3，5-二硝基水楊酸法測定不同高度麥苗中淀粉酶的活性強度*

劉志洋 周心怡 趙景榮 葛安琪 楊志孝

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

研究[1－3]發(fā)現(xiàn)，小麥嫩葉富含麥綠素、天然維生素、礦物質(zhì)及多種氨基酸和酶，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗癌等功效，是一種安全優(yōu)良的天然食品。我國小麥產(chǎn)量和面積僅次于水稻，居第二，北方又是小麥的主產(chǎn)區(qū)，且以冬季小麥為主，冬小麥在入冬以前和初春所發(fā)生的分孽多為無效分孽，因此可利用麥葉資源十分豐富。淀粉酶是催化淀粉水解的一類酶，普遍存在于動植物體內(nèi)。幾乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌發(fā)的禾谷類種子，淀粉酶活性最強，主要是α淀粉酶和β淀粉酶。種子萌發(fā)時，淀粉酶活性隨萌發(fā)時間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類，供幼苗生長[4－5]，本實驗采用3，5-二硝基水楊酸法[6]測定麥苗在不同的生長高度時淀粉酶活性的變化情況，旨在進一步探索開發(fā)小麥這一優(yōu)質(zhì)食物資源，為生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥種(購于市場)，體式蒸汽消毒器(YXQ02型電熱式，山東新華醫(yī)療廠)，凈化工作臺(YJ-875B，蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司)，真空干燥箱(DZF-6210，上海精宏制造廠)，光照培養(yǎng)箱(GZX-400BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制備有限公司)，超聲提取器，電子分析天平(0.1 mg，上海)，S54-紫外分光光度計(上海棱光儀器公司)，加樣器(德國產(chǎn))，高速冷凍離心機(SIGma K30)，3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸鋅均為分析純，實驗用水均為亞沸蒸餾水，Φ=12 cm的培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 麥苗的培植

首先選取12只培養(yǎng)皿，分為兩組，分別編號A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12;分別稱取大小均勻、籽粒飽滿的小麥20 g于培養(yǎng)皿中，加水沒過小麥浸泡4 h后分別覆蓋1.5 cm厚度的細沙放置于光照培養(yǎng)箱中，以溫度為25℃條件下恒溫培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中用自來水噴灑保持濕潤;待A1～A12小麥的嫩苗分別生長高度為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 cm 時剪取收集備用。

1.2.2 試劑的配制

1%淀粉溶液:稱取分析純可溶性淀粉1.00 g，溶于適量的沸水中，冷卻后定容至100 ml。

0.1 mol/L pH 5.6的檸檬酸緩沖液:A 液:稱取檸檬酸20.00 g，溶解后稀釋至1000 ml;B液:稱取檸檬酸鈉29.41 g，溶解后稀釋至1000 ml。取A液55 ml與B液145 ml混勻，即為pH 5.6的緩沖液。

3，5 -二硝基水楊酸溶液:稱取3，5-二硝基水楊酸1.0 g溶于20 ml 2 mol/L氫氧化鈉溶液中，加入50 ml蒸餾水，再加入30 g酒石酸鈉溶解后，用蒸餾水稀釋至100 ml，蓋緊瓶塞密封，勿使二氧化碳進入。

麥芽糖標準液:稱取麥芽糖0.1000 g溶于少量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容，標準濃度為 1.0 mg/ml。

1.2.3 麥芽糖標準曲線制作

取已校正潔凈具塞刻度試管7只，編號后分別加入麥芽糖標準溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml配制標準系列溶液，分別加入3，5-二硝基水楊酸1.0 ml搖勻，置于沸水浴中煮沸5 min，取出用流水冷卻后，加蒸餾水定容至10 ml，標準系列溶液濃度分別為 0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 μg/ml。用6號管標準溶液，在400～700 nm波長范圍進行波長掃描，其最大吸收波長λmax=510 nm。以1號管作為空白調(diào)零點，以510 nm波長分別測定標準系列溶液的吸光度。由計算機自動以麥芽糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線。曲線方程:Cone=94.001×Abs±0.053;相關(guān)系數(shù) r=0.9998。

1.2.4 酶的活性測定

取潔凈的100 ml容量瓶12只，分別稱取A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12 不同高度的麥苗各5 g分別置于研缽中，加蒸餾水12 ml和少量石英砂充分研磨。勻漿轉(zhuǎn)入離心管中。以5000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，同法進行第2次處理，最后用亞沸蒸餾水定容至50 ml，即得麥苗淀粉酶待測液，麥苗濃度均為 0.1 g/ml。

準備12支潔凈的20 ml的刻度試管分別編號1～12號，分別移取A1～A12麥苗待測液各0.20 ml于對應(yīng)的試管中，水浴加熱至40℃再加入已預(yù)熱至40℃ 的1%淀粉溶液1.0 ml，在40℃水浴中恒溫進行酶解15 min后，分別加入3，5-二硝基水楊酸2.0 ml搖勻，置于水浴中煮沸5 min，使3，5-二硝基水楊酸與淀粉被酶解后生成的還原糖充分發(fā)生反應(yīng)，然后取出用流水冷卻，加蒸餾水定容至20.0 ml，搖勻，用7號管麥苗溶液進行最大吸收波長掃描，最大吸收波長λmax=510 nm(圖1)，同法配制空白溶液1份。用1 cm的比色皿，以波長510 nm為測定波長，以空白溶液調(diào)零后，分別測定1～12號溶液，由計算機直接讀出測定溶液的濃度，通過計算可得到相應(yīng)麥苗的還原糖的含量，由此表示酶活性強度[淀粉酶的活性強度計算公式(mg/g):Cx(μg/ml)×20 ml÷1000 ÷0.2 ml×0.1 g/ml]。

2 結(jié)果

2.1 麥芽糖標準溶液與麥苗待測液的吸收圖譜

用3，5-二硝基水楊酸顯色后，麥芽糖標準溶液和酶解淀粉溶液(麥苗淀粉溶液)，在400～700 nm波長范圍內(nèi)吸收圖譜(圖1)。

圖1 標準溶液與麥芽溶液吸收圖譜

2.2 麥芽糖標準工作曲線(圖2)

圖2 麥芽糖標準工作曲線

2.3 麥苗在不同生長高度時淀粉酶的活性情況 (表1)

表1 不同高度麥苗中淀粉酶的活性情況

3 討論

本實驗采用的是3，5-二硝基水楊酸法。麥苗提取液中的淀粉酶在40℃的水浴中將淀粉水解生成麥芽糖，麥芽糖與3，5-二硝基水楊酸發(fā)生反應(yīng)，生成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與還原糖糖濃度成正比，故可求出麥芽糖含量。從在400～700 nm范圍吸收圖譜分析，標準麥芽糖溶液與酶解溶液的吸收曲線的形態(tài)非常一致，最大吸收波長均為510 nm，從標準工作曲線的相關(guān)系數(shù)可知，r=0.9998，說明在 0 ～100 μg/ml濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，因此，保證了測定數(shù)據(jù)的準確性。

實驗結(jié)果表明麥苗在不同生長高度時其淀粉酶的活性強度不同;麥苗中淀粉酶的活性強度隨生長高度的增加而減小。因此，合理控制小麥苗的生長高度，盡可能保持其淀粉酶活性強度，最大程度的發(fā)揮麥苗健胃消食、助消化的功效作用。麥苗是優(yōu)質(zhì)的天然食物，安全可靠，并且具有重要的營養(yǎng)保健作用[7－9]。人們在食用這一天然食物的同時，使身心獲得健康，從而提高人們的健康水平和生活質(zhì)量。

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