響應(yīng)面分析人參果酒釀造中果膠酶對(duì)色澤的影響

蘇鳳賢，張百剛，茍亞峰，陶 雋，桑亞蘭，張芬琴,*

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

響應(yīng)面分析人參果酒釀造中果膠酶對(duì)色澤的影響

蘇鳳賢1，張百剛2，茍亞峰1，陶 雋1，桑亞蘭1，張芬琴1,*

(1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

通過單因素與響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析果膠酶用量及酶解時(shí)間、酶解溫度和果漿的pH值對(duì)人參果果酒釀造中色澤的影響，建立相應(yīng)的回歸模型。結(jié)果表明，果膠酶酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)人參果果酒發(fā)酵前護(hù)色作用影響顯著(P＜0.05)，果膠酶用量對(duì)人參果果酒澄清作用影響顯著(P＜0.05)，而pH值對(duì)二者影響均不顯著(P＞0.05)。通過嶺脊分析確定人參果果酒的最佳護(hù)色工藝參數(shù)為pH4.6、酶解溫度32℃、酶解時(shí)間63min、果膠酶用量0.3g/kg；人參果果酒最佳澄清條件：果酒pH4.0、酶解溫度30℃、酶解時(shí)間55min、果膠酶用量0.316g/kg。多元回歸分析結(jié)果顯示，果酒的pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間及果膠酶用量與其護(hù)色、澄清效果之間回歸模型擬合程度良好，可用于實(shí)際生產(chǎn)預(yù)測(cè)。

果膠酶；果酒；響應(yīng)面法；嶺脊分析；色澤

人參果(pepino fruit)為茄科(Solamaceae)蔬菜、水果兼觀賞型草本植物，其果實(shí)形狀多似人心，成熟時(shí)，果皮呈金黃色并有紫色條紋，同時(shí)具有一種淡淡的清香味，果肉多汁，風(fēng)味獨(dú)特[1]。目前，在我國(guó)西北的河西走廊地區(qū)被廣泛種植，并以鮮食為主。研究發(fā)現(xiàn)，人參果果實(shí)富含多種維生素和人體必須微量元素[2]，其中硒元素是一種強(qiáng)氧化劑，能激活人體細(xì)胞，保護(hù)心血管等臟器；還能刺激免疫球蛋白及抗體的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力[3-4]。但人參果鮮果因含水量大而不耐貯藏，或因失水而使其口感受損，都會(huì)因此導(dǎo)致其市場(chǎng)價(jià)格下跌。為提高人參果的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)附加值，對(duì)其進(jìn)行深加工是一條很好的途徑。大多數(shù)果蔬汁中含有0.2%～0.5%的果膠物質(zhì)，這些果膠物質(zhì)具有很強(qiáng)的親水性能，是果蔬汁中最重要的混濁物穩(wěn)定劑，尤其是其中的可溶性果膠多以保護(hù)膠體形式裹覆在混濁物顆粒表面，阻礙著果蔬汁的澄清。因此果酒加工中常需要加入果膠酶、纖維素酶等作護(hù)色澄清處理。張彧等[5]以人參果為原料，確定了低糖人參果果脯、果醬的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；胡志和等[6]以人參果、全脂乳粉為主料，由此制得的復(fù)合乳飲料風(fēng)味穩(wěn)定，評(píng)價(jià)效果較好；陳彥[7]在人參果中加入果汁、蜂蜜等得到的復(fù)合果汁營(yíng)養(yǎng)豐富、口感良好、含Ca2+量高；文連奎等[8]對(duì)人參果白蘭地進(jìn)行了研制，未見人參果其他加工產(chǎn)品。羅安偉等[9]對(duì)甜橙汁澄清劑的選擇及甜橙干酒發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明果膠酶、殼聚糖、硅藻土的澄清效果顯著。楊劍芳等[10]對(duì)山茱萸發(fā)酵酒制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)添加果膠酶進(jìn)行澄清，酒液的透光率可達(dá)90.4%，較比其他澄清劑取最佳用量水平時(shí)的最大透光率高5%。

