芫花根總黃酮抗腫瘤活性的研究

黑龍江省中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（150040）姚晶萍

黑龍江省哈爾濱市社會保險局醫(yī)院（150030）倪延群

黑龍江省中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院（150040）王瑩威 張潔玉 吳效科

芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc.為瑞香科植物。廣泛分布于我國長江流域各省和黃河流域的部分地區(qū)。芫花的葉、花及根均為傳統(tǒng)中藥。芫花根在民間曾被用來治療多種癌腫，療效顯著。芫花根還可以治療腹水、急性乳腺炎等。化學成分研究表明，芫花根主要含有黃酮、香豆素和萜類化合物。芫花根總黃酮 (TFRD)主要由瑞香素系列的雙黃酮組成，毛瑞香素是其主要成分，含量為42 .79%[1]。本研究探討TFRD抗腫瘤活性、其對不同腫瘤及裸鼠種植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株 BALB/c（nu/nu）裸小鼠，4周齡，雌性，體重 18～20g；C57BL/6小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)潔凈層流架內（SPF級），飲用酸水（pH3～4），進食添加復合維生素B的標準飼料。飼料、墊料及其他裸鼠接觸物品均經高壓滅菌。室內每日保持10h光照，14h無光的明暗周期，定期紫外線照射和高壓滅菌消毒。室溫控制在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。Hela、Walk-250、MCF-7、HA-116、K293-T細胞、人卵巢癌HO8910細胞株由哈醫(yī)大三院腫瘤研究所惠贈。細胞置于含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、谷氨酰胺30μg/ml），放入37℃、5% CO2孵箱，按常規(guī)方法培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于試驗。

1.2 藥品及試劑 胎牛血清（美國Sigma公司）；氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：031106）；二甲基亞砜（DMSO）、刀豆蛋白（ConA）、脂多糖（LPS）、MTT以及臺盼藍（均為美國 Sigma公司）；RMP I-1640與DMEM/f-12培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；淋巴分離液TBD （中國醫(yī)學科學院生物工程研究所）；其余試劑為國產分析純；96孔細胞培養(yǎng)板以及細胞培養(yǎng)瓶（美國Sigma公司）。

1.3 芫花根總黃酮的制備 取芫花根2kg粉碎，以無水乙醇（固液比1∶4）60℃浸提24h，浸提液離心除渣，上清液合并濃縮得粗浸膏，粗浸膏過ADS217大孔樹脂，以去離子水洗滌除去水溶性雜質，再以無水乙醇洗脫得黃色乙醇洗脫液，減壓蒸餾后過200～300目硅膠柱，氯仿-甲醇（1∶1）洗脫物經濃縮即得芫花根總黃酮（TFRD）239g，得率11.95%。TFRD經吐溫 280乳化，以氯化鈉注射液配制成濃度確定的乳液，備用。

1.4 細胞毒活性實驗 定量稱取TFRD、DMSO溶解后以DMEM/f-12基本培養(yǎng)基稀釋成6個不同濃度梯度，加入預先培養(yǎng)24h的Hela、Walk-250、MCF-7、HA-116、K2932 T細胞株、人卵巢癌HO8910細胞的96孔培養(yǎng)板中，每個濃度梯度重復5次。繼續(xù)在37℃，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。MTT法測定 TFRD對腫瘤細胞以及K293-T細胞的毒性。

1.5 抗實體瘤活性實驗 取BALB/c（nu/nu）裸小鼠120只，隨機分為12組，每組10只，雌雄各半。人卵巢漿液性上皮癌細胞株HO8910按每鼠5×107個細胞接入小鼠的后肢腋下。TFRD乳液按30mg?kg-1、55mg?kg-1、85mg?kg-13個劑量對小鼠灌胃給藥。其中3組在腫瘤接種前3d給藥，3組在腫瘤接種的同時給藥，3組在腫瘤接種3d后給藥，1次/d，連續(xù)灌胃14d。另設正常對照組每天灌胃等體積的生理氯化鈉溶液；模型組，與腫瘤接種的同時灌胃等體積的生理氯化鈉溶液；陽性對照組，與腫瘤接種的同時按30mg?kg-1灌胃氟尿嘧啶。每天記錄小鼠體重，并在接入腫瘤的第7天開始用游標卡尺量取腫瘤體積，每2d測量1次。根據(jù)公式：腫瘤體積=長×寬2/2計算瘤體積[2]，末次給藥24h后，先眼眶取血0.5ml，制備淋巴細胞懸液，臺盼藍染色，用血球計數(shù)板統(tǒng)計活性細胞數(shù)。然后處死小鼠，取腫瘤稱重，按公式：抑瘤率（%）=（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%

