胚胎腦片免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染技術(shù)在神經(jīng)元發(fā)生研究中的應(yīng)用

敖 然 吳美延 趙 慧 周 莉陳愛(ài)軍

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,長(zhǎng)春 130021)

胚胎腦片免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染技術(shù)在神經(jīng)元發(fā)生研究中的應(yīng)用

敖 然 吳美延 趙 慧 周 莉＊陳愛(ài)軍

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,長(zhǎng)春 130021)

目的 為更客觀地觀察胚胎腦神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化和遷移,建立胚胎腦片免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染技術(shù)。方法 灌流固定,取胚胎14天(E14)大鼠腦,低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋,振動(dòng)切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果 波形蛋白(Vimentin)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光,胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀。ChAT陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光,除胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸展外,可見(jiàn)皮層板區(qū)也有陽(yáng)性細(xì)胞集聚。結(jié)論 此項(xiàng)技術(shù)可直接觀察到胚胎腦神經(jīng)祖細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞的完整形態(tài),并通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)方法鑒定其表型,從而闡明相互之間的關(guān)系。

胚胎腦片; 免疫熒光組織化學(xué); 神經(jīng)元發(fā)生

在研究胚胎端腦神經(jīng)元發(fā)生時(shí),為證實(shí)神經(jīng)元的來(lái)源、遷移和歸宿,常常需要通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒別神經(jīng)元類(lèi)型,有時(shí)還需檢測(cè)兩種標(biāo)志性蛋白共存于同一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。但是,由于胚胎端腦細(xì)胞核大,細(xì)胞質(zhì)極少,一般免疫組織化學(xué)雙重染色很難客觀地辨認(rèn)兩種蛋白是否共存于同一胞質(zhì)內(nèi)。此外,一般石蠟切片和冰凍切片,厚度為5-20μm,端腦細(xì)胞多為放射狀突起細(xì)胞,在如此薄的組織切片上僅能見(jiàn)到長(zhǎng)突起的斷續(xù)截面,而不能觀察這些細(xì)胞長(zhǎng)突起的立體完整形態(tài)以及與周?chē)?xì)胞的聯(lián)系,因此,薄切片和一般免疫組織化學(xué)染色技術(shù)限制了對(duì)胚胎腦發(fā)育的研究。使用瓊脂糖包埋胚胎腦組織,振動(dòng)切片機(jī)把腦切成厚度為60-100μm的腦片,免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行漂染,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,不但可以觀察端腦細(xì)胞的完整形態(tài),還可以在活體熒光標(biāo)記之后動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、分裂,產(chǎn)生成神經(jīng)細(xì)胞后的遷移以及最后的歸宿,從而更深入地了解神經(jīng)元發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制。然而,由于缺乏此類(lèi)技術(shù)的相關(guān)資料,使其不能在國(guó)內(nèi)普遍應(yīng)用。因此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索,建立了一套較完善的技術(shù)體系。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用清潔級(jí) Wistar大白鼠3只,雌性2只,雄性1只,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為 SCXK-(吉)2003-0001)。雌性大鼠體質(zhì)量為(220±10)g,雄性大鼠體質(zhì)量為(250±10)g,按常規(guī)方法將雌雄大鼠合籠交配,次日清晨以鏡檢陰道涂片,發(fā)現(xiàn)精子或陰栓之日為妊娠第零天(E0),并記錄胎齡,屏障環(huán)境飼養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 取材及腦片標(biāo)本制備

取懷孕14天 Wistar大鼠乙醚麻醉,打開(kāi)胸腔左心室插管,快速注入預(yù)熱生理鹽水,沖凈血液,10%中性甲醛溶液灌流固定,取出胚胎腦,置入同一種固定液中,再固定24h,4℃;10%低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋,置于4℃冰箱內(nèi)冷卻1h,繼續(xù)固定 24h,4℃。調(diào)節(jié)振動(dòng)切片機(jī)刀片角度。修整組織塊,去掉組織周?chē)^(guò)多的瓊脂糖,用膠水把包埋塊固定于切片臺(tái)上,將胚胎腦調(diào)整為冠狀位,切片厚度為60μm,調(diào)節(jié)切片速度和振幅,連續(xù)切片,切片置入裝有0.01Mol PBS的平板孔中保存?zhèn)溆肹1-3]。