人參果營(yíng)養(yǎng)豐富，除可供鮮食外，還可加工成人參果果醬、飲料、鮮果汁、口服液、罐頭等[5-7]。本研究采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，優(yōu)化果膠酶在人參果果酒加工過程中的應(yīng)用條件，目的在于分解人參果細(xì)胞間層的部分原果膠、纖維素，穩(wěn)定其中色素，同時(shí)盡可能在發(fā)酵前將果汁中的雜質(zhì)減少到最低限度，避免果酒發(fā)酵前在貯存過程中酒石結(jié)晶沉淀或無定形的色素微粒自行沉淀出來以及出現(xiàn)蛋白質(zhì)渾濁、微生物渾濁等不良現(xiàn)象，從而提高人參果果酒的護(hù)色作用及澄清效果，為下一步人參果果酒發(fā)酵研究提供可靠的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參果(pepino fruit)產(chǎn)于甘肅武威市張義鎮(zhèn)，果實(shí)長(zhǎng)圓形，直徑3～4cm，外表呈黃色并有清晰的棕色紋絡(luò)；蔗糖 市售優(yōu)質(zhì)白砂糖；果膠酶(比活力10000U/g)武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司；葡萄酒高活性釀酒干酵母安琪酵母股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722型分光光度計(jì) 上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海柏欣儀器設(shè)備廠；無菌操作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋 上海道基科學(xué)儀器有限公司；手持糖量計(jì) 上海華光儀器儀表廠；PHS-3C酸度計(jì) 江蘇常州金壇市精達(dá)儀器制造廠；電子天平 上海方瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參果發(fā)酵酒加工工藝流程

1.3.2 果膠酶在不同條件對(duì)人參果果酒色澤影響的單因素試驗(yàn)

研究表明一般情況下對(duì)果膠酶酶解條件進(jìn)行研究，都從加酶量、溫度、pH值、時(shí)間4個(gè)方面進(jìn)行考察[11-14]，因果膠酶適宜的pH值為2.5～6.0、作用溫度為15～55℃[15]，因此本實(shí)驗(yàn)基于此進(jìn)行設(shè)計(jì)，討論果膠酶對(duì)人參果果酒發(fā)酵前后色澤變化的影響情況。

1.3.2.1 果膠酶用量對(duì)人參果果酒色澤的影響

將人參果果漿分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4g/kg和0.5g/kg果膠酶后放入40℃恒溫水浴中酶解75min，4000r/min離心10min，取上清液測(cè)A680；發(fā)酵10d后，取上清液再次測(cè)A680。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2.2 酶解時(shí)間對(duì)人參果果酒色澤的影響

將人參果果漿添加0.3g/kg果膠酶于40℃恒溫水浴中分別酶解45、60、75、90min和105min，之后4000r/min離心10min，取上清液測(cè)A680；發(fā)酵10d后，取上清液再次測(cè)A680。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2.3 酶解溫度對(duì)人參果果酒色澤的影響

將人參果果漿添加0.3g/kg果膠酶分別放入30、35、40、45℃和50℃恒溫水浴中酶解75min，之后4000r/min離心10min，取上清液測(cè)A680；發(fā)酵10d后，取上清液再次測(cè)A680。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2.4 pH值對(duì)人參果果酒色澤的影響

將人參果果漿添加0.3g/kg果膠酶后用檸檬酸分別調(diào)整pH值至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，置于40℃恒溫水浴中酶解75min后4000r/min離心10min，取上清液，測(cè)A680；發(fā)酵10d后，取上清液再次測(cè)A680。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 影響果膠酶對(duì)人參果果酒色澤變化的條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，再分別以pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間和果膠酶用量4個(gè)因素為響應(yīng)因素，以人參果果酒發(fā)酵前、后吸光度為響應(yīng)值(Y)，運(yùn)用SAS 9.2軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，研究果膠酶對(duì)人參果果酒釀造過程中色澤變化的影響，因素水平編碼見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and their coded levels in quadratic rotation-orthogonal composite design

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

單因素效應(yīng)圖形用DPS軟件繪制，二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶用量對(duì)人參果果酒色澤的影響

圖1 果膠酶用量對(duì)人參果果酒色澤的影響Fig.1 Effect of pectinase dosage on the absorbance at 680 nm of pepino juice and fruit wine