同時取胸腺、脾臟，計算胸腺指數(shù)與脾指數(shù)。

1.6 荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖實驗 無菌制備上述條件處理的小鼠脾淋巴細胞,經臺盼藍染色檢測細胞活力>95%，用適量完全培養(yǎng)基RMPI-1640調整細胞濃度為1×106個/ml，加入96孔板，每孔100μl。將各處理組小鼠脾淋巴細胞分為3組，其中2組分別加入ConA，使其終濃度為5μg?ml-1，或加入LPS，使其終濃度為10μg?ml-1。另一組作為平行對照，不加Con A或LPS。每組設5個重復孔。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，MTT法測定570nm處A值。淋巴細胞增殖能力以刺激指數(shù)（Stimulation Index，SI）表示，即SI =ACon /A或ALPS /A[2]。

1.7 荷瘤小鼠NK細胞的殺傷活性實驗 同上無菌制備上述各種處理的小鼠脾淋巴細胞作為效應細胞，用完全培養(yǎng)基RPMI-1640調整細胞濃度為5×106ml-1，加入96孔板，每孔100μl。另取Hela細胞作靶細胞，用完全RPM I-1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×105ml-1，加入含有小鼠脾淋巴細胞的96孔板中，每孔100μl。同時設效應細胞對照組(淋巴細胞200μl)與靶細胞對照組(Hela細胞200μl)。在37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。MTT法測定570nm處A值。根據(jù)公式[3]計算NK細胞的殺傷活性：

NK細胞殺傷率(%) = 1- (實驗組A值-效應細胞對照組A值)/靶細胞對照組A值×100%

1.8 荷瘤小鼠脾淋巴細胞分泌白介素-2 （IL-2）取BALB/c（nu/nu）裸小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組，每組10只。人卵巢癌HO8910細胞按每鼠5×107個細胞接入小鼠的后肢腋下。接種后24h開始灌胃，其中3組按30 mg?kg-1、55 mg?kg-1、85mg?kg-1個劑量對小鼠灌胃TFRD乳液。一組為模型組，灌胃等體積的生理氯化鈉溶液；一組為陽性對照組，灌胃30mg?kg-1氟尿嘧啶；另設正常對照組，灌胃等體積的生理氯化鈉溶液，灌胃14d。最后一次灌胃24h后處死小鼠，無菌制備脾淋巴細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，含有淋巴細胞5×106個，每孔加入終濃度為5μg?ml-1ConA溶液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，離心，吸取上清液即為IL-2的待測品。另取C57BL /6小鼠（20±2）g 6只，眼球放血處死，無菌制備小鼠胸腺細胞懸液加入96孔板中，每孔100μl，含胸腺細胞1×106個。將上述IL-2樣品分別加入培養(yǎng)板中，每孔50μl，然后每孔加入終濃度為1μg?ml-1ConA溶液，另設Co2nA對照孔，參照文獻[4]方法測定IL-2的活性。

1.9 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行t檢驗，統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用x±s表示。

2 結果

2.1 對細胞毒活性的影響 TFRD對實驗腫瘤細胞和K2932T細胞表現(xiàn)出不同的細胞毒活性。在設定的5個濃度中，TFRD對Hela細胞、人卵巢癌HO8910細胞顯示出顯著的細胞毒活性。在濃度為0.125mg?ml-1時，對這兩個腫瘤細胞的抑制率分別達到65.95%和45.43%。對Walk2250、MCF27和HA-116細胞也表現(xiàn)出較強的細胞毒活性，在濃度為0.25mg?ml-1時對這3 個腫瘤細胞的抑制率分別為36.83%、43.19%和39.06%。與之對比，TFRD對K293-T細胞則表現(xiàn)出較低的細胞毒活性。在同等劑量下，抑制率僅為腫瘤細胞的1/2～1/10，見附表1。

