火龍果皮總黃酮提取與體外抗氧化作用研究

王曉波，何曉燕，王 梅，劉冬英，陳海珍

(廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州510310)

火龍果皮總黃酮提取與體外抗氧化作用研究

王曉波，何曉燕，王 梅，劉冬英，陳海珍

(廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州510310)

目的:為火龍果皮總黃酮(PPF)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。方法:采用乙醇為溶劑，通過單因素實驗和正交實驗建立火龍果皮總黃酮最佳提取工藝條件，從還原能力、對不同體系產(chǎn)生的活性氧自由基清除效果評價火龍果皮乙醇提取物的抗氧化活性。結(jié)果:火龍果皮中總黃酮提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度80%，料液比1∶30，溫度80℃，時間0.5h。在最佳工藝提取條件下提取兩次，火龍果皮總黃酮的提取率為10.9mg/g。體外抗氧化實驗結(jié)果表明，火龍果皮總黃酮對超氧陰離子自由基和羥自由基具有較強的清除能力，對·OH＞O-2·，還原能力與VC相當(dāng)，弱于BHT。結(jié)論:火龍果皮總黃酮具有較強的體外抗氧化活性，作為天然抗氧化劑具有一定的開發(fā)利用價值。

火龍果皮，總黃酮，提取，體外抗氧化活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮火龍果 購于廣州市果品市場，洗凈、剝皮，火龍果皮放入鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱80℃干燥至恒重，粉碎機粉碎，過60目篩，裝密封袋備用;蘆丁 生化試劑，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;實驗用水 二次蒸餾水;其余均為國產(chǎn)分析純。

MP120-2電子分析天平 上海天平儀器廠; DL-228多功能食物攪拌機 廣州隆特電子有限公司;SHA-B 600型三用水箱 金壇市富華儀器有限公司;KA-1000離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠; SH2-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;722型分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司; 101A-1ET電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立［4］

本實驗確定以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取蘆丁對照品10mg，置于25mL容量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，搖勻，配制成濃度為0.4mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL容量瓶中，加5%NaNO3溶液0.3mL，放置6min，再加10%Al(NO3)3溶液0.3mL，放置6min，加4%NaOH溶液4.0mL，加水至刻度，搖勻，放置15min后于波長511nm處比色測定吸光度A，試劑為空白參比。

1.3 火龍果皮總黃酮提取工藝

1.3.1 單因素實驗［5］稱取0.5000g火龍果皮干粉于碘量瓶中，以乙醇溶液為溶劑，在恒溫水浴鍋中進行提取，然后提取液以3000r/min離心5min，取上清液定容，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法顯色測定其吸光值，計算提取率并進行比較。分別改變料液比、提取溫度、乙醇濃度和浸提時間等實驗條件，考察其對總黃酮提取率的影響。

1.3.2 正交實驗［6］在實驗中，由于各因素之間相互交叉影響，因此為全面考慮乙醇浸提法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，確定以乙醇濃度、提取溫度、料液比和浸提時間做4因素3水平的正交實驗，以得出最佳提取工藝條件。正交實驗因素和水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.3.3 總黃酮含量的測定［7］準(zhǔn)確稱取一定量火龍果皮干粉，以乙醇浸提法按最佳工藝條件進行總黃酮的提取，浸提兩次，提取液經(jīng)過濾、合并、真空濃縮、石油醚和乙酸乙酯除雜、80℃干燥并粉碎后得粗黃酮粉。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。將粗黃酮粉配制成一定濃度，精確吸取樣品溶液1.0mL置于10mL的容量瓶中，然后按與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法測定樣品溶液的吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出提取液總黃酮質(zhì)量濃度，根據(jù)下列公式計算提取率Y［10］。

式中，Y-火龍果皮總黃酮類物質(zhì)提取率;C-提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL;V-提取液體積，mL; W-火龍果皮粉末質(zhì)量，g;a-稀釋倍數(shù)。

1.4 火龍果皮總黃酮體外抗氧化活性測定方法

采用化學(xué)體系測定其對超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(OH·)的清除能力及火龍果皮總黃酮的還原能力，研究火龍果皮總黃酮的抗氧化活性。