從圖1可以看出，無論發(fā)酵前后，人參果果酒吸光度均隨果膠酶用量增加逐漸變小，尤其是發(fā)酵后人參果果酒添加果膠酶組酒液明顯比未添加果膠酶組澄清透明，說明果酒添加果膠酶可以明顯起到酒液澄清的作用。當(dāng)果膠酶用量在0.3～0.5g/kg范圍內(nèi)時(shí)，人參果果酒發(fā)酵前吸光度變化幅度不大，沒有顯著性差異；但與空白不添加果膠酶組比護(hù)色效果明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可知添加果膠酶確實(shí)在一定程度上可以對(duì)果酒發(fā)酵前起到護(hù)色、具有防止其發(fā)生褐變的作用；而果膠酶用量在0.1～0.5g/kg時(shí)，人參果果酒吸光度變化幅度不大，但與空白不添加組相比澄清效果明顯。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本問題，果膠酶用量以選擇0.3g/kg較為適宜。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)人參果果酒色澤的影響

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)人參果果酒發(fā)酵前吸光度剛開始增幅變化很小，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，酶解75min后，吸光度逐漸增加，未發(fā)酵的果酒發(fā)生褐變，這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，增加了未發(fā)酵的人參果果汁中的多酚氧化酶與空氣接觸的機(jī)會(huì)，從而發(fā)生了酶促反應(yīng)生成了醌類物質(zhì)，因此人參果果酒發(fā)酵前色澤加深，吸光度增大；而人參果果酒發(fā)酵后吸光度出現(xiàn)先持平略有下降后又直線上升的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間為75min時(shí)，人參果果酒澄清效果最好。綜合考慮酶解時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)人參果榨汁工藝造成營(yíng)養(yǎng)損失，故酶解時(shí)間以75min較為合理。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)人參果果酒色澤的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the absorbance at 680 nm of pepino juice and fruit wine

2.3 酶解溫度對(duì)人參果果酒色澤的影響

圖3 酶解溫度對(duì)人參果果酒色澤的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the absorbance at 680 nm of pepino juice and fruit wine

由圖3可知，酶解溫度對(duì)人參果果酒發(fā)酵前后色澤有一定影響。人參果果酒發(fā)酵前后吸光度隨酶解溫度升高都呈開口向下的拋物線形狀，其最低點(diǎn)亦即透光率最大點(diǎn)分別出現(xiàn)在酶解溫度為35℃和30℃時(shí)，綜上，酶解溫度選擇30℃。此溫度比文獻(xiàn)[16-18]研究得到的酶解最適溫要低，原因可能為文獻(xiàn)[16-18]考察果膠酶對(duì)人參果出汁率的影響時(shí)分別以出汁率和可溶性固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)而得到的優(yōu)化結(jié)果，而本實(shí)驗(yàn)是以O(shè)D值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察的是果膠酶添加對(duì)人參果果酒釀造中發(fā)酵前后色澤的影響，因此適用的因素水平不同，出現(xiàn)的結(jié)論不同。但是這一溫度又與王鴻飛等[19]于浙江寧波研究果膠酶對(duì)草莓果汁澄清效果時(shí)得到的果膠酶最適溫度為35～45℃中的下值接近，從而得到了驗(yàn)證。

2.4 pH值對(duì)人參果果酒色澤的影響

pH值不僅影響果膠酶的穩(wěn)定性，而且還影響酶的活性中心必須基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)[16]。由圖4可知，不同pH值對(duì)人參果果酒發(fā)酵前后色澤的影響亦不盡相同。人參果果酒發(fā)酵前果汁隨pH值上升，其吸光度緩慢增加，當(dāng)pH5.0時(shí)，吸光度取得極大值，此時(shí)未發(fā)酵的果汁褐變最為嚴(yán)重，而此pH值與人參果打漿后自然pH值(pH5.6)最為接近，說明增加酸度可以明顯減輕人參果果酒發(fā)酵前褐變程度；pH值在3.0～4.5范圍內(nèi)人參果果酒發(fā)酵前吸光度變化不顯著，證明果膠酶在此pH值范圍內(nèi)對(duì)人參果果酒發(fā)酵前有較好的護(hù)色作用。發(fā)酵后人參果果酒吸光度隨pH值的增加呈開口向下的拋物線形狀，其吸光度在pH4.5處最高，在pH3.0處最小，說明pH值增加會(huì)降低人參果果酒的澄清效果，在pH3.0～4.0范圍內(nèi)人參果果酒吸光度變化不顯著，說明果膠酶在此pH值區(qū)間內(nèi)對(duì)人參果果酒具有很好的澄清作用。綜合考慮一方面此處pH值應(yīng)與果酒釀制時(shí)釀酒酵母的最適pH 3.8～6.0相統(tǒng)一，另外本研究發(fā)現(xiàn)pH值在3.0～4.0范圍內(nèi)雖然隨pH值下降人參果果酒發(fā)酵前后吸光度亦略有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)考慮果酒釀造過程中大量使用檸檬酸調(diào)酸不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還有可能對(duì)發(fā)酵后的風(fēng)味產(chǎn)生不利影響，綜上，pH值選擇4.0較為合理。