2.2 對人卵巢癌HO8910細胞瘤生長的抑制作用 3個劑量的TFRD對人卵巢癌HO8910細胞瘤均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，并隨給藥時間的延長和給藥劑量的增加而呈增強的趨勢。3種不同時間給藥對人卵巢癌HO8910細胞瘤的生長的抑制作用略有差異。接種腫瘤前3d預給藥或后3d給藥，3個劑量組對卵巢癌腫瘤的生長均表現(xiàn)出顯著的抑制作用,與接種腫瘤同時給藥的中劑量（50mg?kg-1）組也顯示出較強的抑制作用。腫瘤接種前3d或腫瘤接種后3d給藥的3個劑量組以及與腫瘤接種同時給藥的中劑量(50mg?kg-1)組對人卵巢癌HO8910細胞瘤生長的抑制作用均明顯地高于陽性對照組，見附表2。

附表1 TFRD對腫瘤細胞和K2932T細胞生長抑制率(±s，n =5)

附表1 TFRD對腫瘤細胞和K2932T細胞生長抑制率(±s，n =5)

注：與TFRD對K293-T細胞的抑制率比較，bP<0.05，cP<0.01

組別 抑制率（%）0.625 0.125 0.25 0.5 1（mg?ml-1）K293-T 2.43±0.23 8.90±1.04 20.68±3.06 27.92±2.65 29.03±3.61 Hela 27.38±1.53c 66.42±5.67c 71.12±5.86c 77.7±5.32c 84.05±7. 21c HO8910 16.21±1.73b 45.39±4.04c 61.13±6.08c 60.18±4.93c 79.04±8.19c Walk-250 16.20±2.61b 19.43±2.65b 37.32±3.21c 38.32±3.21c 56.10±5.21c MCF-7 6.92±1.08b 23.51±2.65b 42.29±3.80c 9.51±5.54b 53.94±4.93c HA-116 30.45±2.89c 6.35±3.79b 38.96±3.79c 43.62±4.93b 49.83±5.15c

附表2 TFRD對HO8190腫瘤細胞生長抑制作用(x±s，n =10)

附表3 對小鼠體重免疫器官及血液中淋巴細胞細胞數(shù)的影響以及對腫瘤的抑制率(x±s，n=10)

附表4 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖的影響(x±s，n =10)

2.3 對荷瘤小鼠體重免疫器官血液淋巴細胞數(shù)量的影響和對腫瘤的抑制作用 實驗結果表明,荷瘤小鼠體重增長明顯低于正常小鼠(P<0.05) 。TFRD在腫瘤接種同時給藥或提前3d給藥，則使荷瘤小鼠體重恢復至正常水平以上。腫瘤接種3d后給藥小鼠只有低劑量組小鼠體重恢復正常水平,中高劑量組小鼠體重則低于對照組。荷瘤小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著低于正常小鼠(P<0.05，P<0.01) 。TFRD 3種不同給藥時間給藥可使荷瘤小鼠脾指數(shù)恢復正常水平。與接種腫瘤同時給藥的3個劑量組、提前3d給藥的高劑量組和腫瘤接種3d后給藥的中劑量組可使荷瘤小鼠胸腺指數(shù)恢復至正常水平。荷瘤小鼠淋巴細胞數(shù)量顯著減少(P<0.01) 。與腫瘤接種同時給藥的TFRD可使小鼠血液淋巴細胞數(shù)量恢復至正常水平,提前3d給藥或接種3d后給藥的小鼠血液淋巴細胞數(shù)量顯著高于陽性對照組小鼠。3種不同時間給藥對實驗腫瘤的抑制率均在44.5%以上。其中，提前3d給藥和接種后3d給藥的TFRD對腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)出一定的量效關系。與腫瘤接種同時給藥或提前3d給藥的3個劑量組，以及腫瘤接種后給藥的中高劑量組對實驗腫瘤的抑制作用均顯著地高于陽性對照，見附表3。

