牛IgG電化學(xué)納米免疫傳感器的研制

康曉斌，龐廣昌*，梁新義

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

牛IgG電化學(xué)納米免疫傳感器的研制

康曉斌，龐廣昌*，梁新義

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

研制特異性定量檢測牛初乳制品及含牛IgG制品中牛IgG含量的電流型納米免疫傳感器。以成膜性及生物相容性良好的殼聚糖為媒介連接納米金于玻碳電極，以比表面積大、吸附能力強(qiáng)、生物相容性好的納米金固定兔抗牛IgG-HRP。通過循環(huán)伏安法及交流阻抗法表征電極組裝各個過程的電化學(xué)特性，利用計時電流法測定PBS稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG。結(jié)果表明免疫前后穩(wěn)定電流的變化率與標(biāo)準(zhǔn)牛IgG質(zhì)量濃度的對數(shù)在0.1～10000ng/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.9976。該傳感器穩(wěn)定性及重現(xiàn)性良好，操作簡單方便，成本較低，可用于含牛IgG制品中牛IgG含量的特異性定量檢測。

牛免疫球蛋白G(牛IgG)；免疫傳感器；納米金；計時電流法

初乳是哺乳動物的母親為新生動物所準(zhǔn)備的第一份特殊早餐，初乳富含免疫球蛋白、抗菌肽和各種生長因子。其中免疫球蛋白對于嬰幼兒的免疫、抗菌、抗病毒和促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育具有極其重要的作用。近年來實驗表明，食用動物乳的抗體后，其主要的抗體并不被腸胃中的蛋白酶所消化，大部分可以保持到小腸末端還具有生物活性?？梢娔讨锌贵w的主要功能不是為后代提供營養(yǎng)物質(zhì)，而是具有抗菌和免疫功能。在牛初乳和常乳中，IgG是最多最主要的免疫物質(zhì)。因此富含IgG的嬰幼兒奶粉及其他食物可以減少病毒和微生物的感染，并可以提高消費者的免疫能力。2004年，添加來源于牛乳的免疫球蛋白作為免疫活性物質(zhì)的嬰幼兒奶粉及其他食物的產(chǎn)值就高達(dá)10億美元。在競爭日益激烈的IgG產(chǎn)品的市場中，產(chǎn)品的價格往往依賴于IgG的含量，并且對標(biāo)注含量的要求越來越嚴(yán)格[1-3]。因此發(fā)展快速可靠的檢測方法對添加IgG產(chǎn)品的質(zhì)量控制頗為重要，表1為國內(nèi)外現(xiàn)階段對IgG的檢測方法。

本項研究結(jié)合免疫分析無須對樣品進(jìn)行富集，純化或預(yù)處理，特異性高及電化學(xué)分析可以實現(xiàn)在線檢測，不受樣品顏色、濁度的影響，所需儀器設(shè)備相對簡單的特點，以玻碳電極為基體電極，采用自組裝單分子膜技術(shù)借助納米金固定Anti-bovine IgG-HRP，研制了牛IgG電流型免疫傳感器，并對該傳感器的電化學(xué)特性及測定效果進(jìn)行了檢測。

表1 近年來國內(nèi)外對IgG的檢測方法Table 1 Current detection methods for IgG at home and abroad

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸 沈陽市金科試劑廠；殼聚糖(脫乙酰度≥90%) 濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)牛IgG 北京成文免疫化學(xué)研究室；兔抗牛IgG-HRP 天津華生源生物科技有限公司；0.1g/100mL 殼聚糖溶液；0.1g殼聚糖溶于100mL體積分?jǐn)?shù)1%醋酸溶液。所用試劑均為分析純，實驗所用水均為超純水。

玻碳電極(glassy carbon electrode，GCE)(φ=3mm)、Ag/AgCl電極、鉑絲電極 上海辰華儀器有限公司。1.2 儀器與設(shè)備

CHI760D電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DHG-907385-ⅢCIMO電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PB-10 Sartorius pH計 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；LRH-70型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2501紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納米金(gold nanpoarticle，NG)的制備及表征