圖4 pH值對(duì)人參果果酒色澤的影響Fig.4 Effect of pH on the absorbance at 680 nm of pepino juice and fruit wine

2.5 果膠酶對(duì)人參果果酒色澤的影響因素參數(shù)水平優(yōu)化

響應(yīng)面分析是一種用于響應(yīng)變量(值)和處理因素之間建模的統(tǒng)計(jì)分析方法[20]。本試驗(yàn)使用SAS 9.2軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照四因素二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)方案，分別測(cè)定人參果果酒發(fā)酵前后的吸光度，結(jié)果見表2，試驗(yàn)結(jié)束后再使用該軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2.5.1 回歸模型的建立及方差分析

以果酒的pH值x1、酶解溫度x2、酶解時(shí)間x3、果膠酶用量x4為自變量，人參果果酒發(fā)酵前后吸光度為因變量Y，建立果膠酶不同參數(shù)水平處理后的人參果果酒護(hù)色與澄清作用模擬回歸模型。

表2 四元線性回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Quadratic rotation-orthogonal composite design and corresponding experimental results

2.5.1.1 果膠酶對(duì)人參果果酒護(hù)色作用初步回歸方程模型建立及方差分析

從表3方差分析可以看出，果膠酶酶解溫度、酶解時(shí)間的二次項(xiàng)、pH值和酶解溫度的交互項(xiàng)等對(duì)人參果果酒發(fā)酵前護(hù)色作用的影響均具有顯著性(P＜0.05)。對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，表明酶解溫度、酶解時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)人參果果酒護(hù)色作用影響呈正效應(yīng)，而果膠酶處理pH值和酶解溫度的交互項(xiàng)對(duì)人參果果酒護(hù)色作用影響為負(fù)效應(yīng)。其他變量影響均不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 果膠酶對(duì)人參果果酒護(hù)色作用二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the regression model for the absorbance at 680 nm of pepino juice

α＝0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的回歸方程為：Y＝1.35750＋0.18446x22＋0.20433x32－0.31100x1x2(2)

對(duì)表3中失擬項(xiàng)作F檢驗(yàn)，F(xiàn)1＝0.849＜F0.05(10,11)＝2.8655，說明失擬項(xiàng)在α＝0.05水平不顯著，可以進(jìn)一步考察回歸項(xiàng)對(duì)人參果果酒護(hù)色作用的影響。用統(tǒng)計(jì)量F2對(duì)回歸方程作F檢驗(yàn)，F(xiàn)2＝2.254＞F0.05(14,21)＝2.209，說明回歸方程在α＝0.05水平顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所采用的二次數(shù)學(xué)模型基本符合。二次回歸方程與實(shí)際情況擬合較好，可用于果膠酶不同工藝參數(shù)對(duì)人參果果酒護(hù)色作用影響的預(yù)測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

2.5.1.2 果膠酶對(duì)人參果果酒澄清作用初步回歸方程模型建立及方差分析

表4 果膠酶對(duì)人參果果酒澄清作用二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) of the regression model for the absorbance at 680 nm of pepino fruit wine

