褐藻膠裂解酶的研究進展

陳俊帆，石 波，范紅玲，趙聰聰，程永強，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;

2.中國農(nóng)業(yè)科學研究院飼料研究所，北京 100081)

褐藻膠裂解酶的研究進展

陳俊帆1，石 波2，范紅玲1，趙聰聰1，程永強1，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083;

2.中國農(nóng)業(yè)科學研究院飼料研究所，北京 100081)

褐藻膠是一種由L－古羅糖醛酸和其C5差向異構體D－甘露糖醛酸結合而成的線性高分子多糖。褐藻膠裂解酶能夠通過β消去機制催化褐藻膠降解產(chǎn)生具有多種生物活性的褐藻膠寡糖。對于酶的鑒定分析將會拓展酶和寡糖在食品、農(nóng)業(yè)等領域的應用范圍。因此本文簡要闡述了酶的分類、測定方法、構效關系以及生物學功能，并就其應用的最新進展進行了展望。

褐藻膠，褐藻膠裂解酶，褐藻膠寡糖

褐藻膠是一種由α－L－古羅糖醛酸(G)和其C5差向異構體α－D－甘露糖醛酸(M)隨機結合而成的線性高分子多糖，聚合方式包括三種:聚古羅糖醛酸(polyG)、聚甘露糖醛酸(polyM)和異聚 MG段(polyMG)，其化學結構見圖1［1］。褐藻膠來源豐富，以其螯合金屬離子、溶液高黏性、凝膠性等特點被廣泛用于食品、紡織、印染、醫(yī)療、化工等行業(yè)［2］。研究證明褐藻膠寡糖具有抗癌、抗腫瘤、促進植物生長等多種生理功能。褐藻膠裂解酶作為生產(chǎn)褐藻膠寡糖的工具酶，反應效率高，反應條件溫和，可控性強，便于定向制備褐藻膠寡糖，其研究具有深遠理論意義和應用前景。

圖1 褐藻膠的化學結構

1 褐藻膠裂解酶分類

根據(jù)降解褐藻膠上M段和G段(底物專一性)的不同可分為甘露糖醛酸裂解酶EC4.2.2.3((1→4)－α－D－甘露糖醛酸裂解酶)和古羅糖醛酸裂解酶EC4.2.2.11((1→4)－α－L－古羅糖醛酸裂解酶)。酶的特異性可能取決于產(chǎn)生褐藻膠裂解酶的生存環(huán)境。迄今為止發(fā)現(xiàn)的褐藻膠裂解酶多數(shù)具有M特異性，只有少數(shù)具有G特異性的酶被發(fā)現(xiàn)和分離。一些粗酶提取物常表現(xiàn)為多種底物特異性，可能因為此種生物產(chǎn)生多種褐藻膠裂解酶或此酶具有多種底物特異性［2－3］。

不管是甘露糖醛酸裂解酶還是古羅糖醛酸裂解酶，多表現(xiàn)出內(nèi)切酶活性，但也有一些外切酶從菌株Sphingomonas sp.和鮑魚中分離出來。

根據(jù)酶分子量大小可以分為三類:25～30kDa，40kDa左右和60kDa左右。40kDa左右的酶多具有M底物特異性，25～30kDa類酶具有多種底物特異性［4］。

根據(jù)酶的初級結構，褐藻膠裂解酶被劃分為七種多糖裂解酶(polysaccharide lyase，PL)族:5、6、7、14、15、17 和 18［5］，與其它多糖裂解酶相比具有廣泛多樣性。大多數(shù)的褐藻膠裂解酶為 PL－5和PL－7。前者多具有polyM底物特異性，后者多具有polyG底物特異性［6］。鮑魚和小球藻病毒的褐藻膠裂解酶屬于PL－14，而Sphingomonas sp.A1菌株基因轉錄合成的褐藻膠裂解酶 A1－IV 屬于 PL－15［7］。

2 褐藻膠裂解酶作用方式

目前發(fā)現(xiàn)的能夠降解褐藻膠的酶均為裂解酶，尚未發(fā)現(xiàn)水解酶。褐藻膠裂解酶通過β消去機制催化褐藻膠降解，其作用位點是1→4糖苷鍵。在水解糖苷鍵所在的糖環(huán)的C4和C5位置間形成雙鍵，形成了4－脫氧－L－erythro－h(huán)ex－4－烯醇式吡喃糖醛酸的非還原末端，在235nm處有特征性強吸收。

Gacesa［8］提出一種褐藻膠裂解酶的催化機制，這種機制包括三步反應:a.通過鹽橋的中和作用移去羧基陰離子上的負電荷;b.從5位碳上獲得質(zhì)子的基質(zhì)催化反應;c.羧基基團提供電子在C4與C5之間形成雙鍵，導致發(fā)生在4－O糖苷鍵上的β消去反應。