本實驗參照Frens法[11]采用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備納米金，參照文獻(xiàn)[12]取調(diào)至中性的0.01g/100mL氯金酸溶液100mL，加入1g/100mL檸檬酸三鈉4mL混勻，置于微波爐中低火加熱18min，待其冷卻后用超純水補(bǔ)充至原體積，保存于4℃?zhèn)溆?。利用紫外可見分光光度計對所制納米金溶膠進(jìn)行表征。

1.3.2 免疫傳感器的制備

將全新玻碳電極依次用1.0、0.3、0.05μm粒徑的α-Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，每次拋光后在超聲水浴中清洗，每次30s，重復(fù)3次，最后依次用體積分?jǐn)?shù)為50%HNO3、無水乙醇、和超純水清洗。徹底洗凈后，電極在1mol/L H2SO3溶液中用循環(huán)伏安法活化(掃描范圍1.0～－1.0V，掃速為100mV/s)，反復(fù)掃描至出現(xiàn)穩(wěn)定循環(huán)伏安曲線為止。最后記錄在含0.20mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液的循環(huán)伏安曲線，以表征電極預(yù)處理效果(掃描范圍0.6～－0.1V，掃描速度50mV/s)。實驗室條件下所得循環(huán)伏安圖中的峰電位差在80mV以下，并盡可能接近64mV，電極方可使用。在氮氣環(huán)境中干燥待用。

取10μL 0.1g/100mL殼聚糖滴加于預(yù)處理電極表面的中心，于45℃烘箱中3h，冷卻至室溫后浸于1mol/L NaOH溶液中5min，超純水清洗后浸于超純水中30min。取出晾干后置于上述制備的納米金溶膠中24h，即可得GCE/CHIT/NG電極。

將修飾電極浸泡于用0.01mol/L pH7.4 PBS稀釋(1:100)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG溶液中，放置過夜(4℃)，取出水洗；然后將該電極置于1g/100mL BSA溶液中37℃溫育1h，以封閉活性位點，以含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20的PBST溶液清洗未結(jié)合的BSA，晾干，即得GCE/CHIT/NG/anti-IgG-HRP電極，懸于緩沖液上方4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 免疫傳感器測定方法

采用三電極系統(tǒng)，以不同修飾階段的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，以含0.20mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液為測試底液。先用循環(huán)伏安法(掃描范圍0.6～－0.1V，掃描速度50mV/s)表征電極在自組裝過程中各個階段的電化學(xué)特性，進(jìn)一步用交流阻抗法(10-2～106Hz)進(jìn)行表征。

對牛IgG的測定亦采用三電極系統(tǒng)，以0.01mol/L pH7.4 PBS緩沖液為測試底液，以2mmol/L對苯二酚及30% H2O2作為HRP酶的底物。在－400mV恒電位進(jìn)行電流-時間掃描，以免疫反應(yīng)前后穩(wěn)定電流值(I1、I2) 變化率進(jìn)行牛IgG的定量檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金的UV-vis表征

本研究所制納米金為透亮的酒紅色，圖1為納米金在400～700nm波長范圍的光譜掃描圖，在519nm波長處有一很強(qiáng)的吸收峰，光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長(λmax)在510～550nm波長范圍內(nèi)隨膠體金顆粒大小而變化。從而可知本研究制備的膠體金顆粒粒徑在15nm左右[13]。

圖1 納米金溶膠光譜掃描圖Fig.1 Absorption spectrum of nano-gold colloidal solution

2.2 電極預(yù)處理效果的表征

圖2 電極預(yù)處理前后的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammogram of electrode before and after pre-treatment