從表4方差分析可以看出，果膠酶用量的二次項(xiàng)以及pH值和酶解溫度的交互項(xiàng)對(duì)人參果果酒澄清作用具有顯著影響(P＜0.05)，其中果膠酶用量的二次項(xiàng)對(duì)人參果果酒澄清作用的影響具有極顯著性差異(P＜0.01)。對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，表明果膠酶用量的二次項(xiàng)對(duì)人參果果酒澄清影響呈正效應(yīng)，而pH值和酶解溫度的交互項(xiàng)對(duì)人參果果酒澄清作用的影響為負(fù)效應(yīng)。其他變量的影響均不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

對(duì)失擬項(xiàng)作F檢驗(yàn)，F(xiàn)1＝0.849＜F0.05(10,11)＝2.8655，說明失擬項(xiàng)在α＝0.05水平不顯著，可以繼續(xù)考察回歸項(xiàng)對(duì)人參果果酒澄清的影響。用統(tǒng)計(jì)量F2對(duì)回歸方程作F檢驗(yàn)，F(xiàn)2＝2.254＞F0.05(14,21)＝2.209，說明回歸方程在α＝0.05水平顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與所采用的二次數(shù)學(xué)模型基本上是符合的。二次回歸方程與實(shí)際情況擬合得較好，可用于果膠酶不同工藝參數(shù)對(duì)人參果果酒澄清影響的預(yù)測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

2.5.2 果膠酶對(duì)人參果果酒釀造中色澤變化影響的條件優(yōu)化

2.5.2.1 果膠酶對(duì)人參果果酒發(fā)酵前護(hù)色作用影響的條件優(yōu)化

固定其他3個(gè)因素于零水平，求第4個(gè)因素與因變量的回歸方程，根據(jù)這些方程得到4個(gè)因素對(duì)人參果果酒發(fā)酵前色澤影響的關(guān)系曲線，用DPS軟件繪制單因素效應(yīng)圖形，如圖5所示。

圖5 單因素效應(yīng)與人參果果酒發(fā)酵前吸光度關(guān)系圖Fig.5 Single-factor multi-level analysis of the effects of four pectinase treatment conditions on the absorbance at 680 nm of pepino juice

由圖5可以看出，除果膠酶用量外，其余3因素與人參果果酒發(fā)酵前吸光度間均呈開口向上的拋物線關(guān)系，即吸光度隨著果酒的pH值、果膠酶酶解溫度和酶解時(shí)間的增加，人參果果酒發(fā)酵前吸光度呈先降后升的趨勢(shì)，其護(hù)色最佳點(diǎn)出現(xiàn)在－0.500～0.500水平之間；而果膠酶用量對(duì)人參果果酒發(fā)酵前護(hù)色作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。

固定兩個(gè)因素于零水平，研究其他兩個(gè)因素間的交互效應(yīng)，用SAS 9.2軟件制作出響應(yīng)面圖和等高線圖(圖6)。

圖6 果膠酶對(duì)人參果果酒發(fā)酵前吸光度影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of four pectinase treatment conditions on the absorbance at 680 nm of pepino juice

從果酒的pH值(x1)與酶解溫度(x2)響應(yīng)面和等高線圖(圖6a)可以看出，二者交互作用極為顯著，在酶解溫度處于－2.0000水平時(shí)，隨pH值降低，吸光度亦降低，二者呈正相關(guān)；之后，隨著酶解溫度水平升高，當(dāng)pH值再下降時(shí)吸光度呈先降再升直至線性增加的趨勢(shì)，人參果果酒發(fā)酵前吸光度極小值點(diǎn)隨酶解溫度水平增加逐漸向pH值極大水平處移動(dòng)；并最終出現(xiàn)在pH值與酶解溫度均處于最大水平2.0000處或者均處于最小水平－2.0000處，其中當(dāng)二者均處于最低水平－2.0000時(shí)人參果果酒發(fā)酵前吸光度取得最小值；從等高線圖可以看出，過程對(duì)酶解溫度的變化比對(duì)果酒的pH值的變化更為敏感(圖6a)；從酶解溫度(x2)和酶解時(shí)間(x3)的響應(yīng)面和等高線圖(圖6b)可以看出，二者交互效應(yīng)不很顯著，最優(yōu)點(diǎn)十分接近于酶解溫度29℃和酶解時(shí)間75min，并在這兩點(diǎn)附近取得最小值；從等高線圖可以看出，過程對(duì)酶解溫度的變化比對(duì)酶解時(shí)間的變化更為敏感(圖6b)；從酶解溫度(x2)和果膠酶用量(x4)的響應(yīng)面和等高線圖(圖6c)可以明顯看出，其交互效應(yīng)很顯著，最優(yōu)點(diǎn)十分接近于酶解溫度29℃和果膠酶用量0.3g/kg，并在這兩點(diǎn)附近取得最小值；從等高線圖可以看出，過程對(duì)酶解溫度的變化比對(duì)果膠酶用量的變化稍為敏感(圖6c)。

