二氮嗪后處理聯(lián)合預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷作用的研究*

鹿 欣 陳克彪 馬 磊 張志東 夏 濤(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院心臟血管外科，山東泰安 271000)

缺血預(yù)適應(yīng)對缺血心肌可發(fā)揮強(qiáng)大的內(nèi)源性保護(hù)作用[1]，但卻沒有能夠在臨床上得到應(yīng)用。后處理的出現(xiàn)代表了新的有潛力的保護(hù)策略，同預(yù)處理比較可能有更廣范圍和更安全的臨床應(yīng)用價值[2]。與機(jī)械預(yù)處理、后處理相比，藥物處理可能更具實(shí)際應(yīng)用價值[3]。線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channels，mitoKATP)的開放在預(yù)處理、后處理中起著重要的作用，它既是預(yù)處理、后處理心肌保護(hù)效應(yīng)的終末效應(yīng)器，又在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演了重要的角色。二氮嗪是mitoKATP的特異性開放劑，可激活內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究了二氮嗪預(yù)處理、后處理及二種處理聯(lián)合對心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠48只，體重250～300 g，雄性，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:SCXK20050017)。二氮嗪，5-羥基葵酸鹽(5-HD)，伊文思蘭均購自Sigma公司(GD4061465)。2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號:F20061215)。SOD、LDH、CK、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。二甲基亞砜(DMSO)及其他試劑均為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及灌注方法 3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，按3 mg/kg經(jīng)下腔靜脈注射肝素。開胸取出心臟，懸掛于Langendorff灌流裝置上，溫度為(37 ±0.2)℃，用 pH 為7.35 ～7.45 的改良任-樂氏液(mmol/L:NaCl l54.0，KCl 3.4，CaCl21.8，NaHCO33.6，Glucose 5.6)灌注，用95%的 O2和5%的CO2充注，灌注壓75 cmH2O。用持針器持小圓針在左冠狀動脈前降支根部穿一結(jié)扎線，在該結(jié)扎線下方約0.5 cm處再穿一結(jié)扎線，以備結(jié)扎。結(jié)扎時采用直徑0.2 cm細(xì)塑料管穿過結(jié)扎線，收緊或松開結(jié)扎線以造成心肌缺血再灌注模型。心肌功能測量:剪開左心房經(jīng)二尖瓣置一聚乙烯球囊于左心室內(nèi)，通過導(dǎo)管和BL-420E+生物機(jī)能儀連接，向球囊內(nèi)注入適量生理鹽水使左室舒張末壓(LVEDP)為5～10 mmHg，并維持實(shí)驗(yàn)始終。選擇心臟標(biāo)準(zhǔn):平衡灌注末 HR＞160次/min、LVSP＞75 mmHg，每分鐘室性早搏＜2個，不符合上述標(biāo)準(zhǔn)者舍棄后另補(bǔ)充。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 48只大鼠心臟平衡灌注30 min后，隨機(jī)分為6組。①對照組(Con組):結(jié)扎左冠狀動脈前降支(left anterior descending artery，LAD)45 min，再灌注120 min。②缺血后處理組(Pos組):在再灌注前先6次短暫開放/鉗夾主動脈灌注管(10秒閉塞，10秒再灌注，循環(huán)6次)，其余同對照組。③二氮嗪后處理組(Dpo組):在LAD開放時給予二氮嗪(50 μmol/L)。④二氮嗪預(yù)處理組(Dpr組):二氮嗪(50 μmol/L)在LAD阻斷前灌注10 min。⑤聯(lián)合組(Cbm組):LAD阻斷前、后分別給予二氮嗪(50 μmol/L)灌注10 min。⑥阻滯劑組(Dhb組):二氮嗪(50 μmol/L)與 5-HD(100 μmol/L)混合灌注，其余同聯(lián)合組。二氮嗪使用前用DMSO溶解，保持終濃度小于0.1%。

1.2.3 觀察指標(biāo)及測定 通過BL-420E+實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)持續(xù)監(jiān)測連續(xù)記錄血流動力學(xué)數(shù)值:心率-收縮壓乘積百分?jǐn)?shù)，左心室內(nèi)壓瞬間最大變化速率(±dp/dtmax)，冠脈流量(coronary flow，CF)。

1.2.4 收集平衡灌注20 min時，復(fù)灌30 min時冠脈循環(huán)流出液，測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。復(fù)灌結(jié)束后取缺血區(qū)心肌組織測定肌酸激酶(creatine kinase，CK)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。

1.2.5 線粒體超微結(jié)構(gòu)改變的電鏡觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，每組隨機(jī)留取一個心臟左心室前壁風(fēng)險區(qū)組織用于電鏡檢查。在H-7500型透射電子顯微鏡下對線粒體進(jìn)行Flameng評分[4]。即在每組內(nèi)隨機(jī)取5個視野(每個視野包括20個線粒體)，計(jì)算每個視野中線粒體評分的平均數(shù)，5個視野的均值即為Flameng評分。評分標(biāo)準(zhǔn)為:0分:線粒體結(jié)構(gòu)正常，顆粒完好;1分:線粒體結(jié)構(gòu)正常，但顆粒缺失;2分:線粒體水腫，基質(zhì)透明、清晰;3分:嵴破裂，基質(zhì)透明、濃縮;4分:線粒體內(nèi)、外膜破裂，不完整。

