四角蛤蜊多糖脫蛋白方法比較

張 坤，吳 皓,*，王令充，葛 瑩，曹 楊

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省海洋藥物研究開發(fā)中心，江蘇 南京 210029)

四角蛤蜊多糖脫蛋白方法比較

張 坤1,2，吳 皓1,2,*，王令充1,2，葛 瑩1，曹 楊1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省海洋藥物研究開發(fā)中心，江蘇 南京 210029)

目的：優(yōu)選出四角蛤蜊粗多糖脫蛋白的方法，并對(duì)脫蛋白后的產(chǎn)物進(jìn)行含量測(cè)定和活性驗(yàn)證。方法：通過離子交換法、三氯乙酸(TCA)法、絮凝法及鹽析法分別對(duì)四角蛤蜊粗多糖進(jìn)行脫蛋白，比較各種方法的脫蛋白效果。結(jié)果：離子交換法、TCA法、鹽析法脫蛋白效果都較理想，所得除蛋白多糖總糖含量分別為85%、90.96%、83%，絮凝法不適合對(duì)四角蛤蜊粗多糖中蛋白質(zhì)的去除，活性實(shí)驗(yàn)表明TCA法和離子交換法所得樣品降血糖活性較好，其中TCA法所得樣品與模型對(duì)照組比較有顯著性差異，P＜0.05。結(jié)論：優(yōu)選方法合理可行。

四角蛤蜊粗多糖；脫蛋白；活性

隨著多糖研究領(lǐng)域不斷出現(xiàn)新的多糖和發(fā)現(xiàn)已知多糖的新功效，海洋多糖也越來越受到重視，這是由于海洋多糖具有來源豐富性、種類多樣性和結(jié)構(gòu)特殊性等特點(diǎn)。有專家指出：海洋多糖可能成為克服某些疑難病癥的突破點(diǎn)，并且具有開發(fā)成為保健食品應(yīng)用在食品衛(wèi)生領(lǐng)域的潛力。四角蛤蜊(Mactra veneriformis)屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)，瓣鰓綱(Lamellibranchia)，真瓣鰓目(Eulamellibranchia)，蛤蜊科(Mactridae)[1]，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是沿海地區(qū)常見的食用貝類。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為蛤蜊肉味咸、性寒，歸胃、肝、膀胱經(jīng)，滋陰、利水、化痰、軟堅(jiān)，主治消渴、酒毒、水腫、痰積、癭瘤等[2]；現(xiàn)代研究報(bào)道，四角蛤蜊具有降血糖的功用[3]，其主要功效成分為多糖，可采用水提醇沉的工藝制備四角蛤蜊多糖，但水提醇沉物為多糖和蛋白的混合物，且不同年份、不同季節(jié)的四角蛤蜊多糖含量有所不同，有些年份和季節(jié)所產(chǎn)多糖含量較低，需要對(duì)其進(jìn)行脫蛋白的操作，以提高其多糖含量。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用不同工藝對(duì)四角蛤蜊粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，得到較精多糖進(jìn)行腎上腺素誘發(fā)高血糖模型小鼠血糖影響的活性驗(yàn)證和比較，以期得到活性較好的四角蛤蜊多糖提取物，并優(yōu)選出脫蛋白的最佳方法，從而更好的用于保健品的研究開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四角蛤蜊粗多糖 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所；732陽(yáng)離子交換樹脂(批號(hào)：20080918)、三氯乙酸(批號(hào)：F20081104)、α-萘酚(批號(hào)：T20050930) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨(批號(hào)：09092960578) 南京化學(xué)試劑有限公司；透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～10000) 美國(guó)Millipore公司；鹽酸二甲雙胍片(批號(hào)：0708212) 深圳市中聯(lián)制藥有限公司；鹽酸腎上腺素注射液(批號(hào)：100106) 上海禾豐制藥有限公司；PEG-6000(批號(hào)：71208) 成都市科龍化工試劑廠；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752-型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；FA1104型電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；202型電熱恒溫干燥箱 上海索譜儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Rotavapor R114薄膜旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；J-25型高效冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；Glucocard G meter GT1810型血糖儀(附加血糖試紙條) 日本Arkray公司。

1.3 脫蛋白實(shí)驗(yàn)

1.3.1 離子交換法[4]

稱取一定量的732陽(yáng)離子交換樹脂，浸泡于水中，漂去異物，反復(fù)數(shù)次，待浸泡充分后裝柱，以酸堿酸法處理后，蒸餾水沖洗至中性。稱取0.8g四角蛤蜊粗多糖，用5mL蒸餾水溶解，緩緩沿壁均勻上樣。以蒸餾水洗脫，流速1.0mL/min，每10min收集一管，逐管檢測(cè)A580nm(多糖的硫酸蒽酮衍生物的吸收峰)、A280nm(蛋白質(zhì)吸收峰)處峰。收集含糖部分，調(diào)節(jié)洗脫液pH值至7.0，70℃減壓薄膜旋轉(zhuǎn)濃縮。濃縮液中加入95%乙醇至含醇量達(dá)80%，邊加邊攪拌，冷藏靜置12h。將醇沉物減壓抽濾，濾餅以無水乙醇洗滌，60℃減壓干燥，即得去除大部分蛋白的較精多糖。

