酶法提取茶樹修剪葉中的蛋白及其性質(zhì)研究

李 言，章海燕，胡 敏，王 立，張 暉，姚惠源

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214036)

酶法提取茶樹修剪葉中的蛋白及其性質(zhì)研究

李 言，章海燕，胡 敏，王 立*，張 暉，姚惠源

(江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214036)

以蛋白的提取率為指標，利用Alcalace、果膠酶和纖維素酶在緩沖液條件下對茶樹修剪葉中蛋白的提取進行了研究，發(fā)現(xiàn)這三種酶均能有效提高蛋白質(zhì)的提取率，利用果膠酶和纖維素酶分別與Alcalace合用發(fā)現(xiàn)，纖維素酶和Alcalace合用能夠很明顯提高蛋白質(zhì)的提取率，比單用Alcalace或纖維素酶分別提高了近35%和近50%。對利用Alcalace和纖維素酶協(xié)同作用得到的茶葉蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，利用堿法和酶法提取對于蛋白質(zhì)的氨基酸組成基本沒有影響，除吸水性和起泡穩(wěn)定性略差于堿提茶葉蛋白外，酶法提取茶葉蛋白的其它指標如吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性以及起泡性均優(yōu)于堿提茶葉蛋白。

茶樹修剪葉，蛋白質(zhì)，提取，酶法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樹修剪葉 2009年6月取自江蘇省溧陽市天目湖玉枝特種茶果園藝場，去除枝條后風干，粉碎，過20目篩，備用(蛋白質(zhì)含量為22.8%，茶多酚含量為21.78%，茶葉總糖含量為23.51%，水分含量為5.85%);堿性蛋白酶Alcalace 諾維信(中國)生物醫(yī)藥有限公司，活力 240000U/g;果膠酶(活力30000IU/g)、纖維素酶(活力10000IU/g) 江蘇無錫酶制劑廠;其余試劑 均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠;水循環(huán)真空泵 SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;定時恒溫磁力攪拌器 94-2，上海志威電器有限公司;可見分光光度計 UV1100，北京瑞利分析儀器廠;雙光束紫外可見分光光度計 TU-1900，北京普析通用儀器有限責任公司;ECP3000型三恒多用電泳儀 山東省龍口市先科儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白提取工藝 酶法提取蛋白是利用蛋白酶對蛋白的降解和修飾作用，使其變成可溶的肽而被抽提出來。酶法提取反應條件比較溫和，蛋白質(zhì)多肽鏈可水解為短肽鏈，能夠提高蛋白質(zhì)的消化率，同時其反應的液固比小，不僅節(jié)省了堿(傳統(tǒng)方法一般是利用堿來提取蛋白質(zhì))和水的消耗量，而且提高了提取液中的固形物含量，從而降低了除去提取液水分的能量消耗，為工業(yè)生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。具體的實驗步驟如下:

定量茶樹修剪葉→加入酶→攪拌提取→抽濾→濾液濃縮干燥→茶葉蛋白粗品

1.2.2 茶葉蛋白性質(zhì)研究

1.2.2.1 蛋白組成研究 具體方法見圖1。

圖1 茶葉蛋白組分分級流程圖

1.2.2.2 氨基酸分析 待測含硫氨基酸的樣品采取過甲酸氧化-鹽酸水解法進行處理，待測其余氨基酸的樣品采取鹽酸水解法處理。樣品水解后用氨基酸自動分析儀測定各種氨基酸的濃度。γ-氨基丁酸用2，4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生反相高效液相色譜紫外檢測法測定［6］。

1.2.2.3 功能性質(zhì)分析［7］a.持水持油能力:取1g蛋白質(zhì)樣品，加入10mL水或玉米油，用玻璃棒輕輕攪拌，分散至無明顯顆粒，靜置30min，離心(3000r/ min，20min)，傾去上清液，稱重(W)。蛋白質(zhì)持水性/持油(g/g)=(W-1)/1。

b.乳化及乳化穩(wěn)定性:采用濁度法測定，具體操作如下:取0.5%濃度(w/v)的蛋白樣品溶液40mL，加入40mL色拉油，在10000r/min轉(zhuǎn)速下攪拌2min，轉(zhuǎn)移入刻度離心管，3000r/min離心5min，取出讀取體積。乳化能力=乳化層體積/液體總體積×100%。

