分離谷胱甘肽D840樹脂的篩選研究

張玉然，楊海麟，辛 瑜，仝艷軍，張 玲，王 武

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

分離谷胱甘肽D840樹脂的篩選研究

張玉然，楊海麟，辛 瑜，仝艷軍，張 玲，王 武*

(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

采用D201、201×7、D354、D840、D001、001×7六種樹脂，對從啤酒酵母中抽提的谷胱甘肽超濾樣液進行靜態(tài)吸附比較，篩選出D840樹脂的吸附容量最高;并初步研究了樹脂的洗脫，在1mL/min的流速下，用0.3mol/L的鹽酸洗脫，收集洗脫液中谷胱甘肽，回收率為72.08%，純度為50.5%。

啤酒酵母，谷胱甘肽，樹脂，吸附容量，洗脫

1 材料與方法

1.1 材料與設備

啤酒干酵母 市售;D354、D840、D001、001×7樹脂 江蘇爭光樹脂有限公司;D201、201×7樹脂江蘇蘇青水處理有限公司;GSH與GSSG純品 日本協(xié)和(kyowa)發(fā)酵株式會社;DTNB試劑 上海世澤生物科技有限公司，SIGMA公司分裝;乙腈 江蘇漢邦科技有限公司，色譜純;其它試劑 均為化學分析純。

Agilent高效液相色譜系統(tǒng)、Agilent氨基酸分析儀 美國安捷倫公司;3K15低溫高速離心機 德國SIGMA公司;超濾裝置 中科院上海應用物理所膜分離技術(shù)研究發(fā)展中心;UV754紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;Φ1.0cm×50cm玻璃層析柱 上海錦華層析設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗條件 高效液相色譜條件:色譜柱: Agilent C18柱(150mm×4.6mm，5μm);流動相為磷酸鹽溶液(取磷酸二氫鉀2.72g，庚烷磺酸鈉2.02g，加水溶解，定容至 1L，磷酸調(diào)節(jié) pH至 2.0)-乙腈(125∶1);流速為0.7mL/min;檢測波長為220nm;柱溫為25℃，進樣量為5μL。

1.2.2 工藝流程

1.2.3 操作要點

1.2.3.1 GSH超濾液的制備 取一定量的啤酒干酵母，按料液比1∶8加入去離子水，混勻，醋酸-鹽酸(先加醋酸調(diào)pH 3.7，再加鹽酸調(diào)pH3.5)調(diào)至pH 3.5，在69～72℃下，攪拌加熱14min，抽提菌液置于冰水浴中冷卻至室溫離心(6000r/min，12min)，取上清液，采用孔徑0.45、0.22μm的混合纖維素酯微孔濾膜進行抽濾。膜壓差ΔP=0.25MPa、pH2.0條件下，用含截留分子量5kDa聚醚砜膜的超濾設備進行超濾，黃色澄清濾液用2mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至不同pH備用。

1.2.3.2 GSH超濾液穩(wěn)定性的研究 取超濾液各25mL，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH分別為2.05、4.29、5.97、7.08，放置于層析柜內(nèi)(25℃)，計時，測定在0、50、90、180min時超濾樣液中GSH的濃度。

1.2.3.3 D840樹脂的吸附及洗脫 各取28mL pH分別為2.02、2.80、3.59、4.29的GSH超濾液，加入7mL D840濕樹脂中，以120r/min的轉(zhuǎn)速在搖床中搖1.5h后(25℃)，測定上清液中GSH的濃度;各取28mL pH 4.29，濃度分別為0.57、1.06、2.18g/L的超濾液，加入7mL D840濕樹脂中，以120r/min的轉(zhuǎn)速在搖床中搖1.5h后(25℃)，測定上清液中GSH的濃度;將25mL預處理好的D840濕樹脂裝入Φ1.0cm×50cm玻璃層析柱中，保證裝柱時無氣泡產(chǎn)生，樹脂上層表面一直有水覆蓋，取濃度為2.19g/L、pH 4.27的GSH超濾液，在1.30mL/min的流速下，上樣60mL，水洗后，用0.2mol/L的鹽酸洗脫，收集洗脫液，測定GSH含量，并使用高效液相色譜法檢測洗脫液中GSH純度。