電極打磨洗凈后在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6(含0.20mol/L KNO3)溶液中的循環(huán)伏安圖(掃描范圍0.6～－0.1V，掃描速度50mV/s)如圖2曲線a所示，其峰電位為Ep,a=0.297V，Ep,c=0.220V，峰電位差小于80mV且峰電流Ip,a=8.259μA，Ip,c=－9.141μA，Ip,a/Ip,c≈1，表明電極表面已處理光滑潔凈；在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6(含0.20mol/L KNO3)溶液中的交流阻抗(10-2～106Hz)測定如圖3曲線a所示，曲線近似為直線，表明電子傳遞到電極表面只受擴(kuò)散控制。電極經(jīng)H2SO4活化后可以在表面產(chǎn)生含氧帶負(fù)電的基團(tuán)(如羧基、羥基等)[14]，同時亦可使電極表面形成多孔結(jié)構(gòu)，使其有效表面積增大[15]。如圖2曲線b所示活化后電極氧化峰及還原峰均正移，Ep,a=0.399V，Ep,c=0.0.325V；且峰電流都有所增大，Ip,a=9.434μA，Ip,c=－9.204μA，Ip,a/Ip,c更接近1，說明H2SO4活化使電極表面帶負(fù)電荷且提高了電極的性能?；罨箅姌O的交流阻抗曲線(如圖3曲線b)更趨于直線，更表明電極預(yù)處理效果良好。

圖3 電極預(yù)處理前后的交流阻抗圖Fig.3 AC impedance plot of electrode before and after pre-treatment

2.3 電極在組裝過程中的電化學(xué)表征

2.3.1 循環(huán)伏安表征

圖4 玻碳電極不同修飾階段的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of glassy carbon electrode at different stages of modification

圖4為不同修飾階段電極在1×10-3mol/L K3Fe(CN)6(含0.20mol/L KNO3)溶液中的循環(huán)伏安圖(掃描范圍0.6～－0.1V，掃描速度50mV/s)，由圖4可見，以未修飾玻碳電極掃描時出現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰(曲線a)，峰電位差為ΔE=65mV，Ip,a/Ip,c≈1；當(dāng)電極上修飾一層殼聚糖后響應(yīng)電流明顯減小(曲線b)，表明殼聚糖已組裝至裸玻碳電極上阻礙了電子的傳遞；當(dāng)以納米金進(jìn)一步修飾電極后，峰電流值顯著增加(曲線c)，這是因為納米金有利于電子傳遞，表明納米金已很好的固定在殼聚糖層；當(dāng)電極再固定上anti-IgG-HRP后，由于生物大分子阻礙了電子的傳輸，致使峰電流較曲線c明顯下降(圖曲線d)；曲線e為anti-IgG-HRP與牛IgG免疫結(jié)合后的C-V圖，其峰電流值進(jìn)一步減小，歸因于免疫復(fù)合物的形成進(jìn)一步阻塞了電子傳遞的孔道。

2.3.2 交流阻抗表征

交流阻抗通過記錄導(dǎo)體或半導(dǎo)體表面因固定生物分子或發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)而引起的載體表面的電容和界面電子傳遞電阻等電化學(xué)性質(zhì)的變化，繪制阻抗譜，進(jìn)而分析生物分子在載體表面的固定情況和生化反應(yīng)的動力學(xué)過程[16]，故可借助交流阻抗技術(shù)進(jìn)一步表征電極組裝。圖5為不同修飾階段電極在含0.20mol/L KNO3的1×10-3mol/L K3Fe(CN)6溶液中的交流阻抗譜圖，曲線a為裸電極交流阻抗圖；曲線b為組裝殼聚糖后，近似一段弧線，且其代表的圓的直徑約為電子傳遞的阻抗(Ret)，表明阻抗明顯增大，可能是由于殼聚糖在空間上阻礙了電子的傳遞，也進(jìn)一步證明殼聚糖組裝成功；由于納米金優(yōu)良的電子傳遞性能，當(dāng)電極再修飾上納米金后阻抗明顯減小(曲線c)；曲線d較c阻抗增大，表明Anti-IgG-HRP已組裝至電極上；當(dāng)用BSA液封閉之后阻抗進(jìn)一步增大(曲線e)，表明非特異性位點已被封閉；曲線f為免疫結(jié)合牛IgG之后的阻抗圖，近似一段弧，較e阻抗明顯增大，這可能是由于Anti-IgG-HRP與牛IgG免疫復(fù)合物的形成更大程度上阻礙了電子的傳遞。交流阻抗結(jié)果與循環(huán)伏安法結(jié)果一致，進(jìn)一步證明本實驗組裝方法可行。