2 結(jié)果

2.1 心率-收縮壓乘積百分?jǐn)?shù)，左心室內(nèi)壓瞬間最大變化速率(±dp/dtmax)，冠脈流量(CF)的檢測結(jié)果 與Con組比較，Pos組、Dpo組、Dpr組、Cbm組的心率-收縮壓乘積百分?jǐn)?shù)見圖1;+dp/dtmax見圖2;－dp/dtmax見圖3;CF見圖4。在缺血前無顯著差異性(P ＞0.05)，復(fù)灌后 Pos組、Dpo組、Dpr組、Cbm組較Con組恢復(fù)好(P＜0.05);Dhb組的5-HD取消了二氮嗪的保護(hù)作用;與單獨(dú)應(yīng)用二氮嗪預(yù)處理、后處理相比，Cbm組中二氮嗪后處理聯(lián)合預(yù)處理沒有表現(xiàn)更大的疊加保護(hù)作用。

圖1 心率-收縮壓乘積百分?jǐn)?shù)

圖2 左心室內(nèi)壓上升最大速率圖

圖3 左心室內(nèi)壓下降最大速率圖

圖4 冠脈流量圖

2.2 LDH、SOD、CK 及 MDA 的結(jié)果

與Con組比較，Pos組、Dpo組、Dpr組、Cbm 組中心肌灌流液中LDH漏出量減少(P＜0.05)，SOD含量較高(P＜0.05)，Dhb組與Con組比較無顯著差別(P ＞0.05)，見表1，2。

與Con組比較，缺血區(qū)心肌組織CK及MDA的含量在 Pos組、Dpo組、Dpr組、Cbm組減少(P＜0.05)。與 Pos組、Dpo組、Dpr組比較，Cbm 組中CK及MDA沒有表現(xiàn)出更大的疊加保護(hù)作用，見表3。

表2 冠脈流出液中SOD(U/mL)

表3 心肌組織CK及MDA

2.3 線粒體Flameng評分

線粒體Flameng評分在Pos組、Dpo組、Dpr組、Cbm 組分別為 1.44 ± 0.88、1.10 ± 0.73、1.50 ±0.92、1.36 ±0.67，各項(xiàng)數(shù)值與 Con 組 3.08 ±0.79相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Dhb組數(shù)值3.14±0.69與Con組比較無顯著差別(P＞0.05)。與Pos組、Dpo組、Dpr組比較，Cbm組中線粒體Flameng評分沒有表現(xiàn)出更大的疊加保護(hù)作用。

3 討論

對缺血心肌的保護(hù)研究一直是心臟學(xué)科領(lǐng)域的重點(diǎn)。如何建立有效的藥物后處理，有效藥物后處理和藥物預(yù)處理聯(lián)合使用的關(guān)系，是心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)研究中的重點(diǎn)問題[3]。

心肌缺血時，機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基(oxygen free radical，ROS)，ROS對心肌的損傷主要表現(xiàn)為ROS與心肌細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸結(jié)合，引起脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxide，LPO)，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的一系列改變，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷。體內(nèi)最重要的LPO代謝產(chǎn)物是MDA，故測定MDA能較好地反映組織脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出細(xì)胞損傷程度。ROS清除酶如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶等的活性降低時，導(dǎo)致ROS堆積，ROS可轉(zhuǎn)變?yōu)榱u自由基，其活性更強(qiáng)，使膜脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能損害。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭自由基及脂質(zhì)過氧化破壞后，可使細(xì)胞膜功能失調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+內(nèi)流增加，造成細(xì)胞Ca2+超載，激活Ca2+依賴蛋白水解酶，促進(jìn)ROS生成，從而加劇缺血組織損傷。SOD是體內(nèi)清除自由基的一種特異酶，其活性變化可反映體內(nèi)抗氧化功能情況。

本研究顯示，與Con組比較，Pos組、Dpo組、Dpr組、Cbm組的MDA含量明顯降低，SOD含量明顯增高，表明降低MDA含量、增強(qiáng)SOD活性是機(jī)械后處理、二氮嗪預(yù)處理、后處理減少心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制之一。

二氮嗪是線粒體KATP通道選擇性開放劑，可激活內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制，具有抗心肌缺血缺氧損傷的作用。二氮嗪改善心肌缺血再灌注損傷主要是基于mitoKATP的作用。二氮嗪作用于線粒體ATP敏感性K+通道，使線粒體K+通道開放，K+、H2O的內(nèi)流，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)腫脹，呼吸功能增強(qiáng)，防止線粒體Ca2+超載。可能通過保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，有利于細(xì)胞能量的保存以及防止細(xì)胞內(nèi)酸中毒的發(fā)生，減輕再灌注期間線粒體鈣超載和活性氧增加，從而抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放誘導(dǎo)的凋亡和線粒體結(jié)構(gòu)崩解，減輕心肌缺血再灌注損傷[5]。

本研究顯示，與單獨(dú)給予二氮嗪相比，在同時給予二氮嗪和5-HD后，缺血心肌線粒體Flameng評分增高，表明5-HD取消了二氮嗪預(yù)處理、后處理的保護(hù)作用。

本研究顯示，二氮嗪預(yù)處理聯(lián)合后處理對缺血再灌注心肌有保護(hù)作用，但卻沒有表現(xiàn)出疊加保護(hù)作用。這和Deyhimy[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而李北方等[7]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用能明顯增加對大鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。這種偏差的出現(xiàn)可能歸因于不同的動物缺血模型的應(yīng)用。對于兩者是否有疊加效應(yīng)存在著較大的爭論，但確切的理論結(jié)果需更多大量的實(shí)驗(yàn)研究加以確定[8]。

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