1.2.3.4 陰離子交換樹脂(D201、201×7、D354)的篩選 各取三份60mL pH分別為2.02、2.7、3.51、4.32的GSH超濾液，分別加入10mL D201、201×7、D354濕樹脂，25℃下，以120r/min的轉(zhuǎn)速在搖床中搖1.5h后，測定上清液中GSH的濃度。

1.2.3.5 陽離子交換樹脂(D001、001×7)的篩選各取兩份57mL pH分別為1.05、2.01、2.51、3.02的GSH超濾液，分別加入8mL D001、001×7濕樹脂，以120r/min的轉(zhuǎn)速在搖床中搖1.5h后(25℃)，測定上清液中GSH的濃度。

1.2.3.6 D840、001×7、201×7三種樹脂的篩選 取60mL pH 4.29的超濾液加入10mL D840和201×7樹脂中，另取 60mL pH2.01的超濾液加入 10mL 001×7樹脂中，以120r/min的轉(zhuǎn)速在搖床中搖1.5h后(25℃)，測定上清液GSH的濃度。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 GSH的含量測定 改進的Ellman’s測定方法［8］，試管中共16mL反應體系，含有0.8mL DTNB溶液(4mmol/L DTNB，0.1mol/L Na2HPO4)，一定體積的Na2HPO4緩沖液(0.1mol/L，pH6.98)和樣品溶液，漩渦混合器混合后，室溫靜置6min，測定412nm處樣液OD值，根據(jù)建立的標準曲線計算測定樣品中GSH的濃度。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用Bradford檢測法，見參考文獻［9］。

1.2.4.3 樹脂的預處理及相關數(shù)據(jù)計算方法 使用去離子水沖洗樹脂，除去機械雜質(zhì)，首先用約2倍樹脂體積的飽和食鹽水溶液浸泡16～18h，清水漂凈，至上清液不帶黃褐色;然后用兩倍樹脂體積的2%～4% NaOH溶液浸泡5～7h，放盡堿液，用水沖洗樹脂至中性;最后用兩倍樹脂體積的4%～6%HCl溶液浸泡6～8h，放盡酸液，用水沖洗樹脂至中性，備用。陽離子樹脂先用堿溶液處理后用酸溶液處理，陰離子樹脂先用酸溶液處理后用堿溶液處理。

料液比=干酵母總量(g)/去離子水體積(mL)

樹脂GSH交換容量=樹脂吸附上樣液中GSH的總量(mg)/所用樹脂的總量(mL)

上樣液GSH吸附率(%)=(原上樣液GSH濃度-樹脂吸附后上樣液GSH濃度)/原上樣液GSH濃度×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 GSH超濾液穩(wěn)定性的研究

離子交換層析時，由于GSH超濾液中具有氧化性物質(zhì)，不同時間和pH條件下超濾液內(nèi)GSH氧化率不同，以下測定了不同時間和pH條件下，超濾樣液中GSH的濃度，計算GSH氧化率，以下數(shù)據(jù)均測定三次，結(jié)果見圖1。

圖1 不同時間和pH對超濾液中GSH穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，pH越低，超濾液中GSH穩(wěn)定性越好，在pH2.05、4.29、5.97、7.08時，90min后GSH總氧化率分別為1.40%、3.83%、11.49%、31.02%，因此在對GSH超濾液進行樹脂靜態(tài)吸附時，控制pH越低越好，最佳使用pH應低于4.5左右，以降低GSH氧化損失。

2.2 D840樹脂的吸附及洗脫

2.2.1 pH對D840樹脂GSH交換容量的影響 上樣超濾液的pH是影響樹脂GSH吸附的重要因素之一，pH過低將使氫離子濃度過大，影響GSH的吸附，pH過高會導致GSH不同程度的氧化，由于GSH等電點為2.89，因此在pH2.02～4.29范圍內(nèi)對D840樹脂GSH交換容量進行測定比較適宜，以下數(shù)據(jù)均測定三次，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，GSH超濾液在pH 4.29時吸附量最大，這是因為在pH4.29時，GSH整體帶負電荷，可更強競爭性吸附D840樹脂功能基團末端的氨基和亞氨基;而在pH2.02時，由于樣液中存在大量的氫離子影響GSH的吸附，因此在pH2.02～4.29范圍內(nèi)，選擇pH4.29較為適宜。

