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    抗生素微生物檢定二劑量管碟法常用菌種培養(yǎng)的研究

    2011-11-03 05:53:02北京市豐臺區(qū)藥品檢驗所100071李婧杜娟陳征
    首都食品與醫(yī)藥 2011年14期
    關鍵詞:科氏菌液芽孢

    北京市豐臺區(qū)藥品檢驗所(100071) 李婧 杜娟 陳征

    中國是抗生素使用大國,也是抗生素生產(chǎn)大國。

    1 抗生素微生物檢定法的概述

    抗生素是微生物在代謝中產(chǎn)生的具有抑制它種微生物生長活動、甚至殺滅它種微生物的化學物質(zhì)??股匚⑸餀z定法是測定抗生素效價的基本方法。是在適宜的條件下,根據(jù)量反應平行線原理設計,通過檢測抗生素對微生物的抑制作用,計算抗生素活性(效價)的方法。藥典中規(guī)定的抗生素微生物檢定包括兩種方法,管碟法和濁度法。其中,管碟法是目前使用較多的方法。

    管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用,比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產(chǎn)生抑菌圈的大小,以測定供試品效價的一種方法。管碟法分為二劑量法和三劑量法。二劑量法是目前使用較多的方法。對于二劑量管碟法的準確性很重要的一個影響因素就是實驗菌,本文對實驗菌種的培養(yǎng)進行討論。

    2 二劑量法管碟法操作步驟

    2.1 菌種培養(yǎng)基本操作

    2.1.1 菌種凍干粉的復狀 取凍干粉一支,加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基約0.5ml,將菌粉溶解后,轉(zhuǎn)移至9ml肉湯培養(yǎng)基中,用刻度管吹洗數(shù)次后,放入培養(yǎng)箱中,在各菌種相應的溫度下培養(yǎng) 20~24小時。為保證菌種的質(zhì)量,營養(yǎng)肉湯菌液需在24小時內(nèi)使用。

    2.1.2 菌種傳代 用接種環(huán)蘸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基一環(huán),在營養(yǎng)瓊脂斜面上均勻劃“之”字,然后放入培養(yǎng)箱中,在各菌種相應的溫度下培養(yǎng) 20小時~24小時。菌種斜面需每月傳代一次,以保證菌種的良好狀態(tài)。

    2.1.3 科氏瓶培養(yǎng) 使用芽孢的菌種,需要進行長時間培養(yǎng),且芽孢菌液可以保存較長時間,所以可以采用科氏瓶培養(yǎng),以便得到更多高濃度的菌液。

    根據(jù)菌種斜面的成長狀況,選取生長狀態(tài)較好的3~5支,每支斜面分別用約1ml滅菌水將菌苔洗下,并轉(zhuǎn)移至同一個營養(yǎng)瓊脂科氏瓶中,然后放入培養(yǎng)箱中,在各菌種相應的溫度下培養(yǎng)7天。

    在進行科氏瓶培養(yǎng)時,科氏瓶中培養(yǎng)基應向上放置,并墊高瓶口使科氏瓶稍稍傾斜,使多余的水沉至瓶底,防止水分過多影響菌種的生長。

    2.1.4 菌液的制備 向培養(yǎng)好的斜面或科氏瓶中加入1~10ml滅菌水(或生理鹽水),將菌層洗下,轉(zhuǎn)移至經(jīng)過滅菌處理的試管中,使用芽孢的菌種需要在70℃水浴中保溫30分鐘進行滅活后備用。

    2.1.5 抗生素微生物檢定法常用菌種的培養(yǎng)條件 見附表。

    2.2 菌種涂片的制備方法

    2.2.1 涂片 涂片的整個操作過程需在酒精燈無菌圈內(nèi)進行。首先點燃酒精燈,將接種環(huán)在酒精燈外焰下充分加熱滅菌,放涼,蘸取滅菌過的生理鹽水一環(huán)置一張經(jīng)滅菌的顯微載玻片上。再將接種環(huán)用酒精燈外焰加熱滅菌后,放涼,蘸取搖勻的菌液一環(huán),涂置上述載玻片上的生理鹽水上,使菌液稀釋并涂抹均勻。然后將涂抹均勻的菌液時時置酒精燈火焰上加熱,是菌液蛋白質(zhì)凝固,待菌液干燥凝固之后涂片即制作完成。

    2.2.2 染色 ①結晶紫染色。在片子上的菌膜處滴一滴結晶紫染色液,計時放置一分鐘,使染色液充分染色。②沖洗。待一分鐘計時結束,用純化水沖掉染色液。沖洗時注意,將涂片傾斜,自上而下沖洗。不能直接沖菌膜,否則可能導致菌膜固定不牢被沖掉。沖掉染色液后將片子晾干再進行下一步操作。③復染。在片子的菌膜處滴加一滴革蘭氏碘液,計時放置一分鐘,目的在于固定蛋白質(zhì)與結晶紫的結合。④沖洗。待一分鐘結束后及時用純化水沖洗掉復染液,并晾干。方法同第二步。⑤脫色。在片子的菌膜處滴加酒精一滴,環(huán)東片子,使染色劑顏色脫落。一般脫色進行30秒即可,也可根據(jù)脫色的情況而定,至洗脫染色液的顏色,但時間不宜太長。⑥沖洗。待一分鐘及時結束后用純化水沖洗掉復染液,并晾干。方法同第二步。

