濃縮至浸膏狀，加入硅藻土，攪拌均勻后用濾紙包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、乙醇索氏提取48h。

1.2.3 大黃中α-淀粉酶抑制因子的定性實(shí)驗(yàn)［2］

1.2.3.1 堿液實(shí)驗(yàn)、醋酸鎂實(shí)驗(yàn)和硼酸實(shí)驗(yàn) 堿液實(shí)驗(yàn):加入10%NaOH，若呈現(xiàn)紅色，加H2O2，紅色不褪，加酸，紅色褪去為陽性;醋酸鎂實(shí)驗(yàn):加入1% MgAc2出現(xiàn)紅色為陽性;硼酸實(shí)驗(yàn):將乙醇提取液點(diǎn)在濾紙片上，噴灑1%硼酸水溶液，如呈現(xiàn)黃橙、紅色或熒光，表明含蒽醌及甙類。

1.2.3.2 α-萘酚實(shí)驗(yàn)(Molisch紫環(huán)反應(yīng)) 取檢品的水溶液1mL，加入5%萘酚乙醇溶液數(shù)滴振搖后，沿管壁滴入5～6滴濃硫酸，使之成兩液層，待2～3min后，兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)者為陽性(糖、多糖或甙類)。

1.2.3.3 三氯化鐵實(shí)驗(yàn)與明膠實(shí)驗(yàn) 三氯化鐵實(shí)驗(yàn):取檢品的水溶液1mL，加三氯化鐵試液1～2滴，呈現(xiàn)綠色、污綠色、藍(lán)黑色或暗紫色者為陽性(可水解鞣質(zhì)顯藍(lán)—藍(lán)黑色，縮合鞣質(zhì)顯綠色—污綠色)。明膠實(shí)驗(yàn):取檢品的水溶液1mL，加氯化鈉明膠溶液2～3滴，生成白色沉淀物則記作陽性。

1.2.3.4 鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn) 取檢品的乙醇溶液1mL，加放少量鎂粉，然后加濃鹽酸4～5滴，置沸水浴中加熱2～3min，呈現(xiàn)紅色者為陽性(游離黃酮類或黃酮甙)。

1.2.3.5 溴甲酚綠實(shí)驗(yàn) 在干燥的濾紙上滴一滴待檢液體，待干燥后噴灑溴甲酚綠指示劑，在藍(lán)色的背景上顯黃色記為陽性(有機(jī)酸)。如果展開劑中含有乙酸，在噴灑顯色劑之前應(yīng)于120℃烘烤除去。

1.2.4 梯度提取物對α-淀粉酶抑制活性跟蹤 用二甲基亞砜溶解甲醇粗提物、石油醚提取物，用水溶解剩余各梯度提取物，使其濃度為1mg/mL，共得到6個樣品溶液。臨用前取α-淀粉酶(146U/mg)稀釋2500倍。參照程秀麗［3］的方法并加以改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)組分為空白管、對照管、樣品管和顏色干擾管，各管加樣如表1所示。

提取物對α-淀粉酶抑制率的計(jì)算:

其中:A1-空白;A2-對照;A3-加抑制劑;A4-顏色對照(甲醇粗提和石油醚提取物的抑制率計(jì)算中，A2采用二甲基亞砜對照組的值，其他采用對照組吸光度值)。

1.2.5 排除提取液活性測定中顯色干擾的方法

1.2.5.1 薄層層析法 酶解淀粉液點(diǎn)在薄層板上，因蒽醌極性較弱，會走到硅膠板的最頂端，將蒽醌與生成的糖分開，挖掉酶解淀粉生成的糖最后停留的位置處的硅膠，經(jīng)過碾磨，用蒸餾水浸提1h，再加DNS顯色定容，540nm下測吸光度值即可去除顯色干擾。

1.2.5.2 活性炭脫色法 將少量的活性炭置于1mL經(jīng)抑制劑作用但還未顯色的酶解淀粉體系(酶已滅活)混合5min，用熱的95%乙醇洗脫活性炭上吸附的糖，8000r/min離心5min后取上清液，定容后DNS顯色，540nm下測吸光度值。