1.4.1 清除超氧陰離子自由基(O2-·)能力測定 根據(jù)文獻［8］采用鄰苯三酚自氧化的方法，比色管中加入0.1mol/L Tris-HCl緩沖溶液和二次蒸餾水，于25℃恒溫20min后加入25℃預(yù)熱過的80mmol/L鄰苯三酚(對照管用10mmol/L鹽酸代替)，迅速搖勻，立即傾入光徑1cm比色杯中，在波長420nm處每0.5min測定1次吸光度A0。共測4min。計算鄰苯三酚自氧化管吸光度值隨時間的變化率ΔA0。

清除超氧陰離子能力計算公式:

清除率(%)=(ΔA0-ΔA1)/ΔA0×100%

式中，ΔA0-鄰苯三酚自氧化速率;ΔA1-加樣后鄰苯三酚自氧化速率。

1.4.2 清除羥基自由基(·OH)能力測定［9］參照Fenton反應(yīng)建立·OH自由基產(chǎn)生模型。在10mL具塞試管中加入5mL 0.2 mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液，1mL 0.75mmol/L鄰二氮菲溶液，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液和2mL樣品溶液，混勻后，加入1mL 3% H2O2啟動反應(yīng)，于37℃水浴中反應(yīng) 60min后，在536nm處測定其吸光度A0，以1mL的去離子水代替H2O2重復(fù)上述操作，測得A1，以同濃度的樣品溶液為對照品，測吸光值A(chǔ)2，按照下列公式計算清除率。

清除率(S，%)=(A2-A0)/(A1-A0)×100%

1.4.3 還原能力測定［10-11］采用普魯士藍法測定還原力，利用鐵氰化鉀K3Fe(CN)6還原成亞鐵氰化鉀K4Fe(CN)6，亞鐵氰化鉀再與Fe3+作用，生成亞鐵氰化鐵(普魯士藍)，在700nm處檢測普魯士藍的吸光度，以表示還原力的大小，吸光度越高，樣品的還原力就越強。

取2.5mL不同濃度的黃酮提取液于試管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.6)和2.5mL 1%K3Fe(CN)6溶液，于50℃水浴20min后快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液(TCA)，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%FeCl3溶液，充分混勻，靜置10min后，在700nm下測定其吸光度值(以蒸餾水代替樣品的混合液作參比溶液)，吸光度值越高，還原力越強。同法測定抗壞血酸和BHT的還原力。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以蘆丁為對照品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度Y與蘆丁含量X(mg/mL)間的回歸方程為:

Y=11.039X-0.001，R2=0.9997。由R2可以看出用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮的結(jié)果穩(wěn)定可靠，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品時，在0～0.4mg/mL濃度范圍內(nèi)線性較好。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對提取率的影響 稱取5份樣品，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，乙醇濃度70%，在70℃恒溫水浴鍋中水浴浸提1h，提取液離心后取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸光度，計算提取率進行比較，提取結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對火龍果皮總黃酮提取率的影響

由圖2可知，在實驗料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，提取率越高，但當(dāng)溶劑量達到能將黃酮基本溶出時，再增加溶劑將不會使提取率提高，并且溶劑用量過大也會給后續(xù)的濃縮等操作帶來不便?；瘕埞た傸S酮提取率在料液比為1∶40時達到最大值(6.262mg/g)，而后減小。綜合考慮，確定為1∶40的料液比為佳。

2.2.2 提取溫度對提取率的影響 稱取6份樣品，按料液比1∶40，乙醇濃度70%，分別在50、60、70、80、90、100℃恒溫水浴鍋中水浴浸提1h，提取液離心后取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸光度，計算提取率進行比較，提取結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對火龍果皮總黃酮提取率的影響

由圖3看出，隨著提取溫度的升高，火龍果皮總黃酮提取率也隨之增加，在80℃時提取率達到最大值(6.678mg/g)。但當(dāng)提取溫度超過80℃后，提取率開始下降，這可能是因為過高的溫度導(dǎo)致了黃酮類化合物的理化性質(zhì)發(fā)生了一定的改變，同時乙醇揮發(fā)嚴重。綜合考慮，提取溫度以80℃為宜。

