芒果核提取物的抑菌活性組分分析

李春美，田 燕，鐘慧臻，楊 立，周麗明

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070)

芒果核提取物的抑菌活性組分分析

李春美，田 燕，鐘慧臻，楊 立，周麗明

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070)

對芒果核乙醇提取物采用AB-8大孔樹脂和SephadexLH-20柱進(jìn)行初步純化得到不同級分。抑菌實驗表明，芒果核多酚在一定的濃度下對供試的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和金黃葡萄球菌都有較強的抑菌活性，隨著濃度的升高，抑菌效果也明顯升高，但是對供試的兩種真菌均無明顯抑菌活性;不同級分芒果核多酚的抑菌活性不同，芒果核多酚經(jīng)SephadexLH-20柱分離所得的組分III是芒果核多酚的主要抑菌活性組分，結(jié)合HPLC-ESI-MS的分析，表明芒果核多酚的抑菌活性組分主要為含有不同取代度的沒食子?；咸烟穷愇镔|(zhì)。

芒果核，多酚，抑菌，活性組分

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thruingiensis)、大腸桿菌(Escherichia coli.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharmoyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger) 由本院微生物教研室提供;供試培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%)，馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯20%、葡萄糖1.8%、瓊脂1.8%);芒果核購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)市場;對照品茶多酚 購自四川筠連茶多酚廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 以60%乙醇水溶液為提取溶劑，提取時間60min，料液比1∶10，水浴溫度60℃回流制得的芒果核多酚粗提物，經(jīng)AB-8樹脂純化后制得多酚初步純化物，將此初步純化物上SephadexLH-20柱后，20%乙醇洗脫得多酚組分Ⅰ，40%乙醇洗脫得組分Ⅱ，60%乙醇洗脫得組分Ⅲ。稱取一定量真空冷凍干燥的樣品，在超凈工作臺上用無菌水溶解樣品至所需的濃度，備用。對照品茶多酚，淡黃棕色粉末，EGCG含量大于85%。

表1 芒果核多酚的抑菌作用

1.2.2 菌懸液的制備 將供試菌株于斜面培養(yǎng)基上活化，用接種環(huán)挑取1～2環(huán)于50mL無菌生理鹽水三角瓶中振蕩10min(內(nèi)有數(shù)粒玻璃珠)，要求菌懸液約108CFU/mL左右備用。

1.2.3 含菌平板制作 新鮮配制的培養(yǎng)基于121℃條件下滅菌，當(dāng)培養(yǎng)基冷卻至50～60℃時，于超凈工作臺上將培養(yǎng)基倒入滅菌的?90mm的培養(yǎng)皿中，每皿15～20mL培養(yǎng)基，待平板冷卻后，每皿中加入0.5mL菌懸液，用三角玻璃涂棒均勻涂成薄板備用。

1.2.4 抑菌效果的測定

1.2.4.1 濾紙圓片法檢測抑菌效果［6］將無菌濾紙片浸入配好的藥液中12h，瀝干。每一含菌平板上，呈正三角形排布3片帶藥無菌紙片，細(xì)菌于37℃條件下培養(yǎng)24h，啤酒酵母和黑曲霉于30℃條件下培養(yǎng)5d，測其抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈大小來確定其抑菌效果。

1.2.4.2 平板計數(shù)法檢測抑菌效果 將芒果核多酚配成濃度為0.5、1、2、3、4mg/mL的溶液，移取0.5mL的各濃度的芒果核多酚溶液于滅菌平板中，再滴入0.2mL的菌懸液，傾入15mL融化的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，讓它們充分混勻，待含菌培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)24h后計菌落數(shù)。以不加芒果核多酚溶液為對照。

1.2.5 HPLC分析條件 YWG C18色譜柱(4.6mm× 250mm，10μm)，柱溫:30℃;流動相:A相:水-乙酸(98∶2);B相:乙腈-0.5%乙酸(50∶50)，洗脫梯度: B相:20%-45%-55%-20%;時間(min):0-35-55-60;進(jìn)樣量:10μL;流速:0.25mL/min;檢測波長:280nm。