2.5.2.2 果膠酶對(duì)人參果果酒發(fā)酵后澄清作用影響的條件優(yōu)化

圖7 單因素效應(yīng)與人參果果酒吸光度關(guān)系圖Fig.7 Single-factor multi-level analysis of the effects of four pectinase treatment conditions on the absorbance at 680 nm of pepino fruit wine

圖8 果膠酶對(duì)人參果果酒吸光度影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the effects of four pectinase treatment conditions on the absorbance at 680 nm of pepino fruit wine

由圖7可以看出，果膠酶用量與人參果果酒澄清度間呈開口向上的拋物線關(guān)系，人參果果酒澄清最佳點(diǎn)出現(xiàn)在－1.000～0.500水平之間；酶解溫度與人參果果酒澄清度呈線性關(guān)系，隨酶解溫度升高，人參果果酒吸光度下降，澄清度上升，二者呈正相關(guān)；而pH值、酶解時(shí)間對(duì)人參果果酒吸光度無統(tǒng)計(jì)學(xué)影響。

從pH值(x1)與酶解時(shí)間(x3)響應(yīng)面和等高線圖(圖8a)可以看出，二者交互作用極為顯著，最優(yōu)點(diǎn)十分接近于pH4.25和酶解時(shí)間60min，并在這兩點(diǎn)附近取得最小值；從等高線圖可以看出，過程對(duì)pH值的變化比對(duì)酶解時(shí)間的變化更為敏感(圖8a)；從pH值(x1)和果膠酶用量(x4)的響應(yīng)面和等高線圖(圖8b)可以看出，其交互效應(yīng)比較顯著，最優(yōu)點(diǎn)十分接近于pH4.6和果膠酶用量0.3g/kg，并在這兩點(diǎn)附近取得最小值；從等高線圖可以看出，過程對(duì)果膠酶用量的變化比對(duì)pH值的變化更為敏感(圖8b)；從酶解溫度(x2)和果膠酶用量(x4)的響應(yīng)面和等高線圖(圖8c)可以明顯看出，二者交互效應(yīng)很顯著，最優(yōu)點(diǎn)十分接近于酶解溫度32.4℃和果膠酶用量0.3g/kg，并在這兩點(diǎn)附近取得最小值；從等高線圖可以看出，過程對(duì)果膠酶用量的變化比對(duì)酶解溫度的變化更為敏感(圖8c)。響應(yīng)面的繪制進(jìn)一步驗(yàn)證表3、4方差分析的結(jié)論。

從圖6和圖8響應(yīng)面圖還可以看出，果酒的不同pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間與果膠酶用量的二次響應(yīng)面出現(xiàn)鞍面，無極值的存在，因此不能直接從二次響應(yīng)面上找出最佳影響因素參數(shù)，需進(jìn)一步作嶺脊分析(ridge analysis)[21-22]。在上述回歸模型中回歸系數(shù)出現(xiàn)負(fù)值也是由于存在“共線性”，即自變量之間存在相互影響，從而導(dǎo)致影響力系數(shù)失真的緣故。

2.5.3 嶺脊分析

2.5.3.1 影響果膠酶對(duì)人參果果酒護(hù)色的條件嶺脊分析

表5 影響果膠酶對(duì)人參果果酒護(hù)色的條件嶺脊分析Table 5 Ridge analysis for the absorbance at 680 nm of pepino juice with various pectinase treatment conditions

從表5嶺脊分析可以看出，當(dāng)編碼半徑為1.0時(shí)響應(yīng)值Y最小，約為1.22，此時(shí)果酒的pH4.6，果膠酶酶解溫度32℃，酶解時(shí)間63min，用量0.3g/kg。