圖2 pH對D840樹脂GSH交換容量的影響

2.2.2 料液濃度對D840樹脂GSH交換容量的影響

用同體積不同濃度的超濾液上樣將影響樹脂GSH交換容量，以下為不同濃度的超濾液中，樹脂GSH的交換容量的曲線，以下數(shù)據(jù)均測定三次，結(jié)果見圖3。

圖3 上樣液濃度對D840樹脂GSH交換容量的影響

由圖3可知，在料液濃度為0.54～2.18g/L時，隨著料液濃度的增加，D840樹脂GSH交換容量也增大，這將提高樹脂的利用率，減小生產(chǎn)成本，對于樹脂的最大最適上樣濃度后期將進一步研究。

2.2.3 D840樹脂的洗脫 D840樹脂具有較高的交換容量，以下為在1mL/min流速下，上柱60mL樣液，水洗滌去雜后，用0.3mol/L鹽酸洗脫的曲線，分組收集，結(jié)果見圖4。

圖4 鹽酸洗脫曲線

由圖4可知，鹽酸洗脫時洗脫峰集中，這是由于用0.3mol/L鹽酸洗脫時，樹脂內(nèi)酸性pH將遠低于GSH等電點，此時GSH帶正電荷易被洗脫，收集洗脫液，進行高效液相色譜分析，圖5、圖6為洗脫液的高效液相色譜圖譜。

由圖6可知，GSH已成為洗脫液中的主含量物質(zhì)，相比于前期超濾液中的微量GSH含量，純度提高，此洗脫液中GSH回收率為72.08%，純度約為50.5%，為后期GSH的精提提供良好條件。

圖5 GSH純品的高效液相色譜圖譜

圖6 GSH洗脫液的高效液相色譜圖譜

2.3 陰離子交換樹脂(D201、201×7、D354)的篩選

pH是影響樹脂GSH吸附的重要因素之一。pH過高會導致GSH不同程度的氧化，由于GSH等電點為2.89，因此對于陰離子交換樹脂，在pH2.02～4.29范圍內(nèi)對樹脂GSH交換容量進行測定比較適宜，以下數(shù)據(jù)均測定三次，結(jié)果見圖7。

圖7 不同pH條件下三種陰離子交換樹脂交換容量的比較

由圖7可知，在pH 2.02～4.32時，201×7型樹脂的GSH交換容量優(yōu)于其它兩種樹脂，且在pH 4.32時交換容量最大。這是由于大孔陰離子交換樹脂不僅可以吸附帶負電荷的小分子物質(zhì)，也可以吸附帶負電荷的大分子物質(zhì)，這將降低GSH的交換容量。

2.4 陽離子交換樹脂(D001、001×7)的篩選

pH是影響樹脂GSH吸附的重要因素之一，pH過低將使氫離子濃度過大，影響GSH的吸附，由于GSH等電點為2.89，因此對于陽離子交換樹脂，在pH 1.05～3.53范圍內(nèi)對樹脂GSH交換容量進行測定比較適宜，結(jié)果見圖8。

圖8 不同pH條件下兩種樹脂交換容量的比較

由圖8可知，在pH 1.05～3.53時，001×7型樹脂的GSH交換容量優(yōu)于D001大孔樹脂，且在pH為2.01處交換容量最大。這是由于D001大孔樹脂不僅可以吸附正電荷小分子物質(zhì)，還可以吸附帶正電荷的大分子物質(zhì)，會導致GSH交換容量的降低。

2.5 D840、001×7、201×7三種樹脂的篩選

以上分類對幾種樹脂的GSH交換容量進行了比較，以下為每種樹脂在最佳pH條件下的交換容量比較，以下數(shù)據(jù)均測定三次，結(jié)果見圖9。

圖9 三種樹脂GSH交換容量的比較

由圖9可知，三種樹脂在各自最佳的pH條件下，D840樹脂吸附量最高，這可能是由于D840功能基團上一個氨基和一個亞氨基，能更多吸附GSH，而其他兩種樹脂吸附能力較弱，因此選用D840樹脂。

3 結(jié)論

通過對D201、201×7、D354、D840、D001、001×7六種樹脂靜態(tài)吸附量的比較，D840樹脂的靜態(tài)交換容量最大，后期在1mL/mL流速下，用0.3mol/L鹽酸進行初步洗脫研究，得到洗脫液中回收率為72.08%，GSH純度即可達到約50.5%，此種樹脂交換容量大，可提高樹脂的利用率，降低成本，初步洗脫得到的洗脫液GSH純度較高，也為進一步分離得到高純度GSH產(chǎn)品提供有利條件，后期將進一步優(yōu)化研究D840樹脂的洗脫條件。

［1］Meister A，Anderson M E.Glutathione［J］.Annual Review of Biochemistry，1983，52:711-760.