1.2.6 HPLC-ESI-MS分析條件 液相條件:Zorbax SB-C18色譜柱(2.1×150mm，5μm);柱溫:30℃;流動相:A相:水-乙酸(98∶2);B相:乙腈-0.5%乙酸(50∶50);進(jìn)樣量:1μL;流速:0.25mL/min;洗脫梯度: B相:20%-45%-55%-20%;時間(min):0-35-55-60;檢測波長:280nm。

質(zhì)譜條件:電噴霧(ESI)離子化源;質(zhì)量掃描范圍:100～2000;干燥氣流速:8L/min;干燥氣溫度: 350℃;噴霧器壓力:30psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果多酚抑菌活性的研究

2.1.1 濾紙片法檢測芒果多酚的抑菌作用 由表1可以看出，當(dāng)濃度為8mg/mL時，芒果核多酚粗提物對所試四種細(xì)菌均具有較強的抑制作用，經(jīng)AB-8大孔樹脂初步純化后，其對供試的幾種細(xì)菌的抑菌活性有所增強;且隨著濃度的升高，抑菌效果也明顯升高，當(dāng)濃度增至8mg/mL與同濃度的茶多酚相當(dāng)。但是對供試的兩種真菌均無抑制活性。

2.1.2 平板計數(shù)法檢測芒果核多酚初步純化物的抑菌效果 由表2可知，隨著芒果核多酚濃度的增加，芒果多酚的抑菌活性增強，當(dāng)芒果核多酚濃度增加到2mg/mL時，枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌完全不生長;當(dāng)芒果多酚濃度增加到3mg/mL時，大腸桿菌和金黃葡萄球菌完全不生長。平板計數(shù)法與濾紙片法相比抑菌效果更加明顯，這可能與芒果多酚在濾紙片上的吸附和擴(kuò)散能力有關(guān)。

表2 不同濃度芒果核多酚初步純化物對細(xì)菌作用后的菌落數(shù)(cfu/mL)

2.1.3 濾紙片法檢測不同級分芒果多酚的抑菌作用

由表3可以看出，用60%乙醇水溶液洗脫后得到的組分Ⅲ在2mg/mL的濃度下對供試的幾種細(xì)菌都有較強的抑菌活性，與同濃度的茶多酚抑菌效果相當(dāng)，但對供試的兩種真菌均無抑菌活性，而采用20%和40%乙醇水溶液洗脫后所得組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)┰嚨膸追N微生物均無抑菌活性。

表3 不同級分芒果核多酚提取純化物的抑菌作用

2.2 芒果核多酚各級分的高效液相色譜分析

抑菌實驗表明，芒果核多酚組分Ⅲ為主要的活性級分，為進(jìn)一步弄清其抑菌活性組分的結(jié)構(gòu)，將上述所得的芒果核多酚組分Ⅲ進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，所得組分Ⅲ在HPLC上的分離效果不盡理想，為此，將組分Ⅲ重新上Sephadex LH-20柱，采用60%乙醇洗脫并進(jìn)行分部收集，此級分可得到兩個洗脫峰(組分Ⅲ-A和組分Ⅲ-B)，其HPLC分析圖分別見圖2及圖3。從這兩個圖可以看出，組分Ⅲ-A主要含保留時間分別為19.3、32.1、41.2min的三個峰，而組分Ⅲ-B的主要成分為保留時間34.3min的化合物。

圖1 芒果多酚組分Ⅲ的高效液相色譜圖

圖2 組分Ⅲ-A的高效液相色譜圖

圖3 組分Ⅲ-B的高效液相色譜圖

2.3 芒果多酚各級分的HPLC-MS分析

2.3.1 組分Ⅲ-A的HPLC-MS分析 圖4～圖6分別是組分Ⅲ-A的HPLC、總離子流圖及主要峰的MS及MS2碎片離子圖。此級分主要含有保留時間分別為2.0、4.7、9.1及12.4min的四個峰，其中峰1的［M-H］-的m/z為635，由于沒有更多的碎片信息，依據(jù)其HPLC保留特性和分子離子峰，經(jīng)與相關(guān)文獻(xiàn)［7］對比，此化合物可能為三沒食子酰基葡萄糖。峰2～峰4的［M-H］-的m/z均為197，由于未能得到更多結(jié)構(gòu)信息，這些化合物的結(jié)構(gòu)尚不能確定。