2.5.3.2 影響果膠酶對(duì)人參果果酒澄清的條件的嶺脊分析

表6 影響果膠酶對(duì)人參果果酒澄清的條件嶺脊分析Table 6 Ridge analysis for the absorbance at 680 nm of pepino fruit wine with various pectinase treatment conditions

從表6嶺脊分析可以看出，當(dāng)編碼半徑為1.0時(shí)響應(yīng)值Y最小，約為0.23，此時(shí)果酒的pH4.0、果膠酶酶解溫度30℃、酶解時(shí)間55min、用量0.316g/kg。

2.5.4 優(yōu)化參數(shù)試驗(yàn)驗(yàn)證

在人參果果酒最佳護(hù)色工藝參數(shù)及人參果果酒最佳澄清工藝條件下對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，取其平均值，所得吸光度分別為1.218和0.236，3次實(shí)驗(yàn)的平均誤差均小于0.05%，RSD分別為1.43%和2.36%，與優(yōu)化目標(biāo)值非常接近。因此，進(jìn)一步驗(yàn)證了所得回歸模型和最佳工藝參數(shù)可用于指導(dǎo)人參果果酒生產(chǎn)實(shí)際的結(jié)論。

3 討 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用嶺脊分析對(duì)人參果果酒護(hù)色及澄清兩道工藝的影響因素加以分析，不僅減小了多元共線性的效應(yīng)，而且由于所獲得的嶺回歸系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)，因此可通過它們更直觀地比較果膠酶不同工藝參數(shù)對(duì)人參果果酒護(hù)色與澄清作用影響的大小。

3.2 由于中心組合設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，加之設(shè)計(jì)時(shí)加入了中心點(diǎn)處理較多，所得數(shù)據(jù)處理量較大；同時(shí)嶺脊分析又較一般的回歸分析計(jì)算量大得多，因此本研究使用SAS 9.2軟件輔以DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以實(shí)現(xiàn)多元嶺回歸，從而確定了與人參果果酒護(hù)色與澄清作用有關(guān)的果膠酶的重要工藝參數(shù)，獲得了較為可靠的分析結(jié)果。

3.3 果膠酶之所以可以提高出汁率、澄清酒液是因?yàn)樗梢苑纸庵参锛?xì)胞壁上的多聚糖類基質(zhì)以及細(xì)胞間層的部分原果膠和纖維素，使果蔬汁自流量增加[23]，也可以將果膠分解成果膠酸小分子物質(zhì)[24]，同時(shí)盡可能在發(fā)酵前將果汁中的雜質(zhì)減少到最低限度，避免果汁在貯存過程中酒石結(jié)晶沉淀或無定形的色素微粒自行沉淀出來以及出現(xiàn)蛋白質(zhì)渾濁、微生物渾濁等不良現(xiàn)象，或者控制果汁中的浸漬作用、脫去果膠[25]，穩(wěn)定其中色素，從而達(dá)到提高農(nóng)產(chǎn)品出汁率、穩(wěn)定色澤、增加透光率進(jìn)而提高商品的商業(yè)價(jià)值的目的。但是目前關(guān)于果膠酶護(hù)色方面的研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從護(hù)色和澄清兩個(gè)角度考察果膠酶對(duì)人參果果酒發(fā)酵前后色澤的影響，為排除添加二氧化硫?qū)瓢l(fā)酵前的護(hù)色作用的干擾，故實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)將二氧化硫的添加由以往常規(guī)的打漿時(shí)添加，改成了果膠酶處理后過濾完果汁，獲得所有數(shù)據(jù)之后再進(jìn)行添加，所以減少了二氧化硫護(hù)色作用對(duì)果膠酶作用的干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加果膠酶組人參果果酒發(fā)酵前色澤明顯與初榨汁后色澤接近，而不添加果膠酶組則發(fā)生了顯著的褐變，說明果膠酶的添加對(duì)人參果果酒發(fā)酵前在一定程度上具有護(hù)色作用，這可能是因?yàn)楣z酶的添加使得它與人參果果酒未發(fā)酵時(shí)的多酚氧化酶發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，從而影響了多酚氧化酶的生物活性，進(jìn)而降低了人參果果酒未發(fā)酵時(shí)發(fā)生酶促反應(yīng)的機(jī)率，因此對(duì)人參果果酒發(fā)酵前起到了一個(gè)護(hù)色作用的緣故，但其具體機(jī)理如何有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