［2］Izawa S，Inoue Y，Kimura A.Oxidative Stress Respnse in Yeast-Effect of Glutathione on Adaptation to Hydrogen-Peroxide Stress in Saccharomyces Cerevisiae［J］.Febs Letters，1995，368 (1):73-76.

［3］劉振玉.谷胱甘肽的研究與應用［J］.生命的化學，1995，15 (1):19-21.

［4］王輝，馮萬祥.含汞樹脂分離提純谷胱甘肽［J］.華東理工大學學報，1996，22(6):717-721.

［5］Maki Haruhiko，F(xiàn)ukuda Hideki.The Separation of Glutathione and Glutamic Acid Using a Simulated Moving-Bed Absorber System［J］.Fermentation Technology，1987，65(1):61-70.

［6］邱雁臨，胡靜，繆謹楓，等.大孔樹脂分離啤酒廢酵母中谷胱甘肽的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2008，24(2):131-133.

［7］胡曉梅，黃絹，舒媛，等.離子交換樹脂分離純化谷胱甘肽的研究［J］.發(fā)酵科技通訊，2008，37(4):20-22.

［8］Ellman G L.A Calorimetric Method for Determining Low Concentrations of Mercaptans［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，1958，74(2):443-450.

［9］Bradford M，Marion M.A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quangtities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

Study on screening of D840 resin used to separate glutathione

ZHANG Yu-ran，YANG Hai-lin，XIN Yu，TONG Yan-jun，ZHANG Ling，WANG Wu*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Six exchange resins including D201，201×7，D354，D840，D001 and 001×7 were used for separating glutathione from the ultra-filtration solutions extracted from beer yeasts.D840 resin had relatively high capacity. Under the condition of stated elution rate(1mL/min)，the recovery of GSH was 72.08%eluting by hydrochloric acid (0.3mol/L)，and the purity of GSH was 50.5%.

beer yeasts;glutathione;resin;adsorption capacity;elute

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0146-04

谷胱甘肽(GSH)是一種具有重要生理功能的天然活性三肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)［1］，具有抗氧化、解毒、改善風味等作用，在臨床醫(yī)藥、食品行業(yè)以及化妝品行業(yè)等領域有著廣泛的用途［2］，在空氣中易氧化成氧化性谷胱甘肽(GSSG)，近期研究發(fā)現(xiàn)GSH還具有抑制艾滋病的作用［3］。GSH的生產(chǎn)方法主要有萃取法、化學合成法、發(fā)酵法，其中以發(fā)酵法為主。從發(fā)酵液中分離提取GSH的方法有銅鹽法、金屬螯合親和色譜法［4］、離子交換樹脂分離法［5］，其中銅鹽法是一種比較傳統(tǒng)的方法，工藝復雜，污染較大，殘留的銅離子也影響GSH的應用范圍;金屬螯合親和色譜法，一般需要使用含重金屬的樹脂，此類樹脂對酸堿敏感，穩(wěn)定性差，GSH產(chǎn)品重金屬含量易超標;離子交換樹脂工業(yè)近幾年在我國發(fā)展迅速，具有樹脂可重復利用、價格低廉、分離快速、易于工業(yè)化等優(yōu)點，正在成為后期GSH分離的熱門技術(shù)。近年來我國也有一些關于用離子交換樹脂分離谷胱甘肽的報道［6-7］，但使用樹脂的種類較為單一，很少有對多種樹脂進行綜合篩選的報道。本工作對一種螯合樹脂(D840)、三種陰離子交換樹脂(D201、201×7、D354)和兩種陽離子交換樹脂(D001、001×7)進行比較，確定D840樹脂交換容量最高，并對樹脂的洗脫進行了初步研究。

2009-12-25 *通訊聯(lián)系人

張玉然(1985-)，女，在讀碩士，研究方向:生物化學與分子生物。

江南大學自主科研計劃學科交叉創(chuàng)新團隊基金(1042050205091140)。