2.2.3 乙醇濃度對提取率的影響 稱取6份樣品，按料液比1∶40，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%，在70℃恒溫水浴鍋中水浴浸提1h，提取液離心后取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸光度，計算提取率進行比較，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度對火龍果皮總黃酮提取率的影響

從圖4中可以看出，在乙醇濃度較低時，火龍果皮總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而提高，當(dāng)乙醇濃度達到80%時，提取率達到最高(6.457mg/ g)。隨后，提取率隨乙醇濃度的增加而降低，這可能是因為高濃度的乙醇使更多的雜質(zhì)溶出，從而導(dǎo)致黃酮類化合物的溶解量減少。因此提取火龍果皮總黃酮，選擇乙醇濃度80%為宜。

2.2.4 浸提時間對提取率的影響 稱取5份樣品，按料液比1∶40，乙醇濃度70%，分別在70℃恒溫水浴鍋中水浴浸提0.5、1、1.5、2、2.5h，提取液離心后取上清液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定吸光度，計算提取率進行比較，結(jié)果見圖5。

圖5 浸提時間對火龍果皮總黃酮提取率的影響

由圖5可知，火龍果皮總黃酮提取率隨時間的增加而降低，在1h時提取率有最大值(6.204mg/g)，在基本達到滲透平衡后，時間繼續(xù)增加提取率反而有所下降。因此，提取火龍果皮總黃酮，選擇浸提時間1h為宜。

2.3 正交實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取溫度、料液比和浸提時間4種因素依照表1設(shè)計L9(34)正交實驗，確定9組不同的實驗組合，分別得到火龍果皮中總黃酮的提取率，見表2。

從表2中極差數(shù)據(jù)R可知，乙醇濃度、提取溫度、料液比和浸提時間這4種因素對火龍果皮總黃酮得率影響主次順序為:乙醇濃度＞提取溫度＞浸提時間＞料液比，最佳提取條件為:乙醇濃度80%，浸提時間0.5h，提取溫度 80℃，料液比 1∶30，即A2B3C1D1。按正交實驗所得最佳工藝條件平行實驗5份，經(jīng)計算，總黃酮平均提取率為6.611mg/g，RSD =4.536%，重復(fù)性好。根據(jù)正交實驗得出的最佳提取工藝條件，提取兩次，由火龍果皮干粉得到棕色粉末狀固體，其中總黃酮的提取率為10.9mg/g。

表2 正交實驗結(jié)果

2.4 火龍果皮總黃酮體外抗氧化功能實驗采用鄰苯三酚自氧化法、鄰二氮菲法和鐵氰化鉀還原法分別測定對超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(·OH)的清除作用和還原能力，并與同等條件下的VC、BHT的抗氧化能力進行比較。

2.4.1 清除超氧陰離子自由基(O2-·)能力測定 該體系中鄰苯三酚在堿性條件下自氧化形成中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基，此自由基能促進鄰苯三酚的自氧化，因此通過測定某物質(zhì)對鄰苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其對超氧陰離子自由基的清除作用。

由圖6可知，在0.1～0.6mg/mL范圍內(nèi)，火龍果皮總黃酮對超氧陰離子的清除率有較好的量效關(guān)系。對其曲線進行擬合得方程:Y=11.032x-5.322，R2= 0.9884，相關(guān)性好，根據(jù)擬合方程求出火龍果皮總黃酮清除率為50%所需的樣品濃度［16］，即為 IC50= 0.5176mg/mL。VC的回歸方程分別是Y=-332.52x2+398.96x-21.39，計算出IC50=0.2191;BHT擬合方程為:Y=14.65x-4.2393，計算得IC50=0.3235mg/mL，可以得出三者對超氧陰離子自由基的清除能力為:火龍果皮總黃酮清除能力弱于VC和BHT，0.5 mg/mL火龍果皮總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力與0.4mg/mL BHT相當(dāng)，與0.2mg/mL VC相當(dāng)。

圖6 火龍果皮總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用

2.4.2 清除羥基自由基(·OH)能力測定 ·OH是人體生命活動中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的自由基。實驗利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH來檢測火龍果皮總黃酮清除·OH的能力。

在Feton體系中，火龍果皮總黃酮、VC、BHT對·OH均有較強的清除能力，且隨著濃度增加而增加?；瘕埞た傸S酮濃度與清除率擬合得方程:y= 14.45x-3.804，R2=0.9946，計算得IC50=0.2979mg/mL; BHT的擬合方程得:y=900.14x2+51.63x+1.961，計算得IC50=0.2041mg/mL，VC擬合方程為:y=10.141x -5.4687，計算得IC50=0.5885mg/mL。比較三者對羥自由基的清除能力為:火龍果皮總黃酮弱于BHT，但是強于VC，即VC＜PPF＜BHT。

圖7 火龍果皮總黃酮對羥自由基的清除作用

2.4.3 還原能力測定 由圖8的結(jié)果可以看出，火龍果皮總黃酮的還原能力很強，在實驗濃度范圍內(nèi)，火龍果皮總黃酮的還原能力隨著濃度的增加而增強。經(jīng)過SPSS分析，PPF的還原能力與濃度呈直線相關(guān)，回歸方程為Y=6.5715x+0.0769，R2=0.9327，BHT的還原能力與濃度呈直線相關(guān)，回歸方程為y= 12.104x-0.0132，R2=0.9927?；瘕埞た傸S酮的還原能力與VC相當(dāng)，但是明顯弱于BHT。

圖8 火龍果皮總黃酮的還原能力

3 結(jié)論

3.1 以火龍果皮為原料，用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮結(jié)果穩(wěn)定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品時，在0～0.4mg/mL濃度范圍內(nèi)線性較好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=11.039X-0.001，其R2值為0.9997。

3.2 采用乙醇浸提法建立了提取火龍果皮總黃酮的最佳工藝參數(shù)為:乙醇濃度80%，浸提時間0.5h，提取溫度80℃，料液比1∶30，在最佳提取工藝條件下，火龍果果皮干粉中總黃酮的提取率為6.611mg/g，提取兩次，總黃酮提取率為10.9mg/g。

3.3 火龍果皮總黃酮對超氧陰離子和羥自由基均具有一定的清除作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的O2-·的清除能力弱于BHT和VC;對·OH的清除能力弱于BHT強于VC。在還原能力體系中，火龍果皮總黃酮的還原能力與VC相當(dāng)，但弱于BHT，這可能與火龍果皮中黃酮的結(jié)構(gòu)和類型有關(guān)［13］，有待于進一步研究。

本實驗結(jié)果說明來自火龍果皮的黃酮將有很大的潛力作為天然抗氧化劑的物質(zhì)資源，該實驗結(jié)果對進一步推動火龍果食品的深加工改造，提高產(chǎn)品的附加經(jīng)濟值，推動當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展有促進作用。

［1］Florian C Stintzing，Andreas Schieber，Reinhold Carle. Betacyanins in fruitsfrom red-purple pitaya，Hylocereus polyrhizus(Weber)Britton＆Rose［J］.Food Chemistry，2002，77: 101-106.

［2］戴文娟，郭璇華.孔樹脂吸附純化火龍果莖黃酮類化合物的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(11):65-67.

［3］于晶，郝再彬，蒼晶，等.黃酮類化合物的活性研究進展［J］，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，39(12):125-130.

［4］索金玲，彭秧，張縱元，等.石榴葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究［J］.生物技術(shù)，2009，19(1):63-65.

［5］張志信，宋關(guān)斌，張仕秀.正交實驗法優(yōu)選三七莖葉中總黃酮的提取工藝［J］.生物技術(shù)，2006，16(5):65-67.

［6］何改.山楂葉黃酮類化合物最佳提取工藝研究［J］.食品研究與開發(fā)，2002，23(1):15-17.

［7］魯曉翔，唐津忠.背天葵中總黃酮的提取及其抗氧化性研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(4):145-148.

［8］韓少華，朱靖博，王妍妍.鄰苯三酚自氧化法測定抗氧化活性的方法研究［J］.中國釀造，2009(6):156-157.

［9］莫開菊，柳圣，程超.生姜黃酮的抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(9):110-115.

［10］Yen Gow Chin，Duh Pin Der，Tsai Hui Ling.Antioxidant and Pro-Oxidant Properties of AscorbicAcid and Gallic Acid［J］. Food Chemistry，2002，79(3):307-313.

［11］Dejian H，Boxin Ou，Ronald L.The chemistry behind antioxidant capacity assay［J］.Food Chemistry，2005，53(6):1841 -1856.

［12］王靜，劉大川.紫(白)蘇葉黃酮類化合物抗氧化性能的研究［J］.中國油脂，2004，29(3):33-36.

［13］蔣柳云，劉玉明.黃酮類化合物抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16(4):510-512.

Study on extraction and antioxidative activity of flavonoids in the peel of pitaya

WANG Xiao-bo，HE Xiao-yan，WANG Mei，LIU Dong-ying，CHEN Hai-zhen
(School of Public Health，Guangdong Pharmacy College，Guangzhou 510310，China)

Objective:To provide the theoretical basis for the development and utilization of flavonoids from the peel of pitaya(PPF).Method:Using ethanol as the extraction solvent，crude flavonoids was extracted.The optimum extraction conditions of total flavonoids were determined by single factor experiments and orthogonal test，the antioxidation activity of flavonoids of peel of pitaya was investigated through comparing the eliminating effect to the free-radical of VCand BHT in vitro.Result:Optimum extraction conditions were as follows:the ethanol concentration was 80%，the extraction liquid-material ratio was 1∶30，the extraction temperature was 80℃and the extraction time was 0.5h.Under optimum extraction conditions for twice extraction，the yield rates of the total extraction rates of flavonoids in the dry powder of the peel of hylocereus andatus were 10.9 mg/g.Results:The flavonoids extracted from the peel of pitaya had strong scavenging ability on removing superoxide radicals and hydroxyl radicals，and strong reducing power at the same conditions.Conclusion:Flavonoids of the peel of pitaya had strong antioxidative capabilities in vitro and had potential as a natural antioxidant.

peel of pitaya;total flavonoids;extraction;antioxidative activity in vitro

TS255.1

A

1002-0306(2011)11-0156-05

火龍果(Pitaya)又稱為紅龍果，為仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬植物。果皮顏色為紫紅色，艷麗迷人，而果肉顏色有白、黃、紅等幾個不同品種?；瘕埞谖覈_灣栽培較多，已有十多年的歷史，目前已在海南、廣西、廣東、福建等省區(qū)興起，是熱帶、亞熱帶的名優(yōu)水果之一，火龍果具有非常高的營養(yǎng)價值，含有豐富的花青苷、植物白蛋白、VC及膳食纖維，已經(jīng)成為優(yōu)良的綠色保健食品［1］。目前，關(guān)于火龍果的研究主要集中在果實、果皮中色素、果膠的研究，還未見關(guān)于果皮中黃酮類生物活性物質(zhì)研究。作為水果食用時，火龍果的皮經(jīng)常當(dāng)做廢物被拋棄掉，而有報道稱，采用大孔樹脂可以從火龍果果頸中分離純化出黃酮［2］。黃酮是廣泛存在于植物的葉、花、果中的天然色素，是植物次級代謝產(chǎn)物。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、防癌抗癌、調(diào)節(jié)免疫及中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑［3］等諸多藥理作用及功效。此外，黃酮類化合物的抗氧化功能與其他外源性抗氧化劑相比，具有無毒、安全和來源廣等特點，作為抗氧化劑還被廣泛應(yīng)用于食品加工中。目前從植物中篩選出高效低毒且經(jīng)濟的抗氧化性強的天然抗氧化物質(zhì)成為現(xiàn)代食品加工、藥品、保健品的研究重點。本文擬以火龍果的廢棄物果皮為原料，探討其中黃酮提取的優(yōu)化工藝方法，并用清除自由基和還原能力評價火龍果皮總黃酮的抗氧化能力，以期開發(fā)一種新的天然抗氧化劑，為火龍果的合理綜合利用和開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

2010-05-14

王曉波(1961-)，女，碩士，教授，研究方向:食物營養(yǎng)與功效成份。