將上述溶液放置 30min后，3000r/min離心5min，取出讀取體積。乳化穩(wěn)定性=乳化層剩余體積/乳化層初始體積×100%。

c.起泡及起泡穩(wěn)定性:在緩沖溶液(pH7.0)中配制1%的蛋白質(zhì)溶液，取100mL，倒入高速組織搗碎機中，在10000r/min轉(zhuǎn)速下攪拌1min;轉(zhuǎn)入250mL量筒，立即記錄泡沫體積(V0);15、30、60min后各再次記錄泡沫體積(Vt)。蛋白質(zhì)的起泡性(%)= (V0-100)/100×100%，其中:t為乳狀液放置時間。蛋白質(zhì)起泡穩(wěn)定性=(V0-Vt)/V0×100%。

2 結果與討論

2.1 提取工藝的優(yōu)化

實驗組實習生的實踐、理論平均成績均明顯超過了2015年實習生的實踐、理論平均成績,兩項平均成績數(shù)據(jù)差異明顯,具備統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

茶葉中蛋白含量為20%左右，另外含有茶多酚、茶葉多糖、木質(zhì)素等物質(zhì)，蛋白不可避免地與其有相互作用而導致難以提取，因此本研究中擬利用果膠酶和纖維素酶對其作用進行弱化，同時利用蛋白酶作用，從而提高蛋白的提取得率。

2.1.1 蛋白酶作用對提取效果的影響 Alcalace是一種能夠水解多種蛋白質(zhì)的高效細菌蛋白酶，是一種堿性內(nèi)切酶，最佳pH為6.5～8.5，在本研究中控制pH為7，具體結果見表1。

從表1可以看出，隨著蛋白酶用量的增加，蛋白質(zhì)提取率有比較明顯的提高，當?shù)鞍酌赣昧繌臎]有添加到添加量為960U/g茶葉時，蛋白質(zhì)的提取率提高了近60%，而繼續(xù)提高酶的用量，蛋白質(zhì)的提取率沒有明顯的變化(僅提高1%～2%)，說明添加蛋白酶有利于提高蛋白質(zhì)的提取率，但是酶用量過大的時候，蛋白酶對茶葉不溶性蛋白的水解能力不再是提高蛋白質(zhì)提取率的限制因素，同時已經(jīng)提取出的蛋白質(zhì)被水解成更小的肽，而蛋白質(zhì)的提取率沒有得到提高，因此考慮蛋白酶的用量控制在 960U/g茶葉。

2.1.2 果膠酶用量對提取效果的影響 考慮到茶葉中有一定含量的果膠，而且蛋白質(zhì)可能與果膠相互作用，采用果膠酶處理進行蛋白質(zhì)的提取，具體結果見表2。

從表2可以看出，隨著果膠酶用量的增加，茶葉蛋白的提取率隨之增加，當酶用量添加到600IU/g茶葉的時候，蛋白的提取率達到了48%左右，比不添加果膠酶的提取率提高了30%左右，說明添加果膠酶有利于對樹葉中的果膠進行作用［8］，從而有利于蛋白質(zhì)的提取。但是當酶的用量繼續(xù)增加，蛋白的提取率提高比較緩慢，可以考慮果膠酶的用量控制在600IU/g茶葉。

表1 蛋白酶用量對提取效果的影響

表2 果膠酶用量對提取效果的影響

表3 纖維素酶對提取效果的影響

表4 果膠酶和蛋白酶合用對提取效果的影響

表5 纖維素酶和蛋白酶合用對提取效果的影響

表6 茶葉蛋白質(zhì)的組成

2.1.3 纖維素酶用量對提取效果的影響 樹葉中不僅有果膠類物質(zhì)，還含有豐富的纖維素，而且纖維素易于與蛋白質(zhì)結合，導致提取效率不高。采用不同添加量的纖維素酶進行提取，具體結果見表3。