1.2.5.3 有機(jī)溶劑萃取法 針對大黃甲醇粗提物或乙醚組分(用二甲基亞砜溶解)。取兩只試管，編號1、2。在1號管中加入0.6mL的酶反應(yīng)體系液(酶已滅活)，在2號管中加入0.6mL的總反應(yīng)體系液，各滴加1滴稀鹽酸，使體系呈弱酸性，再加入2mL的無水乙醚(或乙酸乙酯)，充分振蕩，靜置，大黃粗提液中對DNS顯色有干擾作用的弱酸性成分進(jìn)入上層酯層，棄上酯層。再按上述萃取操作兩次，直至酯層幾乎不顯顏色，加0.2mL 5%NaOH后加DNS顯色。

表4 各提取組分的吸光度值

1.2.5.4 破壞蒽醌法(H2O2氧化法) 將20μL H2O2加入0.2mL反應(yīng)體系中(于坩堝內(nèi))，充分振蕩反應(yīng)1min用氧化法破壞蒽醌，然后將此坩堝在沸水浴中蒸干。調(diào)零，空白對照亦如此操作，以減少誤差。用蒸餾水少量多次地將坩堝中的干物質(zhì)轉(zhuǎn)移到比色管中，加0.2mL DNS，顯色，定容至10mL，在540nm下測吸光度值。

1.2.6 乙酸乙酯組分的分離

1.2.6.1 乙酸乙酯組分的pH梯度萃取 將梯度提取得到的乙酸乙酯溶液濃縮、定容，以等體積 5% NaHCO3溶液萃取兩次，酯層待用，合并水相，用鹽酸酸化至pH為3.0，水相用NaCl飽和，用乙酸乙酯反萃取，棄水層。上層的有機(jī)相記作NaHCO3組分。NaHCO3溶液萃取過的酯層再以等體積5%Na2CO3溶液萃取兩次，酯層待用，合并水相，鹽酸酸化，用乙酸乙酯反萃取，棄去水層。上層所得記作Na2CO3組分。Na2CO3溶液萃取過的酯層再以等體積 1% NaOH分兩次振蕩萃取，合并水層萃取液，酯層記作乙酸乙酯組分。水層萃取液加鹽酸至酸性，用乙酸乙酯反萃，棄去水層。上層所得記作NaOH組分。分別做制備層析，展開劑為乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶25∶15)。

1.2.6.2 乙酸乙酯NaHCO3組分的純化及蒽醌苷的雙相酸水解 用乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶25∶15)為展開劑對NaHCO3組分做制備層析，進(jìn)一步純化。純化后得到的組分經(jīng)雙相水解后，取少量該組分濃縮油狀物，置于50mL圓底燒瓶，加入10mL二氯甲烷和10mL 20%硫酸，在40℃恒溫水浴中攪拌反應(yīng)30min。用分液漏斗分出二氯甲烷組分，加一小勺無水硫酸鈉干燥20min，濾去硫酸鈉固體，取濾液在薄層硅膠分析板上點(diǎn)樣。以石油醚∶乙酸乙酯(7∶3)為展開劑，觀察顏色斑點(diǎn)，并與乙醚組分的結(jié)果對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 梯度提取

2.1.1 梯度提取得率 見表2。

表2 大黃各梯度組分的得率

2.1.2 定性實(shí)驗(yàn) 由表3可知，石油醚提取液中主要含有機(jī)酸，乙醚提取液主要含有蒽醌苷元，而乙酸乙酯、乙醇提取液中主要含有蒽醌苷。

表3 大黃各梯度成分定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 提取液對α-淀粉酶的抑制效果 按1.2.4的方法測定，結(jié)果如表4。

因大黃中的主要成分蒽醌與顯色劑DNS中的堿反應(yīng)顯紅色或紫紅色，嚴(yán)重干擾還原糖與DNS的顯色。故按1.2.4方法不可行，因此要著力解決蒽醌干擾顯色的問題。