4.1 通過4因素5水平二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，用SAS 9.2軟件和DPS軟件進(jìn)行回歸分析和響應(yīng)面分析，建立了果膠酶對(duì)人參果果酒護(hù)色與澄清作用的影響與果酒的pH值、果膠酶酶解溫度、酶解時(shí)間、用量變化關(guān)系的回歸模型。從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，果膠酶酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)人參果果酒護(hù)色作用影響顯著(P＜0.05)，果膠酶用量對(duì)人參果果酒澄清作用影響顯著(P＜0.05)，而果酒的pH值對(duì)二者影響均不顯著(P＞0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該回歸模型的建立擬合性較好，說明可以將其用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

4.2 通過回歸建模及方差分析可知，果膠酶對(duì)人參果果酒護(hù)色與澄清作用的影響因素間存在多重共線性，故本試驗(yàn)使用多元回歸分析。

4.3 嶺脊分析可對(duì)多重共線性資料有較好的處理。本實(shí)驗(yàn)采用多元嶺回歸技術(shù)，確認(rèn)果酒的pH值及果膠酶酶解溫度、酶解時(shí)間和用量對(duì)人參果果酒護(hù)色及澄清起重要作用。其中人參果果酒護(hù)色最佳參數(shù)為果酒pH4.6、果膠酶酶解溫度32℃、酶解時(shí)間63min、用量0.3g/kg；人參果果酒澄清最佳條件為果酒的pH4.0、果膠酶酶解溫度30℃、酶解時(shí)間55min、用量0.316g/kg。

4.4 在人參果果酒最佳護(hù)色工藝參數(shù)及人參果果酒最佳澄清工藝條件下對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，取其平均值，所得吸光度分別為1.218和0.236，3次實(shí)驗(yàn)的平均誤差均小于0.05%，RSD分別為1.43%和2.36%，與優(yōu)化目標(biāo)值非常接近。

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Response Surface Methodology for Optimization of Pectinase Treatment for Improved Clarification of Pepino Juice and Fruit Wine

SU Feng-xian1，ZHANG Bai-gang2，GOU Ya-feng1，TAO Jun1，SANG Ya-lan1，ZHANG Fen-qin1,*
(1. College of Agriculture and Biotechnology, Hexi University, Zhangye 734000, China；
2. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

Pepino puree was treated with pectinase and centrifuged and the supernatant (fruit juice) was fermented for 10 days to make pepino fruit wine. Response surface methodology was used to optimize four pectinase treatment conditions such as pectinase dosage, time, temperature and pH for achieving the best colorization of pepino juice and fruit wine. On the basis of one-factor-at-a-time experiments, a three-level quadratic rotation-orthogonal composite design was used to set up regression models that describe the effects of these treatment conditions on the absorbance at 680 nm of pepino juice and fruit wine.Hydrolysis temperature and time had a significant effect on the absorbance at 680 nm of pepino juice (P＜0.05), and pectinase dosage significantly affected the absorbance at 680 nm of pepino juice (P＜0.05), but neither of them was significantly affected by pH (P＞0.05). The optimal pectinase treatment conditions determined by ridge analysis for pepino juice and fruit wine were pH 4.6 and 4.0, treatment temperature 32 ℃ and 30 ℃, treatment time 63 min and 55 min, and pectinase dosage 0.3 g/kg and 0.316 g/kg, respectively. The multiple regression analysis indicated the established regression models could fit the relationship between various pectinase treatment conditions and the absorbance at 680 nm of pepino juice and fruit wine very well.

pectinase；wine；response surface methodology(RSM)；ridge analysis；color

TS262.7；Q814

A

1002-6630(2011)16-0049-09

2010-10-29

蘇鳳賢(1974—)，女，講師，碩士，主要從事食品生物技術(shù)與研究。E-mail：supeiecho@sina.com

*通信作者：張芬琴(1963—)，女，教授，博士，主要從事生化與生物技術(shù)與研究。E-mail：fenqinzh@hxu.edu.cn