從表3可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，蛋白質(zhì)的得率隨之增加。當酶的用量超過400IU/g茶葉時，提取率提高不明顯，可以考慮纖維素酶用量控制在400IU/g茶葉。

2.1.4 兩種酶合用對提取效果的影響 比較表1～表3，發(fā)現(xiàn)添加這三種酶后茶葉蛋白的提取率均得到了一定的提高，其中蛋白酶的作用最好?？紤]到果膠酶和纖維素酶的作用是破壞蛋白與果膠或纖維素等物質(zhì)的結合，以達到釋放出蛋白從而提高提取率，因此采用不同用量的果膠酶或纖維素與蛋白酶結合使用提取蛋白質(zhì)，具體方案和結果見表4和表5。

2.2 茶葉蛋白性質(zhì)的研究結果

2.2.1 茶葉蛋白組成分析 茶葉蛋白質(zhì)的組成見表6。

從表6可以看出，茶葉蛋白中絕大部分為谷蛋白，與相關報道一致［9-10］，而這部分蛋白質(zhì)在水中的溶解性比較低，因此，需要用堿提取或者利用酶水解的方法來進行提取。

2.2.2 茶葉蛋白的氨基酸分析 對酶法提取得到的茶葉蛋白進行氨基酸分析，結果見表7。

表7 茶葉蛋白的氨基酸分析

從表7可以看出，利用酶法提取茶葉中的蛋白質(zhì)，提取效率要低于堿法提取，這和其他蛋白提取的結果一致［12］，分析茶葉蛋白組成也發(fā)現(xiàn)，其中含量較高的為谷蛋白，而該種氨基酸需要用堿法才能進行有效的提取［13］，因此也影響了酶法提取的效率。同時從結果中也可以看出，用酶法進行提取的茶葉蛋白在氨基酸組成上與堿法提取的沒有顯著的差異，因此盡管提取效率不同，但營養(yǎng)成分沒有較大的變化，這也與已有的報道一致［11］。

2.2.3 茶葉蛋白功能性質(zhì)分析 茶葉蛋白的功能性質(zhì)見表8。

蛋白質(zhì)的持水性是蛋白質(zhì)水化性質(zhì)中一個很重要性質(zhì)，它取決于蛋白質(zhì)與水之間的相互作用。蛋白質(zhì)吸收和保留水的能力對于各種不同的食品，特別是肉漿和焙烤面團的質(zhì)構起著重要的作用［14］。從表8中可以看出，相對于堿提茶葉蛋白，酶法提取的茶葉蛋白吸水性降低而吸油性升高，可能原因是在提取的時候添加了蛋白酶，部分茶葉蛋白被水解成氨基酸或者多肽，包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露出來。

表8 茶葉蛋白的持水持油能力

蛋白質(zhì)常被作為乳化劑用于乳狀液食品體系中，如酪蛋白在冰淇淋中的應用，大豆蛋白在火腿腸中的應用。已知蛋白質(zhì)的乳化能力與其溶解度、分子鏈的柔性以及疏水性等因素有密切關系。在不損失溶解性的前提下，蛋白質(zhì)的適度熱變性對其乳化能力有促進作用［14］。從表8中可以看出，酶法提取的茶葉蛋白的乳化性相比堿提茶葉蛋白提高了10%左右，而乳化穩(wěn)定性則略有提高，說明堿提過程雖然對蛋白質(zhì)結構有一定的破壞，但是暴露出的疏水基團還低于酶法水解后的。

蛋白質(zhì)分子的雙親基團使其能定位吸附于氣-水界面，形成泡沫體系。蛋白質(zhì)的發(fā)泡性與其分子的柔性、疏水性、溶解性等因素有關，而泡沫的穩(wěn)定性則依賴于蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和粘彈性［15］。從表8可以看出，酶法提取的蛋白質(zhì)起泡性要高于堿法提取的蛋白質(zhì)。雖然植物蛋白的疏水性氨基酸含量比動物來源的卵清蛋白、酪蛋白等還要高，但由于其分子的柔性較差，在攪打時不能自發(fā)和快速地吸附于新形成的界面上，因而發(fā)泡性較差。