圖5 玻碳電極不同修飾階段的交流阻抗圖Fig.5 AC impedance plots of glassy carbon electrode at different stages of modification

2.4 孵育時間優(yōu)化

在37℃條件下對在牛IgG溶液中的孵育時間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖6所示，孵育時間在0～10min之間響應(yīng)電流隨孵育時間的增加而急劇下降，當(dāng)超過10min后響應(yīng)電流下降緩慢，15min后響應(yīng)電流基本恒定，故選擇15min為最佳孵育時間。

圖6 孵育時間優(yōu)化Fig.6 Optimization of incubation time

2.5 免疫傳感器對牛IgG的測定

將制備好的GCE/CHIT/NG/anti-IgG-HRP電極分別在PBS緩沖液倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG溶液中37℃溫浴15min(從低質(zhì)量濃度至高質(zhì)量濃度)，進(jìn)行電流-時間掃描(圖7)，經(jīng)比較選定第50秒電流值為標(biāo)準(zhǔn)，以電流的變化率ΔI與牛IgG質(zhì)量濃度C/(ng/mL)的對數(shù)做圖(圖8)，結(jié)果表明在0.1～10000ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為：ΔI=7.1791lgC＋24.57913，相關(guān)系數(shù)r＝0.9976，據(jù)此可對受檢抗原進(jìn)行定量檢測。

圖7 免疫傳感器對牛IgG測定的電流響應(yīng)曲線Fig.7 Response curves of current for bovine IgG determination

圖8 標(biāo)準(zhǔn)牛IgG測定的線性響應(yīng)曲線Fig.8 Linear response curve of current for the determination of standard bovine IgG

2.6 免疫傳感器的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性

將組裝好的免疫傳感器在同一質(zhì)量濃度牛IgG標(biāo)準(zhǔn)液中連續(xù)測定12次，結(jié)果的RSD=3.45%(n=12)，表明該傳感器穩(wěn)定性良好。在PBS緩沖液上方、4℃條件下保存?zhèn)鞲衅?，每?d對同一標(biāo)準(zhǔn)牛IgG溶液進(jìn)行測定，結(jié)果如圖9所示，前10d響應(yīng)電流基本恒定，第13天響應(yīng)電流為初始電流的86.59%，但第15天響應(yīng)電流僅為初始值的47.83%。表明該免疫傳感器至少可以穩(wěn)定保存10d。

圖9 保存穩(wěn)定性實驗Fig.9 Stability of sample current ratio during storage

分別取不同時間制備的5支免疫傳感器，對同一質(zhì)量濃度(1000ng/mL)標(biāo)準(zhǔn)牛IgG液進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2，測定結(jié)果的RSD為4.78%，表明該免疫傳感器重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 2 Results of reproducibility experiments

3 結(jié) 論

以殼聚糖為橋聯(lián)劑固定納米金修飾于玻碳電極，利用納米金對抗體優(yōu)良的親和作用制作出了一種測定范圍廣、檢測限低的牛IgG電流型免疫傳感器。該免疫傳感器靈敏度高、穩(wěn)定性及重復(fù)性較好，可快速、簡單的用于牛IgG的定量檢測。但保存的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究，以便更好的應(yīng)用于在線檢測。

[1] 龐廣昌. 食品免疫論: 關(guān)于胃腸粘膜免疫和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的科學(xué)[M].北京: 科學(xué)出版社, 2008: 37-49.

[2] GAPPER L W, COPESTAKE D E J, OTTER D E, et al. Analysis of bovine immunoglobulin G in milk, colostrum and dietary supplements:a review[J]. Anal Bioanal Chem, 2007, 389(1): 93-109.