2.2 免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染

胰蛋白酶消化修復(fù)抗原,用預(yù)熱0.1%胰蛋白酶液37℃孵育切片,30min;為使抗體滲入細(xì)胞內(nèi),使用去污劑使細(xì)胞膜穿孔,3%TritonX-100恒溫?fù)u床中孵育20℃,24h;0.01%卵白素孵育30min,RT,以封閉內(nèi)源性生物素[4-7];即3%甲醇-過(guò)氧化氫孵育40min,RT,封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;為封閉非特異性反應(yīng),分別用 5%山羊血清和 2%BSA孵育30min,RT;同時(shí)加入兩種不同一抗孵育,4℃過(guò)夜,一是小鼠抗大鼠單克隆抗波形蛋白抗體(Vimentin),二是兔抗大鼠多克隆抗乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶抗體(ChA T),用一抗稀釋液(含10mg/ml BSA 和0.05(v/v)%Tween的 PBS)配制抗體,效價(jià)分別為1:200和1:100,PBS分別替代兩種抗體作為陰性對(duì)照;針對(duì)ChAT滴加羊抗兔生物素化 IgG(二抗)孵育40min,RT;SABC復(fù)合物標(biāo)記Cy3孵育40min,RT(避光);針對(duì)Vimentin滴加羊抗小鼠 FITC-IgG(二抗稀釋液為含5%BSA和1‰Triton X-100的PBS),效價(jià)為1:50,孵育60min,RT(避光);防熒光淬滅封片劑封片,放入濕盒中保存;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。以上步驟除加一抗前封閉非特異性反應(yīng)步驟無(wú)需將組織片沖洗外,其余步驟完成后均需使用含0.1%Triton X-100的 PBS漂洗3-5次 ,每次 3-5min。

結(jié) 果

在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察連續(xù)切片的每一張腦片,發(fā)現(xiàn)僅在第三張腦片端腦背側(cè)前角部(圖1a)可見(jiàn)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT,膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白)陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸展,此外,皮層板區(qū)也積聚許多不規(guī)則形ChAT陽(yáng)性細(xì)胞(圖1c);而波形蛋白(Vimentin,放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白)陽(yáng)性細(xì)胞幾乎在每一張腦片中均有表達(dá),呈綠色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸向軟腦膜[8,9],并在其末端相互連接成網(wǎng)(圖1b)。當(dāng)把同一張腦片的兩種不同熒光染色重疊時(shí),ChAT和Vimentin雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光,僅見(jiàn)于腦室區(qū)呈放射狀(圖1d)。此結(jié)果不僅提示膽堿能神經(jīng)元是由放射狀膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,而且還提示放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在不對(duì)稱(chēng)分裂的同時(shí),已經(jīng)出現(xiàn)將要產(chǎn)生的神經(jīng)元表型,這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究端腦神經(jīng)元的發(fā)生和遷移機(jī)制甚為重要。

討 論

使用瓊脂糖包埋胚胎腦組織,振動(dòng)切片機(jī)切片,免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)漂染,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,這種技術(shù)比一般免疫組織化學(xué)技術(shù)在研究腦發(fā)育方面有更多的優(yōu)越性。由于大腦神經(jīng)元發(fā)生是以腦室為中心向周?chē)史派錉钸w移,逐漸形成放射狀結(jié)構(gòu)單位,此種立體結(jié)構(gòu)很難在平面上完整顯示,而振動(dòng)切片機(jī)切出的厚切片則彌補(bǔ)了這一不足。放射狀膠質(zhì)細(xì)胞是胚胎端腦中瞬時(shí)性神經(jīng)干細(xì)胞,它將在不同時(shí)間分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。波形蛋白(vimentin)僅在神經(jīng)干細(xì)胞階段特異性表達(dá),當(dāng)細(xì)胞分化為特定類(lèi)型的神經(jīng)元時(shí),波形蛋白表達(dá)逐漸消失[10]。然而,我們正是應(yīng)用了上述技術(shù)才在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞階段不但表達(dá)波形蛋白,同時(shí)還表達(dá)它將要分化的神經(jīng)元類(lèi)型特異性蛋白,如膽堿能神經(jīng)元的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶。盡管對(duì)此現(xiàn)象的意義還不甚了解,但是,它提示了在腦發(fā)育早期神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的作用遠(yuǎn)比目前已知的更為復(fù)雜。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使得胚胎端腦放射狀膠質(zhì)細(xì)胞如何產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程以及它們的時(shí)空關(guān)系更容易被觀察。這對(duì)研究腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。