    2.2.3 常用菌種的形態(tài) 包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌。見附圖1,2,3,4,5。

    附表 抗生素微生物檢定法常用菌種的培養(yǎng)條件

    2.3 雙碟的制備 取直徑約90mm、高16~17mm的平底雙碟,分別注入各品種抗生素標準規(guī)定項下經(jīng)過滅菌處理的熱培養(yǎng)基20ml,使其在碟底均勻攤布,將加好培養(yǎng)基的碟子放置在事先調(diào)整水平的實驗臺上,使碟內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻凝固并保持水平。另取相應經(jīng)過滅菌處理的熱培養(yǎng)基適量,用水浴放冷至適當溫度,然后加入相應的試驗菌,加菌量需要經(jīng)過預實驗,使標準品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18~22mm,搖勻后,在每一個鋪好底層的碟子中加入5ml的帶菌培養(yǎng)基,使其均勻攤布,放置在水平臺上,冷卻使培養(yǎng)基凝固,放置時間應不少于20分鐘。然后在每一雙碟中以等距離均勻放置4個不銹鋼小管,鋼管大小為內(nèi)徑6.0±0.1mm,高10.0±0.1mm,外徑7.8±0.1mm,用陶瓦罐覆蓋備用。

    2.4 標準品溶液和供試品溶液的制備 按照各品種抗生素標準規(guī)定,配制標準品和供試品溶液,使其濃度為1000單位/ml,然后按照《中國藥典》規(guī)定的各品種抗生素使用的緩沖液,將標準品和供試品溶液分步稀釋至合適的兩個濃度,高、低濃度的比例為2:1或4:1[1]。

    2.5 滴加樣品 配制好合適濃度的供試品和標準品溶液后,按照SH、TH、TL、SL的順序,向制備好的雙碟中加入供試品溶液和標準品溶液,每批樣品的雙碟數(shù)量至少為4個。最后放入培養(yǎng)箱中,在合適的溫度下培養(yǎng)。

    2.6 結果判定 雙碟經(jīng)過適宜的培養(yǎng)后,會產(chǎn)生4個抑菌圈,根據(jù)準品和供試品溶液產(chǎn)生抑菌圈的大小,可計算得出供試品的效價。為保證結果的準確可靠,要對參與計算的所有碟子進行統(tǒng)計學顯著性測驗和可信限的計算,在P>0.05,可信限率不大于5%的情況下,實驗結果才是有效的。

    3 菌種對抗生素微生物檢定結果的影響

    附圖1 枯草芽孢桿菌

    附圖2 短小芽孢桿菌

    在抗生素微生物檢定法的結果判定中,最主要的數(shù)據(jù)是抑菌圈的大小。影響抑菌圈大小的因素有很多,如抗生素的濃度,抗生素對試驗菌的敏感程度,培養(yǎng)時間,培養(yǎng)溫度,菌種的生長活力,菌液濃度等。諸多因素中,菌種的影響是比較大的。菌種的形態(tài)和活性,菌齡、菌液的濃度等都會對實驗結果產(chǎn)生影響。所以菌種培養(yǎng)的每一步都是實驗的關鍵,為保證實驗菌的狀態(tài)良好,還應做涂片,在顯微鏡下觀察菌種形態(tài)。

    3.1 菌種形態(tài)、活力和菌齡的影響 ①菌種的形態(tài)不典型、活力不強或者菌齡過大會直接影響到抑菌圈的形態(tài)。②菌種的形態(tài)不佳,與典型菌種形態(tài)差異較大,或菌種活力不強,在培養(yǎng)基上生長稀疏。制成菌液后可能會造成對抗生素活力不夠,長出過大的抑菌圈,也可能會造成菌對抗生素不敏感,長出過小、甚至長不出抑菌圈。③菌齡過大就會使菌液中的代數(shù)過多,由于每代菌的活力不同,新生菌活力強,老代的菌相對活力較弱,在進行抗生素微生物檢定法時會長出雙圈或者抑菌圈的邊緣不清晰,這種情況下不能應用儀器測量。

    3.2 菌液濃度的影響 菌液的濃度在《中國藥典》上有具體的規(guī)定,這是因為不同種類的抗生素對敏感菌的抑菌效力是不同的。同樣濃度的菌液,加入這種抗生素中能長出大小合適的圈,但是換另一種抗生素可能就不能長出大小適宜,甚至不能長出抑菌圈。所以,菌液的濃度是靠檢驗員在每次正式實驗之前通過預試,測定幾種不同濃度的菌液,通過預試結果總結出的一個最合適的濃度,因此,在此不能一概而論。

    附圖3 金黃色葡萄球菌

    附圖4 藤黃微球菌

    附圖5 肺炎克雷伯菌

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