1.3.2 TCA法[5-7]

取一定量的四角蛤蜊粗多糖粉末，用蒸餾水分別配制成20、33、50mg/mL的多糖溶液，逐滴加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液，邊加邊搖勻，充分震蕩，置于4℃靜置4h以上，6000r/min離心20min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液調(diào)至pH7，加入95%乙醇至含醇量達(dá)80%，邊加邊攪拌，冷藏靜置12h；將醇沉物減壓抽濾，濾餅以無水乙醇洗滌，60℃減壓干燥，所得較精多糖用硫酸蒽酮法檢測(cè)其總糖含量。將所得較精多糖用50倍水溶解，自來水透析24h，蒸餾水透析24h，透析液加入95%乙醇至含醇量達(dá)80%，邊加邊攪拌，冷藏靜置12h；將醇沉物減壓抽濾，濾餅以無水乙醇洗滌，60℃減壓干燥，用硫酸蒽酮法檢測(cè)其總糖含量。

1.3.3 絮凝法[8-10]

取一定量的四角蛤蜊粗多糖粉末，用蒸餾水分別配制成25mg/mL多糖溶液，離心取上清液，分別加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、20%、40% PEG-6000溶液，邊加邊搖勻，攪拌10min，靜置4h以上。6000r/min離心20min，沉淀利用Molish反應(yīng)檢測(cè)是否含有糖類成分，上清液加入95%乙醇至含醇量達(dá)80%，邊加邊攪拌，冷藏靜置12h。將醇沉物減壓抽濾，上清液用Molish反應(yīng)檢測(cè)是否含糖類成分，濾餅以無水乙醇洗滌，60℃減壓干燥，用硫酸蒽酮法檢測(cè)其總糖含量。

1.3.4 鹽析法[11-13]

取一定量的四角蛤蜊粗多糖粉末，用蒸餾水分別配制成20mg/mL多糖溶液，離心取上清液，分別緩緩加入不同量研細(xì)的的硫酸銨細(xì)粉，至硫酸銨飽和度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，邊加邊搖勻，攪拌，4℃靜置過夜，6000r/min離心20min，上清液透析72h。透析液加入95%乙醇至含醇量達(dá)80%，邊加邊攪拌，冷藏靜置12h。將醇沉物減壓抽濾，濾餅以無水乙醇洗滌，60℃減壓干燥，用硫酸蒽酮法檢測(cè)其總糖含量。

1.4 四角蛤蜊粗多糖對(duì)腎上腺素誘發(fā)高血糖模型小鼠血糖的影響[14-15]

取正常小鼠60只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組 (250mg/kg)、1號(hào)樣品組(400mg/kg)、2號(hào)樣品組(400mg/kg)和3號(hào)樣品組(400mg/kg)。二甲雙胍可直接作用于動(dòng)物離體灌注肝臟或肝細(xì)胞，使其利用多種底物進(jìn)行糖異生作用減少，從而降低動(dòng)物體內(nèi)的血糖值。各組藥物臨用前用蒸餾水配制成所需濃度，再按上述劑量灌胃給藥，空白組給予溶劑。每天1次，共10d。末次給藥后禁食3h(不禁水)，正常對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，其余5組均腹腔注射鹽酸腎上腺素250μg/kg，注射30min后，各組小鼠取尾靜脈血用血糖儀測(cè)定血糖值。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子交換法

圖1 離子交換法洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude polysaccharide from Mactra veneriformis on type 732 cation exchange resin

初步純化的四角蛤蜊多糖，通過732陽(yáng)離子交換樹脂柱進(jìn)一步分離，蒸餾水洗脫，自動(dòng)收集餾分，逐管檢測(cè)，如圖1所示，多糖和蛋白質(zhì)最高吸收峰重合，推測(cè)四角蛤蜊粗多糖可能含有多糖、蛋白質(zhì)及多糖蛋白復(fù)合物；所得較精多糖用硫酸-蒽酮法檢測(cè)總糖含量為85%，得率為27.16%，糖轉(zhuǎn)移率為81.97%，效果較為理想，編號(hào)為1號(hào)樣品。

表1 TCA法脫蛋白結(jié)果表Table 1 Effect of substrate concentration and operation number on deproteinization of crude polysaccharide from Mactra veneriformis by TAC method

2.2 TCA法

如表1所示，隨著粗多糖底物質(zhì)量濃度的降低和脫蛋白次數(shù)的增加，多糖的總糖含量不斷增加，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為33mg/mL，脫蛋白3次后，總糖含量可達(dá)68.00%，糖轉(zhuǎn)移率達(dá)93.37%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為20mg/mL，脫蛋白1次，總糖含量可達(dá)64.48%，糖轉(zhuǎn)移率達(dá)91.37%，將此多糖復(fù)溶透析48h后所得多糖總糖含量可高達(dá)90.96%，效果較為理想，編號(hào)為2號(hào)樣品。