3 結論

3.1 利用蛋白酶、果膠酶或纖維素酶可以有效地提高茶葉中蛋白質(zhì)的提取得率，而且兩種酶合用效果更佳，纖維素酶和蛋白酶(400IU/g茶葉+480U/g茶葉)聯(lián)合使用，蛋白質(zhì)提取率達到78.57%。

3.2 對得到的茶葉蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)，利用堿提和酶法提取對于蛋白質(zhì)的氨基酸組成基本沒有影響，除吸水性和起泡穩(wěn)定性略差于堿提茶葉蛋白外，酶法提取茶葉蛋白的其它指標如吸油性、乳化性、乳化穩(wěn)定性以及起泡性均優(yōu)于堿提茶葉蛋白。

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Study on extraction of protein from pruned tea leaves by enzyme and its properties

LI Yan，ZHANG Hai-yan，HU Min，WANG Li*，ZHANG Hui，YAO Hui-yuan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China)

Protein was extracted from pruned tea leaves by Alcalace，pectinase，and cellulase，respectively.The yield increased significantly when the Alcalace，pectinase，and cellulase were used as 480，600，400IU/g，respectively. The protein yield extracted by cellulase and Alcalace was 35%higher than that extracted by Alcalace.In the same time，it was 50%higher than that extract by cellulose.The oil-holding capacity，emulsifying activity，emulsifying stability，and foaming capacity of protein extracted by enzyme were higher than those of protein extracted by alkaline，but the water-holding capacity and foam stability were lower than those of protein extracted by alkaline.

pruned tea leaves;protein;extraction;enzyme

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)03-0127-04

中國是產(chǎn)茶大國，茶葉資源十分豐富，年產(chǎn)量約80萬t，其中20～30萬t為低檔茶和碎茶，廢料約160萬t，包括在茶葉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量茶末、修剪葉、甚至滯銷的粗老茶，大部分沒有進一步加工而當作廢料處理［1］。茶葉的化學組成極其復雜，茶的鮮葉中含有75%～80%的水分，干物質(zhì)含量為20%～25%。干物質(zhì)中包含了成百上千種化合物，經(jīng)鑒定的已知化合物約有500多種，大致可分為蛋白質(zhì)(20%～30%)、多酚(20%～35%)、生物堿(3%～5%)、氨基酸(1%～5%)、碳水化合物(35%～40%)、礦物質(zhì)(4%～7%)、維生素、色素、脂肪和芳香物質(zhì)等［2-3］。由于堿法提取蛋白效率高，因此目前普遍采用此法，但采用堿法提取蛋白會改變蛋白質(zhì)營養(yǎng)學特性，而且有可能會生成賴-丙氨酸，這種物質(zhì)不但有毒，而且還會引起營養(yǎng)物質(zhì)的損失。除此之外，在高堿條件下還會產(chǎn)生以下不利反應:a.蛋白質(zhì)變性和水解;b.加速美拉德反應，產(chǎn)生黑色物質(zhì);c.提取物中非蛋白含量增加，分離效果降低［4］。而酶法提取茶葉蛋白可以克服這些缺點［5］，蛋白酶能使一部分蛋白質(zhì)水解成肽和氨基酸，從而提高蛋白質(zhì)的溶出率，同時蛋白質(zhì)酶法能夠提高和改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性、粘度等，還能避免酸法水解對氨基酸的破壞作用和變旋作用，以保證蛋白質(zhì)質(zhì)量。本研究中利用生物酶技術對茶樹修剪葉中的蛋白進行提取，同時對提取出的蛋白進行了氨基酸分析和簡單的功能研究。

2010-03-04 *通訊聯(lián)系人

李言(1990-)，男，本科生，主要從事功能因子的研究。

江蘇省農(nóng)業(yè)攻關項目(BE2009414)。