2.4 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖的影響 實驗結果顯示，荷瘤小鼠脾淋巴細胞對ConA引起的增殖反應略低于正常小鼠，而對LPS引起的增殖反應則明顯低于正常小鼠。TFRD預給藥的荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖反應顯著地高于陽性對照組小鼠，其中中劑量組可使荷瘤小鼠的脾淋巴細胞增殖反應水平超過正常小鼠。與腫瘤接種的同時給藥或接種3d后給藥的荷瘤小鼠脾淋巴細胞增殖隨劑量的增加呈上升趨勢。其中經中高劑量組處理的荷瘤小鼠淋巴細胞增殖水平高于正常小鼠，見附表4。

2.5 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2的影響 與正常對照組相比，荷瘤小鼠脾淋巴細胞分泌IL-2的水平有所下降(P<0.05)。與模型組相比，TFRD的3個劑量對荷瘤小鼠脾淋巴細胞產生IL-2水平有明顯的促進作用，隨著劑量的增加而作用逐漸增強，并且TFRD的中高劑量組顯著(P<0.05)高于陽性對照氟尿嘧啶組，見附圖2。

3 討論

從TFRD組成來看，毛瑞香素B為主要成分，占總黃酮的42.79%；其次為毛瑞香素G和H。而芫花素和芫根苷等單黃酮僅占很小的比例。研究表明，毛瑞香素B是腫瘤細胞有絲分裂的抑制劑[5]。從結構上看，毛瑞香素B與G、H以及芫花醇A等雙黃酮具有十分相似的分子骨架和官能團，因而這些化合物也可能具有抗腫瘤活性。實驗結果表明，TFRD對人卵巢癌HO8910細胞的生長有顯著的抑制作用。3種不同給藥時間對小鼠腫瘤的抑制作用無顯著差異。但就腫瘤體積而言，預給藥組小鼠腫瘤增長的速度明顯小于與接種腫瘤同時給藥組小鼠。值得指出的是，TFRD在接種腫瘤7d后，給藥對腫瘤的生長仍然有顯著的抑制作用。體外實驗表明，TFRD對Hela、HO8910、Walk-250、MFC-7和HA-116有顯著的抑制作用，而對K293-T細胞生長的抑制作用相對較弱。說明TFRD對腫瘤細胞具有一定的選擇性，具有潛在的抗腫瘤活性。

淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，直接參與腫瘤免疫[6]。荷瘤小鼠的淋巴細胞由于受到腫瘤細胞的誘導而逐漸凋亡[7]，同時胸腺與脾臟開始萎縮,血液淋巴細胞數(shù)量大大減少。脾臟和胸腺是淋巴細胞成熟的重要場所，這兩個免疫器官的萎縮是導致淋巴細胞數(shù)量減少的重要原因。ConA主要是引起T淋巴細胞增殖，LPS主要引起B(yǎng)淋巴細胞增殖。TFRD能顯著提高荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，這說明TFRD的抗腫瘤活性可能是通過促進荷瘤小鼠胸腺與脾臟的發(fā)育，從而增加淋巴細胞增殖來實現(xiàn)的[8～10]。

NK細胞是細胞免疫中的非特異性細胞，是機體免疫監(jiān)視功能的重要執(zhí)行者，先于T細胞發(fā)揮作用，能非特異性殺傷腫瘤細胞，其殺傷作用毋需抗原預先致敏，也不需要抗體參加，不受MHC限制，為機體抗腫瘤的第一道防線[11]。TFRD能顯著提高荷瘤小鼠NK細胞的殺傷活性。

附圖1 NK 細胞殺傷率比較

附圖2 對荷瘤小鼠脾淋巴細胞產生IL-2水平的影響(A570，x±s，n =10)

TFRD對荷瘤小鼠脾淋巴細胞產生IL-2水平有明顯的促進作用，并隨著劑量的增加，作用逐漸增強。IL-2是刺激T淋巴細胞由細胞周期的G 1 期 向S 期 過 渡 的 主要調節(jié)因子，這說明TFRD是通過IL-2來間接的調控T淋巴細胞，促進T淋巴細胞增殖。

綜上所述，TFRD對小鼠和人卵巢癌HO8910細胞的生長有顯著的抑制作用，其抗腫瘤活性是通過選擇性殺死腫瘤細胞和提高外周血淋巴細胞數(shù)量、促進淋巴細胞的增殖和提高NK細胞的殺傷活性來實現(xiàn)的。