[3] LI Siquan, ZHANG H Q, BALASUBRAMANIAM V M, et al. Comparison of effects of high-pressure processing and heat treatment on immunoactivity of bovine milk immunoglobulin G in enriched soymilk under equivalent microbial inactivation levels[J]. J Agric Food Chem,2006, 54(3):739-746.

[4] GASPARYAN V K. Silver sol immunoagglutination assay for determination of human IgG[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010,80(2): 180-183.

[5] HURLEY I P, COLEMAN R C, IRELAND H E, et al. Measurement of bovine IgG by Indirect competitive ELISA as a means of detecting milk adulteration[J]. Dairy Science, 2004, 87(3): 543-549.

[6] WANG Zhijie, YANG Yunhui, LI Jishan, et al. Organic-inorganic matrix for electrochemical immunoassay: Detection of human IgG based on ZnO/chitosan composite[J]. Talanta, 2006, 69(3): 686-690.

[7] SADABA M C, PORQUE P G, MASJUAN J, et al. An ultrasensitive method for the detection of oligoclonal IgG bands[J]. Journal of Immunological Methods, 2004, 284(1/2): 141-145.

[8] 侯方妮, 杜彥山, 張志國, 等. 嬰幼兒配方乳粉中IgG活性質(zhì)量濃度的測定[J]. 中國乳品工業(yè), 2009, 37(1): 54-57.

[9] 田波, 姜瞻梅, 吳剛. 免疫透射比濁法測定初乳制品中IgG的質(zhì)量濃度[J]. 中國乳品工業(yè), 2008, 36(1): 63-64.

[10] 唐磊, 王慎嬌, 史瑩, 等. 免疫共振散射法測定奶粉中牛IgG[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009, 36(16): 3102-3103.

[11] FRENS G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science, 1973, 241(105): 20-22.

[12] 李衛(wèi)玲, 葉陽, 周有祥, 等. 檸檬酸三鈉法制備膠體金的工藝條件優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 49(10): 2529-2536.

[13] 張先恩. 生物傳感器[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 368-369.

[14] SHI Kang, SHIU K K. Scanning tunneling microscopic and voltammetric studies of the surface structures of an electrochemically activated glassy carbon electrode[J]. Anal Chem, 2002, 74(4): 879-885.

[15] NAGAOKA T, YOSHINO T. Surface properties of electrochemically pretreated glassy carbon[J]. Anal Chem, 1986, 58(6): 1037-1042.

[16] KHARITONOV A B, ALFONTA L, KATZ E, et al. Probing of bioaffinity interactions at interfaces using impedance spectroscopy and chronopotentiometry[J]. Electroanalytical Chemistry, 2000, 487(2): 133-141.

Development of Nano-gold-modified Electrochemical Immunosensor for Bovine IgG

KANG Xiao-bin，PANG Guang-chang*，LIANG Xin-yi
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

A current-type nano-immunosensor was developed for the specific determination of immunoglobulin G (IgG) content in colostrum products and bovine IgG-containing products. The chitosan with excellent film-forming capability and biocompatibility was used as the medium to connect nano-gold and glassy carbon electrode. Due to its large surface area, strong adsorption capacity and good biocompatibility, nano-gold was used to immobilize rabbit anti-bovine IgG-HRP. Electrochemical properties of electrode surface during each fabrication procedure were characterized by cyclic voltammetry and alternating current impedance method and standard bovine IgG in phosphate buffer was determined by chronoamperometry. The results revealed that the current-type nano-immuosensor had an excellent linear relationship between the concentration of bovine IgG in the range of 0.1－10000 ng/mL and the change rate of stable current before and after immunization with a correlation coefficient of 0.9976.Moreover, this immunosensor proved stable, reproducible, easy to use and inexpensive, thus being applicable for the quality control of bovine IgG products.

bovine immunoglobulin G；immunosensor；nano-gold；chronoamperometry

TS252.7；O657.1

B

1002-6630(2011)16-0379-05

2011-05-26

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A00)

康曉斌(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為乳品安全及生物傳感器。E-mail：kangxiaobin867100@163.com

*通信作者：龐廣昌(1956—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)與食品免疫學(xué)。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn