高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度評(píng)定

霍艷敏，王艷麗，王 駿，周莉莉，祝建華，張 卉，薛 霞

(山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(山東)，山東 濟(jì)南 250103)

高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度評(píng)定

霍艷敏，王艷麗，王 駿，周莉莉，祝建華，張 卉，薛 霞

(山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(山東)，山東 濟(jì)南 250103)

建立高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中煙酰胺不確定度的數(shù)學(xué)模型，并根據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》和JJF 1059—1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》中的有關(guān)規(guī)定，逐層對(duì)乳粉中煙酰胺測(cè)量不確定度來(lái)源進(jìn)行評(píng)估，最后給出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度；嬰幼兒乳粉中煙酰胺測(cè)定結(jié)果為(63.01±3.50)mg/kg，k=2，p=95%。通過(guò)評(píng)定，提出影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素為樣品前處理過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等。

不確定度；煙酰胺；嬰幼兒乳粉；高效液相色譜法

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性、與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[1]。測(cè)量不確定度的大小反映了測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的高低，并直接與檢驗(yàn)結(jié)果的合格判定相關(guān)，因此完整的測(cè)量結(jié)果表示應(yīng)該包括測(cè)量不確定度。煙酰胺是嬰幼兒乳粉中重要的營(yíng)養(yǎng)成分，它與蛋白質(zhì)的代謝及兒童智力發(fā)育關(guān)系極大。GB2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[2]規(guī)定煙酰胺在嬰兒配方食品和較大嬰兒和幼兒配方食品中的限量為3～26mg/100g。為了保證嬰幼兒乳粉中煙酰胺的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)JJF 1059—1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[1]和JJF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[3]對(duì)煙酰胺測(cè)量過(guò)程不確定度的各個(gè)分量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并給出擴(kuò)展不確定度，以期使該不確定度的給出可以作為改善煙酰胺測(cè)量程序，提高測(cè)量精密度和準(zhǔn)確性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市場(chǎng)隨機(jī)抽查的嬰兒奶粉。

煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99.5%) 德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；七氟丁酸 美國(guó)Alfa公司；甲醇(色譜純)；磷酸二氫鉀(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司；AB204-S電子天平(感量0.0001g) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ5200超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；pHS型酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠。

1.3 樣品處理

按照GB 5413.15—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定》[4]進(jìn)行。

1.4 色譜條件

色譜柱：Atlantis C18柱(25cm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇:50mmol/L磷酸二氫鉀-0.4mmol/L七氟丁酸=5:95(V/V)[5]；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。

1.5 煙酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算

式中：X為樣品中煙酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg/kg)；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣中煙酰胺的質(zhì)量濃度/(mg/L)；m為樣品質(zhì)量/g；V為樣品測(cè)試液定溶體積/mL；r為加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來(lái)源分析

從測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，煙酰胺含量測(cè)定的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作曲線的擬合、樣品稱量、定容體積、樣品的制備和測(cè)試過(guò)程的差異等幾個(gè)方面[6-9]。

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及配制過(guò)程引入的相對(duì)不確定度

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，煙酰胺的不確定度為0.5%，包含因子k＝2，屬B類評(píng)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)不確定度

(1) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制的過(guò)程是精確稱取25.00mg煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加水溶解并定容至25mL容量瓶。根據(jù)稱量使用的電子天平檢定證書，其最大允許誤差0.5mg，重復(fù)性誤差0.1mg，一般采用矩形分布，包含因子為，屬B類評(píng)定。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中玻璃器具校準(zhǔn)引入的相對(duì)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中使用了一系列玻璃器具，按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量具檢定規(guī)程》[10]的要求，均有相應(yīng)的最大允差。按均勻分布處理，k＝計(jì)算不確定度分量。玻璃量具校準(zhǔn)的不確定度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中玻璃器具校準(zhǔn)引入的不確定度Table 1 Uncertainty resulting from the errors during the calibration of volumetric flasks and pipettes for standard solution preparation

由表1中的數(shù)據(jù)合成的相對(duì)不確定度為：

(3) 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程溫度變化引入的相對(duì)不確定度

玻璃器具在20℃進(jìn)行校正，而實(shí)驗(yàn)室的溫度一般為(20±5)℃，由溫度波動(dòng)引起的不確定度可通過(guò)估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，液體的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)高于玻璃的膨脹系數(shù)，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略。標(biāo)準(zhǔn)工作液是用水稀釋配制，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)，假設(shè)溫度變化為矩形分布，即k＝。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中溫度變化引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from temperature change during standard solution preparation

由表2數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身、天平、玻璃器具校準(zhǔn)和溫度變化的不確定度分量合成標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對(duì)不確定度

配制質(zhì)量濃度分別為0.995、2.49、4.98、9.95μg/mL的煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度水平平行測(cè)量3次，用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-峰面積曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表3。

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線方程為：y＝1.53×104x－1.55×103(式中，y為峰面積、x為煙酰胺含量、b＝1.53×104、a＝1.55×103，相關(guān)系數(shù)為0.9998)。

乳粉樣品經(jīng)測(cè)定6次后，由線性方程得到測(cè)試液中煙酰胺質(zhì)量濃度(c)為2.510μg/mL，由擬合曲線求c時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：SR為從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的峰面積Y與相應(yīng)測(cè)得的峰面積Yi之差所求出的標(biāo)準(zhǔn)偏差；m為樣品溶液的測(cè)定總次數(shù)，此處m為6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定總次數(shù)，此處n為12；c為樣品中煙酰胺質(zhì)量濃度的平均值；c0為標(biāo)準(zhǔn)溶液中煙酰胺質(zhì)量濃度的平均值：ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液中煙酰胺的質(zhì)量濃度。