2.2 排除顯色干擾方法的選擇

薄層層析法因硅膠板規(guī)格不一，導(dǎo)致淀粉水解產(chǎn)物的最終位置有差異，在還未顯色之前“盲刮”，需碾磨、浸提和過濾等反復(fù)轉(zhuǎn)移，使得結(jié)果不能成理想的酶反應(yīng)線性關(guān)系?；钚蕴棵撋m能脫除蒽醌的顏色，但吸附大量的糖，不易洗干凈，造成的誤差極大。有機(jī)溶劑萃取法只能除去提取液中一部分顏色干擾。H2O2破壞蒽醌法易產(chǎn)生H2O2殘留，會氧化3，5-二硝基水楊酸，影響顯色。實(shí)驗(yàn)中采用了三種方法除去H2O2:沸水浴加熱法、真空濃縮法和沸水浴加熱坩堝中蒸干法。沸水浴加熱法難以除去H2O2，真空濃縮法操作繁瑣，沸水浴加熱坩堝中蒸干法效果較好，故均采用此法。

2.3 乙醇提取液對α-淀粉酶的抑制作用的酶反應(yīng)動力學(xué)實(shí)驗(yàn)

從圖1可以看出，以15min時的吸光度計(jì)算抑制率，乙醇組分的抑制率26.9%。

圖1 乙醇組分對淀粉酶的抑制活性

2.4 乙酸乙酯組分的進(jìn)一步分離及所得各組分對α-淀粉酶的抑制效果

由圖2可知，前15min內(nèi)吸光度與時間成線性關(guān)系，以15min時的吸光度計(jì)算各成分的抑制率，結(jié)果顯示各成分的抑制率分別為:原乙酸乙酯組分35.0%，NaHCO3組分66.5%，Na2CO3組分 46.7%，NaOH組分58.1%，剩余組分49.0%，其中NaHCO3組分抑制率明顯高于其它組分。

圖2 乙酸乙酯pH梯度萃取各組分對α-淀粉酶的抑制活性

2.5 乙酸乙酯NaHCO3萃取組分的純化

由2.4可知，NaHCO3組分抑制率最高，因此采用用乙酸乙酯∶甲醇∶水(100∶25∶15)為展開劑進(jìn)行制備層析，對其進(jìn)一步純化。經(jīng)純化得到1個主要組分記為1#，考察1#對 α-淀粉酶的抑制效果，結(jié)果如圖3。

圖3 1#對淀粉酶的抑制活性

以30min的吸光度計(jì)算抑制率，結(jié)果其抑制率為22.2%。

將1#雙相水解(20%硫酸酸化和二氯甲烷1∶1)，得到苷元，將其與乙醚組分同板進(jìn)行薄層層析(石油醚∶乙酸乙酯，7∶3)，并根據(jù)文獻(xiàn)報道的Rf值，可知得到的苷元是大黃酸。因此，可以確定大黃酸為苷元的蒽醌苷是α-淀粉酶的抑制因子。

3 結(jié)論

3.1 大黃經(jīng)甲醇粗提，石油醚，二氯甲烷，乙醚，乙酸乙酯，乙醇索氏梯度提取得到五個組分?；瘜W(xué)和生物活性跟蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，石油醚提取液中主要含有機(jī)酸，乙醚提取液主要含有蒽醌苷元，而乙酸乙酯、乙醇提取液中主要含有蒽醌苷。

3.2 探討了四種解決蒽醌色素干擾DNS顯色的途徑:a.薄層層析分離;b.活性炭脫色;c.有機(jī)溶劑萃取; d.H2O2氧化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2氧化法(沸水浴坩堝蒸干清除過量H2O2)去除蒽醌干擾效果較好。

3.3 以H2O2氧化法除蒽醌色素干擾DNS顯色的方法考察乙酸乙酯和乙醇組分對α-淀粉酶抑制作用，結(jié)果均表現(xiàn)出一定的抑制作用，其抑制率分別為35.0%和26.9%。