圖1 E14大鼠腦片免疫熒光雙重染色圖1a.端腦冠狀切片hoechst33258染色,白框顯示端腦背側(cè)前角部;圖1b.Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸向軟腦膜,并在其末端相互連接成網(wǎng);圖1c.端腦背側(cè)前角部可見(jiàn)ChAT陽(yáng)性細(xì)胞,呈紅色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸展。此外,皮層板區(qū)集聚許多不規(guī)則形ChAT陽(yáng)性細(xì)胞;圖1d.同一張腦片的兩種不同熒光染色重疊,ChAT和Vimentin雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光,多見(jiàn)于腦室區(qū)呈放射狀。Fig.1 Immunofluorescence Double Staining for E14 Rat Brain sliceFig.1a. showing telencephalon coronal section with hoechst33258 staining,fore corner of dorsal telencephalon is showed by the white frame. Fig1b. Vimentin positive cells appeared to be green fluorescence,the cellular bodies locate in the ventricle zone(VZ),radial long processes extend to the pial and the each other links into web. Fig1c. ChAT positive cells with red fluorescence were found in the fore corner of dorsal telencephalon. Fig1d. When immunofluorescence double stainning was merged in a visual field ChAT and Vimentin double-positive cells appear to be yellow fluorescence and the radial long processes were seen in the VZ and SVZ,then ChAT positive cells were only observed in the cortex plate.

此項(xiàng)技術(shù)的每一環(huán)節(jié)與常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)均有所不同。首先,選擇低熔點(diǎn)瓊脂糖作為包埋劑,可以避免因包埋組織時(shí)組織受熱過(guò)度而使被檢物喪失抗原性。再則,低熔點(diǎn)瓊脂糖質(zhì)地軟、黏度大,易與腦組織融為一體。關(guān)于使用濃度,文獻(xiàn)的報(bào)道不盡相同[11,12]。我們經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)摸索出適合于本實(shí)驗(yàn)的最佳濃度,即10%瓊脂糖。配制時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn):一是根據(jù)所需包埋組織的數(shù)量,配制適量的瓊脂糖溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用,不宜反復(fù)加熱,因?yàn)榧訜釙r(shí)液體蒸發(fā)過(guò)多,瓊脂糖易粘在容器底部,還會(huì)出現(xiàn)許多氣泡,影響包埋組織的質(zhì)量;二是注意控制包埋時(shí)溶解瓊脂糖的溫度,一般控制在50℃左右為宜;三是在進(jìn)行包埋前,取出浸泡在10%中性甲醛中的大鼠胚胎腦,自來(lái)水充分沖洗殘留的甲醛,吸干腦表面的水分,防止在切片時(shí)腦組織與瓊脂糖分離;四是在包埋胚胎腦時(shí),使胚胎嘴部朝向正上方,以保證腦片呈冠狀面。操作時(shí)首先用鑷子夾住組織放入包埋槽底部,緩慢倒入瓊脂糖溶液,待浸沒(méi)包埋槽底部后慢慢抽出鑷子,繼續(xù)倒入瓊脂糖,使其完全覆蓋組織,將包埋好的組織塊置入冰箱冷藏室內(nèi)40-60min,完全凝固后再置入10%中性甲醛溶液24h,以增加瓊脂糖的硬度。如果使用其它組織可以適當(dāng)調(diào)整在甲醛內(nèi)浸泡時(shí)間,盡量使瓊脂糖的硬度與組織相近,以免切片時(shí)組織與瓊脂糖分離。倘若長(zhǎng)時(shí)間浸泡,應(yīng)及時(shí)更換甲醛液。

振動(dòng)切片機(jī)是以切厚組織片為特點(diǎn),固定和非固定組織均可。這種厚組織片不易貼附于載玻片染色,故采用漂染方法。切片前先用量角器調(diào)節(jié)刀片角度,一般不應(yīng)小于20度,若角度不適當(dāng),刀片過(guò)度上翹,切片時(shí)后部的金屬托擠壓組織塊,使組織碎裂;組織塊修整后使用502膠將其固定在托盤(pán)上,隨后加入0.01mol/L PBS浸沒(méi)組織塊即可切片。切片的速度和振幅需依據(jù)組織塊的硬度和大小進(jìn)行調(diào)節(jié)。若已切好的組織片不準(zhǔn)備當(dāng)天染色,可放入留有微量PBS平板孔中,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩４诉^(guò)程應(yīng)注意如果切片在平板孔中浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),易使瓊脂糖與組織分離,染色時(shí)不便于操作。