2.2.3 乳粉重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)不確定度

表4 乳粉樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果Table 4 Replicate determination results of nicotinamide in infant formula milk powder

乳粉樣品重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見表4。通過(guò)重復(fù)測(cè)量樣品進(jìn)行評(píng)定，它包含試樣前處理過(guò)程、使用器皿、儀器及進(jìn)樣量的不確定度，根據(jù)JJF 1135—2005的規(guī)定，該不確定度屬A類評(píng)定。所測(cè)結(jié)果X平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uX采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(X)表征。計(jì)算公式如下：

2.2.4 樣品前處理過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.4.1 樣品稱量引入的相對(duì)不確定度

稱取2.0g(精確到0.0001g)樣品，由此引起的相對(duì)不確定度為：

2.2.4.2 樣品定容引入的相對(duì)不確定度

樣品經(jīng)過(guò)處理使用50mL容量瓶定容，其最大允許誤差為±0.05，按均勻分布，容量瓶檢定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。因容量瓶在使用和校準(zhǔn)時(shí)存在溫度波動(dòng)，一般為±5℃，按均勻分布，由此產(chǎn)生的不確定度為5×50×2.1×10-4÷ 3÷50＝6.06×10-4。

由定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4.3 添加回收率引入的相對(duì)不確定度[11]

樣品前處理過(guò)程中煙酰胺存在損失，通過(guò)樣品添加煙酰胺計(jì)算回收率，5次樣品添加回收率的結(jié)果分別為92.3%、92.0%、98.1%、98.3%、102.0%，平均回收率為r=96.54%，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為00.043，標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

為了確定回收率是否歸入煙酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)學(xué)模型的計(jì)算中，需對(duì)回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)：

結(jié)果P＝0.95、f＝4時(shí)，t0.05,4=2.78。由于t＜t0.05,4，說(shuō)明r與1無(wú)顯著差異，r值不必使用。

因此，由樣品處理過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

2.2.5 分析儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

該高效液相色譜儀的定量重復(fù)性(以RSD表示)為1.1%，測(cè)定值一般為對(duì)稱分布，則：

2.3 乳粉中煙酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度來(lái)源匯總

表5 乳粉中煙酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度來(lái)源匯總表Table 5 List of relative standard uncertainties for nicotinamide determination of infant formula milk powder

根據(jù)2.2節(jié)結(jié)果得到乳粉中煙酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度來(lái)源見表5。

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)前述結(jié)果，得到高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中煙酰胺的不確定度為：

2.5 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF 1135—2005，對(duì)于大多數(shù)測(cè)量，采用置信概率p＝95%、包含因子k=2衡量，則擴(kuò)展不確定度為u＝uf×2＝3.50mg/kg。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)影響乳粉中煙酰胺測(cè)定不確定度各分量的評(píng)價(jià)，可見測(cè)定過(guò)程中對(duì)不確定度貢獻(xiàn)最大的是樣品前處理過(guò)程、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過(guò)程，今后應(yīng)在這幾方面加以改進(jìn)，以進(jìn)一步提高檢測(cè)質(zhì)量。嬰幼兒乳粉中煙酰胺測(cè)定結(jié)果為(63.01±3.50)mg/kg，k＝2，p＝95%。

[1] JJF 1059—1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].

[2] GB 2760—2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3] JJF 1135—2005化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定[S].

[4] GB 5413.15—2010嬰幼兒食品和乳品中煙酸和煙酰胺的測(cè)定[S].

[5] 劉娜, 陳大舟, 湯樺, 等. 嬰兒配方奶粉中8種水溶性維生素的高效液相色譜同時(shí)測(cè)定[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2008, 27(4): 408-411.

[6] 蔡秋, 朱明. 高效液相色譜法測(cè)定茶飲料中苯甲酸結(jié)果不確定度評(píng)定[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(2): 277-280.

[7] 楊洋, 徐春祥, 車文軍. 高效液相色譜法測(cè)定乳粉中的三聚氰胺及其不確定度分析[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 250-253.

[8] 戚榮平. 高效液相色譜儀測(cè)定醬油中苯甲酸的不確定度[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué), 2006, 18(2): 封三-封四.

[9] 汪輝, 曹小彥, 胡朝暉. 高效液相色譜法測(cè)定小麥粉與大米粉中甲醛次硫酸氫鈉含量的不確定度評(píng)定[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(12): 205-208.

[10] JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].

[11] 嚴(yán)鳳, 張文剛, 李丹妮. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量不確定度分析[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2008(5):32-33.

Uncertainty Evaluation for Nicotinamide Determination in Infant Formula Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography

HUO Yan-min，WANG Yan-li，WANG Jun，ZHOU Li-li，ZHU Jian-hua，ZHANG Hui，XUE Xia
(National Center for Quality Supervision and Inspection of Processed Food (Shandong), Shandong Supervision and Inspection Institute for Product Quality, Jinan 250103, China)

A mathematical model was established to evaluate the uncertainty of determining nicotinamide in infant formula milk powder by high performance liquid chromatography with diode-array detection. According to the relevant regulations given in JJF 1135-2005Evaluation ofUncertaintyinChemical Analysis Measurementand JJF 1059－1999EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement, the sources of uncertainty for determining nicotinamide in infant formula milk powder were explored. Finally, the standard uncertainty and the expanded uncertainty were achieved. The content of nicotinamide in infant formula milk powder determined by HPLC was (63.01 ± 3.50) mg/kg. The major sources of uncertainty affecting determination results were pre-treatment, standard solution and standard curve fitting.

uncertainty；nicotinamide；infant formula milk powder；high performance liquid chromatography(HPLC)

O657.72

A

1002-6630(2011)16-0330-04

2010-11-10

霍艷敏(1981—)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)。E-mail：huoyanmin0628@163.com