3.4 乙酸乙酯組分經(jīng)pH梯度萃取進(jìn)一步分離、純化，檢測發(fā)現(xiàn)，四個組分NaHCO3、Na2CO3、NaOH和剩余乙酸乙酯均對 α-淀粉酶有抑制活性，其中以NaHCO3組分活性最高，它們的抑制率依次為: 66.5%、46.7%、58.1% 和 49.0%。對乙酸乙酯NaHCO3組分用硅膠制備板法純化，得到1#，其對α-淀粉酶的抑制率為22.2%。NaHCO3組分純化后對α-淀粉酶的抑制率反而降低，暗示了粗樣中雜質(zhì)的協(xié)同作用。用水解法經(jīng)薄層分析得知，1#的苷元是大黃酸。

［1］高小平，張蔚瑜，鄒文俊，等.中藥提取物中α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(6): 536-538.

［2］北京醫(yī)學(xué)院.中草藥成分化學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1980:19.

［3］程秀麗.α-淀粉酶抑制劑的活性測定［J］.藥劑探討，2004，3(4):71-72.

Study on inhibitors of α-amylase in rhubarb

SONG Yan-xian1，MIN Yu-tao1，LIU Jiang2，MA Qing-yi2，*
(1.Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China; 2.Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

α-amylase inhibitory factors in rhubarb were studied systematically by the method of a combination of extraction with methanol，Soxhlet＆pH gradient extraction，purification by using preparative silica gel plates，and α -amylase inhibitory activity monitoring of the various components.The results showed that ethyl acetate and ethanol components of the α-amylase inhibition rates were 35.0%and 26.9%，respectively.α-amylase inhibitory rates of the pH gradient components of ethyl acetate，NaHCO3，Na2CO3，NaOH，and the remaining ethyl acetate were:66.5%，46.7%，58.1%and 49.0%respectively.The NaHCO3fraction was purified by using preparative silica gel plates，then hydrolyzed and analyzed with thin layer silica gel.The result indicated that its aglycone was rhein. The fact of a reducing inhibitory rate after purification implied that impurities in crude samples may have synergetic effect with the major ingredient.

rhubarb;α-amylase;inhibitory factor;diabetes

TS201.2+5

A

1002-0306(2011)03-0184-04

糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的，以高血糖為主要標(biāo)志的臨床綜合癥。近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。根據(jù)糖尿病對胰島素的依賴與否，可分為Ⅰ型(胰島素依賴型)和Ⅱ型(非胰島素依賴型)，患者中約90%左右為Ⅱ型，其主要癥狀為餐后高血糖，由其引起的并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的重要原因之一。在消化過程中，淀粉等碳水化合物首先在α-淀粉酶催化作用下轉(zhuǎn)化為糊精和麥芽糖。后者進(jìn)一步水解為葡萄糖，經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液，餐后2h內(nèi)Ⅱ型糖尿病人的胰高血糖素比健康人高100%，使血糖積累，導(dǎo)致餐后高血糖。α-淀粉酶抑制劑可抑制酶的活性，從而推遲淀粉水解產(chǎn)生單糖的時間，達(dá)到降低血糖峰值、平抑血糖濃度的目的。因而α-淀粉酶抑制因子的研究是防治糖尿病以及肥胖癥的重要研究領(lǐng)域之一。大黃長期在中國傳統(tǒng)經(jīng)典醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是一種有降糖作用的中草藥，其水提液具有α-淀粉酶抑制活性的事實(shí)已見報道［1］，但其作用機(jī)制以及活性組分的詳情尚不清楚。本課題則以大黃的分離純化并結(jié)合α-淀粉酶抑制活性跟蹤為手段進(jìn)一步披露了其活性的細(xì)節(jié)，從而為其繼續(xù)研究與開發(fā)增加了感性材料。

2009-12-21 *通訊聯(lián)系人

宋彥顯(1979-)，女，碩士研究生，助教，主要從事天然產(chǎn)物提取及功能性食品研究。