對(duì)于免疫熒光組織化學(xué)厚切片染色,欲達(dá)到理想的染色效果,關(guān)鍵問(wèn)題在于如何使抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和抑制非特異性反應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)為使抗體能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞質(zhì)中的中間絲蛋白結(jié)合,經(jīng)反復(fù)摸索細(xì)胞膜打孔條件,最后確認(rèn)使用高濃度去污劑,即3%TritonX-100,把裝有腦片的平板孔放入恒溫?fù)u床中,20℃,孵育24h。在每一步驟后的漂洗中,使用含 0.1%TritonX-100的 PBS,并且增加漂洗次數(shù),效果更佳。在控制非特異性反應(yīng)方面,注意要分別使用與二抗種屬相同的非免疫血清和2%BSA封閉,在一抗孵育和漂洗結(jié)束后再增加一次2%BSA封閉,以防止二抗發(fā)生的非特異性反應(yīng)。一抗和二抗稀釋液的配制也需加入一定量的BSA和低濃度的 Triton X-100,使得在加入一抗和二抗的同時(shí),再次封閉非特異性反應(yīng)。由于采用免疫熒光雙重染色,同時(shí)加入兩種不同種屬的抗體,因此在配制抗體時(shí),既要使所用稀釋液符合第一種抗體的效價(jià),又要同時(shí)符合第二種抗體的效價(jià)。此外,對(duì)照實(shí)驗(yàn)也很重要,除需設(shè)置一抗陰性對(duì)照和二抗陰性對(duì)照以外,還需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,以此來(lái)判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性和操作方法的正確性。免疫熒光組織化學(xué)染色的大部分步驟結(jié)束后均需充分漂洗切片,以去掉殘留的試劑和未結(jié)合的抗體。在漂洗切片時(shí),如使用吸管吹打,瓊脂糖與腦片容易分離,可將裝有組織片的平板孔放在微量振蕩器上,利用振蕩使腦片在漂洗液中緩慢旋轉(zhuǎn),起到充分漂洗的作用。

使用一般熒光顯微鏡不能觀察免疫熒光染色的厚切片,因?yàn)榧ぐl(fā)光在標(biāo)本的表層則被消耗掉,標(biāo)本其余部分的熒光不能被激發(fā)。激光掃描共聚焦顯微鏡具有深度識(shí)別能力和縱向分辨力,可以彌補(bǔ)這一不足。激光掃描共聚焦顯微鏡逐層對(duì)腦片獲得光學(xué)橫斷面圖像,實(shí)現(xiàn)顯微“CT”功能。它提供的圖片信息甚至可能比幾百?gòu)埱衅€要多。在這些圖片信息中我們更直接地觀察到 E14大鼠端腦神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化,產(chǎn)生成神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)程。如果通過(guò)電穿孔把帶有綠色熒光蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入胚胎腦側(cè)腦室,制備成腦片后在不同時(shí)間拍照,則能動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)元發(fā)生和遷移,倘若把腦片實(shí)施免疫熒光化學(xué)染色,可以鑒別神經(jīng)元類(lèi)型[14,15]。因此,熟練掌握這項(xiàng)技術(shù)是深入研究胚胎腦發(fā)育和神經(jīng)元發(fā)生不可缺少的。

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Application of immunofluorescence double stainning technology for embryo brain slices to the study of neurogenesis

Ao Ran,Wu Meiyan,Zhao Hui,Zhou Li＊,Chen Aijun

(Department ofHistology and Embryology,N ormen Bethune College of J ilin University,Changchun130021,China)

Objective To establish the double immunofluorescent staining technique for the embryonic brain slices to objectively observe the proliferation,differentiation and migration of neural progenitor cells in rat embryo brains.Methods Rat embryos of 14 days(E14)were fixed by perfusion.The brains were taken and embedded in low-melting agarose,then sliced with a vibratome,stained by double immunofluorescence and observed by using confocal laser scanning microscopy. Results Vimentin and choline acetyltransferase(ChAT)double positive cells showed yellow fluorescence their bodies located in the ventricle zone(VZ),and the radial long processes in the subventricle zone(SVZ).Only ChAT positive cells with red fluorescence were found in the cortex plate of dorsal telencephalon.Conclusion The morphology and identity of neural progenitor cells and neuroblasts are identified by using the technique,and their relationship can be analyzed by double immunofluorescent staining.

Embryonic brain slice; Immunofluorescence histochemistry; Neurogenesis

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.018

2010-10-10

2010-11-01

吉林大學(xué)本科生實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目

敖然,女(1987年),漢族,七年制學(xué)生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)