3 褐藻膠裂解酶的結構

PL－5(Sphingomonas sp.A1－III)，PL－7(Corynebacterium sp.ALY－1)，PL－14(Chlorella virus，vAL－1)和 PL－18(Alteromonas sp.272)族褐藻膠裂解酶的三維結構目前已被闡述清楚。盡管PL－7的β夾板結構與PL－5的α/α套筒結構很不同，但發(fā)現(xiàn)色氨酸、組氨酸、天冬酰胺(谷氨酰胺)和精氨酸幾乎出現(xiàn)在PL－5和PL－7催化位點的同一位置，說明這幾種氨基酸參與了酶的催化反應［9］。

PL－5族褐藻膠裂解酶A1－III的三維結構中具有大量螺旋，在α6/α5套筒結構中有隧道型裂口，與葡萄糖淀粉酶和纖維素酶的套筒結構相似，如圖2所示［10］。

PL－7的褐藻膠裂解酶，如Corynebacterium sp.的G 段裂解酶ALY－1，Sphingomonas sp.A1 的 A1－II'和Pseudomonas aeruginosa的M段降解酶PA1167，都有β夾板結構作為底座，其中有作為催化中心的裂口。PL－7褐藻膠裂解酶的活性中心根據(jù)其底物特異性高度保守［5］。其中，A1－II'具有廣泛底物特異性，能夠裂解polyG、polyM和polyMG。A1－II'β夾板結構中作為催化中心的裂口上覆蓋著兩個可伸縮的蓋環(huán)。蓋環(huán)的柔韌性使得底物可以靈活進入，并決定了酶廣泛的底物結合和催化特性［11］。

Yamamoto等［9］通過點突變置換了 PL－14 族HdAly上一些保守序列的殘基，結果發(fā)現(xiàn)，置換Lys95導致HdAly完全失活，置換Arg92，Arg110和Arg119導致了65%甚至更多的失活。說明從Arg92到Arg119的序列與 HdAly的催化活性密切相關。PL－14族裂解酶vAL－1具有葡萄糖醛酸裂解活性，同時在堿性條件下具有褐藻膠酶裂解活性。其催化組分vAL－1(S)在pH7.0時降解褐藻膠釋放雙糖至己糖，pH 10.0時主要釋放雙糖。說明此酶的外切和內(nèi)切作用方式依賴于pH。vAL－1(S)的立體結構具有兩條逆向平行的β夾板，其上有裂口作為催化中心，如圖 2［12］所示。

圖2 vAL－1的立體結構

4 褐藻膠裂解酶酶活測定方法

褐藻膠裂解酶酶活測定方法包括定性測定和定量測定兩種方式。

定性測定主要采用唯一碳源生長法或平板鑒定法。唯一碳源生長法是使用含有褐藻膠、M嵌段或者G嵌段作為唯一碳源的培養(yǎng)基，通過觀察微生物的生長和液體培養(yǎng)基粘稠度的降低初步確定酶的活性。更加靈敏的測定方法則使用95%乙醇、飽和氯仿蒸汽或者釕紅試劑等處理有微生物生長的培養(yǎng)皿，在一定的背景下觀察水解圈的大?。?3］。

定量測定方法有很多，其中苔黑酚法(Orcinol Assay)、硫代巴比妥酸法(Thiobarbituric Acid Assay)、紫外吸收法(Ultraviolet Absorption Assay)、黏度法(Viscometry Assay)等是較為常用的方法。

苔黑酚法是根據(jù)未降解褐藻膠在熱堿性溶液中短暫處理的穩(wěn)定性，中間產(chǎn)物還原性寡糖和終產(chǎn)物單糖幾乎不發(fā)生苔黑酚反應。硫代巴比妥酸法的原理是4－脫氧－5－酮糖醛酸和作為中間產(chǎn)物的不飽和糖醛酸經(jīng)高碘酸氧化處理后產(chǎn)生β－甲酰丙酮酸，而未降解的褐藻膠不發(fā)生反應［14］。紫外吸收法最為簡單方便，根據(jù)酶解產(chǎn)生的不飽和糖醛酸在235nm處具有強烈吸收的特點直接進行比色測定。褐藻膠在降解過程中溶液黏度下降，黏度法測定的靈敏度高但操作較為困難［2］。此外，還有還原糖法等。在實際酶活測定中，常同時測定黏度、還原糖和吸光值等指標綜合反映酶的降解特性［15］。