表2 PEG法脫蛋白現(xiàn)象表Table 2 Effect of PEG-6000 on Molish reaction phenomena

表3 PEG法脫蛋白結(jié)果表Table 3 Effects of PEG-6000 and substrate concentration on protein removal

2.3 絮凝法

由表2可知，10% PEG-6000溶液能使大部分蛋白質(zhì)和部分多糖沉淀，20%和40% PEG-6000能使大部分蛋白質(zhì)和大部分多糖都沉淀，由表3結(jié)果可知PEG-6000不適用于四角蛤蜊粗多糖中蛋白質(zhì)的沉降，原因可能是其能同時(shí)使大分子的多糖和蛋白質(zhì)同時(shí)沉降下來，而難以分離。

表4 鹽析法脫蛋白結(jié)果表Table 4 Effects of substrate concentration and degree of saturation of ammonium sulphate on protein removal

2.4 鹽析法

由表4可知，隨著硫酸銨飽和度的增加，四角蛤蜊多糖的總糖含量隨之增加，但多糖得率和轉(zhuǎn)移率下降；當(dāng)飽和度達(dá)到90%以上時(shí)，四角蛤蜊粗多糖中的多糖和蛋白質(zhì)幾乎全部沉降下來；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為20mg/mL，硫酸銨飽和度為60%時(shí)，所得多糖總糖含量為83%，糖轉(zhuǎn)移率為58.61%，效果較為理想，編號(hào)為3號(hào)樣品。

2.5 四角蛤蜊粗多糖對(duì)腎上腺素誘發(fā)高血糖模型小鼠血糖的影響

表5 四角蛤蜊粗多糖對(duì)腎上腺素誘發(fā)高血糖模型小鼠血糖的影響(x±s, n=10)Table 5 Effect of deproteinized products of crude Mactra veneriformis polysaccharide by different methods on blood glucose level in diabetic mice with adrenaline-induced hyperglycemia

由表5可知，腹腔注射腎上腺素30min后，小鼠血糖顯著升高(與空白組比較P＜0.01)，二甲雙胍和四角蛤蜊多糖在30min時(shí)均具有對(duì)抗腎上腺素升血糖的作用。二甲雙胍組和模型組比較有極顯著性差異(P＜0.01)，2號(hào)樣品組和模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

3 結(jié) 論

綜上推測(cè)，四角蛤蜊粗多糖中含有游離的多糖、蛋白質(zhì)以及多糖蛋白復(fù)合物質(zhì)共同存在；除絮凝法，其他脫蛋白方法均可行，其中優(yōu)選出的離子交換法、三氯乙酸(TCA)法及鹽析法所得除蛋白多糖總糖含量分別為85%、90.96%、83%，效果均較理想。四角蛤蜊多糖具有降低腎上腺素高血糖小鼠血糖的作用，與空白對(duì)照組比較，均具有極顯著性差異，P＜0.01；其中2號(hào)樣品組與模型對(duì)照組比較具有顯著性差異，P＜0.05。鹽析后的多糖活性弱，原因可能是多糖在高鹽環(huán)境下發(fā)生了構(gòu)象變化，以致活性改變。因此，TCA法得到的脫蛋白多糖含量和活性效果都較理想，可用于四角蛤蜊保健品的研究與開發(fā)。

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Comparative Study on Deproteinization Methods for Polysaccharide from Mactra veneriformis

ZHANG Kun1,2，WU Hao1,2,*，WANG Ling-chong1,2，GE Ying1，CAO Yang2
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China；2. Jiangsu Provincial Centre for Research and Development of Marine Drugs, Nanjing 210029, China)

Objective: To screen the optimum method for deproteinizing crude polysaccharide from Mactra veneriformis and to determine the polysaccharide content and biological activity of purified product. Methods: The deproteinization of crude polysaccharide from Mactra veneriformis was comparatively studied using ion exchange, trichloroacetic acid (TAC) method, PEG flocculation and salt fractionation. Results: Ion exchange, trichloroacetic acid (TAC) method and salt fractionation had good deproteinizing effect on crude polysaccharide from Mactra veneriformis, and the polysaccharide contents in the resulting purified products were 85%,90.96% and 83%, respectively. PEG flocculation was unsuitable for the removal of protein impurities from crude polysaccharide from Mactra veneriformis. Ion exchange and TAC method provided highly effective hypoglycemic products, and the product derived from TAC method displayed a significant difference compared to the model control (P ＜ 0.05). Conclusion: The screened methods are feasible in practice.

crude Mactra veneriformis polysaccharide；deproteinnization；activity

R282.7

A

1002-6630(2011)08-0050-04

2010-07-04

國(guó)家海洋局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200705009)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900293)

張坤(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笏幬锛肮δ苄员＝∑贰-mail：zkunsky@sina.com

*通信作者：吳皓(1957—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幣谥茖W(xué)及海洋藥物學(xué)。E-mail：whao5795@vip.sina.com