圖4 組分Ⅲ-A的高效液相色譜圖

圖5 組分Ⅲ-A的總離子流圖

圖6 圖4中峰1～峰4的ESI-MS圖譜

2.3.2 組分Ⅲ-B的HPLC-MS分析 圖7～圖9分別是組分Ⅲ-B的HPLC、總離子流圖及主要峰的MS碎片離子圖。此級分主要含有保留時間分別為9.0、13.8、15.0、15.3、16.7、21.7及23.6min的7個峰，其中前5個峰［M-H］-的m/z均為787，結(jié)合其分子量信息、HPLC保留特性和文獻(xiàn)［7］報道的芒果核多酚的特性和結(jié)構(gòu)分析，初步判斷此5個峰均為四沒食子?；咸烟?。峰6和峰7其［M-H］-的m/z分別為470和579，由于未能得到更多結(jié)構(gòu)信息，兩個化合物的結(jié)構(gòu)尚不能確定。

圖7 組分Ⅲ-B的高效液相色譜圖

圖8 組分Ⅲ-B的總離子流圖

3 結(jié)論

芒果核多酚在一定的濃度下對供試的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和金黃葡萄球菌都有較強的抑菌活性，隨著濃度的升高，抑菌效果也明顯升高，當(dāng)其濃度達(dá)到3mg/mL時，可以完全抑制四種供試細(xì)菌的生長，但是對供試的兩種真菌均無明顯抑菌活性。芒果核多酚經(jīng)AB-8大孔樹脂和SephadexLH-20柱進(jìn)行初步純化后所得的組分Ⅲ對供試菌的抑制活性最強，與茶多酚相當(dāng)，是芒果主要的抑菌活性組分。HPLC-ESI-MS的分析結(jié)果初步表明，芒果多酚的抑菌活性組分主要含有不同取代度的沒食子?；咸烟穷愇镔|(zhì)，有關(guān)其它化合物的結(jié)構(gòu)還有待更進(jìn)一步研究。

圖9 圖7中峰1～峰7的ESI-MS圖譜

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Study on the antibacterial active constituents of mango kernel polyphenol

LI Chun-mei，TIAN Yan，ZHONG Hui-zhen，YANG Li，ZHOU Li-ming
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)

The antibacterial activities of polyphenol extracts from mango kernel and the activity fraction were studied.The results showed that polyphenol extracts from mango kernel had inhibitory effects on 4 kinds of tested bacteria(Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Bacillus thruingiensis)，but had no effect on yeast and Aspergillus niger.The inhibitory effect of fraction III purified from the crude extract by AB-8 macroporous resin and sephadexLH-20 columns was the strongest on the tested bacteria.HPLC-ESI-MS analysis showed that the main active antibacterial constituents of mango kernel polyphenol were indican compounds of gallotannins such as tri-O-galloyl-glucose and tetra-O-galloyl-glucose.

mango kernel;polyphenol;antibacterial activity;active fraction

TS255.1

A

1002-0306(2011)03-0172-04

芒果(Mangifera indica Linnaeus)屬漆樹科芒果屬(Mangifera Linn.)常綠喬木，是熱帶亞熱帶著名水果，我國芒果產(chǎn)地主要分布在海南、廣東、廣西、福建、云南、四川和臺灣等省(區(qū))。在加工過程中占芒果總重20%～40%左右的果皮和果核一般都被丟棄或用作飼料，而果皮和果核等副產(chǎn)物中含有大量的可被利用的多酚類化合物。目前國內(nèi)外對于芒果多酚的研究非常有限，國外Andreas等［1］對芒果肉多酚組成進(jìn)行了研究，徐志等［2］和覃麗儉等［3］對芒果皮粗提物的微生物抑制活性進(jìn)行了初步研究，李琳等［4］研究了芒果皮粗提液的抗氧化活性。對芒果核多酚的研究，僅Toshihide等［5］對芒果核粗提物的抗食品病源微生物的性質(zhì)進(jìn)行了研究，初步分析表明具有病源微生物抑制活性的成分是多酚物質(zhì)。本文對芒果核多酚的抑菌活性及抑菌活性組分進(jìn)行了研究，旨在變廢為寶，為充分利用我國的芒果資源，開發(fā)新型抑菌劑提供理論依據(jù)。

2010-03-01

李春美(1973-)，女，博士，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物化學(xué)。