5 褐藻膠裂解酶來源

目前已有50多種褐藻膠裂解酶從藻類、海洋軟體動物以及海洋和土壤細菌中分離出來。Lin等［16］從海洋褐藻Fucus gardneri silva中分離提純出褐藻酸酶。Davidson等［17］以海藻酸鈉作為唯一碳源，分離出一株能降解褐藻膠的假單胞菌，該菌所產(chǎn)褐藻膠裂解酶分子量約為50000，特異性降解 polyG段。Suzuki等［18］從鮑魚 Haliotis discus hannai中分離出褐藻膠裂解酶HdAly，偏好裂解polyM段。之后他們又從此種鮑魚中分離出新型寡褐藻膠酶HdAlex，可以外切褐藻膠產(chǎn)生二糖［7］。此外，Suda 等［19］發(fā)現(xiàn)小球藻病毒能夠轉錄合成褐藻膠裂解酶，此褐藻膠裂解酶最適pH 10.5，酶活性依賴于Ca2+的存在。

6 褐藻膠裂解酶的生物學功能

6.1 褐藻膠裂解酶在不產(chǎn)褐藻膠生物體中的功能

產(chǎn)褐藻膠裂解酶的微生物能利用褐藻膠為初級碳源或次級碳源，采用褐藻膠作為唯一碳源的培養(yǎng)基上可以篩選得到這些微生物。Sphingomonas sp.A1能夠產(chǎn)生四種褐藻膠裂解酶:A1－I、A1－II，A1－III和A1－IV。A1－I，A1－II和 A1 －III是內(nèi)切酶，降解褐藻膠形成不飽和二糖、三糖和四糖。A1－IV具有外切酶活性，能夠斷開不同聚合度褐藻膠非還原末端的糖苷鍵，產(chǎn)生不飽和單糖。Sphingomonas sp.A1可以通過糖酵解途徑利用這種單糖作為碳源［20］。

食草性軟體動物如海螺、鮑魚等攝入海藻，其體內(nèi)分泌的褐藻膠裂解酶協(xié)同纖維素酶能有效降解藻類中的細胞壁。如鮑魚Haliotis discus hannai產(chǎn)生褐藻膠裂解酶HdAly和HdAlex，HdA ly能夠降解M段豐富的褐藻膠，卻不能降解DP＜4的不飽和寡甘露糖醛酸。HdA lex可以降解不飽和三糖產(chǎn)生二糖和單糖［6］。

6.2 褐藻膠裂解酶在產(chǎn)褐藻膠生物體中的功能

從肺囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)病人肺部獲得的條件致病菌Pseudomonas aeruginosa會分泌豐富的褐藻膠，褐藻膠與蛋白形成的復合物相互粘連將細菌包裹其中形成膜狀物。這種生物被膜幫助假單胞菌粘附在腔道表面，并對抗生素等產(chǎn)生抗藥性。但同時Pseudomonas aeruginosa也能產(chǎn)生褐藻膠裂解酶，此酶與其它蛋白組成多重蛋白分泌復合體，為異構酶、聚合酶催化甘露糖醛酸合成褐藻膠提供接觸場所，并引導褐藻膠通過外周胞質(zhì)進入外層膜［21－22］。當褐藻膠阻塞在外周胞質(zhì)中不能被運到細胞外時，褐藻膠裂解酶降解褐藻膠，防止高濃度的褐藻膠對細胞產(chǎn)生毒害［23］。

7 褐藻膠裂解酶的應用

褐藻膠裂解酶的應用包括制備褐藻膠寡糖、原生質(zhì)體分離、治療肺囊性纖維化病和進行褐藻膠結構微細化研究等。

褐藻膠寡糖分子量小，具有多種生物活性，比如抑制人皮膚中膠原質(zhì)合成，刺激內(nèi)皮細胞和角化細胞生長，促進雙歧桿菌生長繁殖，促進植物根系伸長等［24］。褐藻膠寡糖的制備方式包括酸水解、熱解和酶解等。酸水解和熱解制得的寡糖非還原末端為飽和糖醛酸，而酶解制得的寡糖在末端形成不飽和糖醛酸［25］。盡管褐藻膠寡糖分子具有生物活性的根本機理尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，褐藻膠寡糖的活性與其分子量、分子組成(M/G比)、MG排列順序等結構信息密切相關。Iwamoto等［26］比較了酸解和酶解制得的褐藻膠寡糖對腫瘤壞死因子TNF－α的誘導活性。發(fā)現(xiàn)老鼠巨噬細胞分泌TNF－α依賴于寡糖的結構，酶解得寡糖具有誘導活性，而酸解制得寡糖幾乎沒有，說明寡糖末端的不飽和結構對于TNF－α的誘導具有關鍵意義。

采用原生質(zhì)體融合和基因操作等細胞工程手段可以提高褐藻品質(zhì)，增加褐藻商業(yè)價值。其中原生質(zhì)體的制備方法已經(jīng)成熟。采用纖維素酶和褐藻膠酶混合的方法可以降解褐藻細胞壁，釋放原生質(zhì)體［27］。

褐藻膠裂解酶能夠配合一些抗生素降解肺囊性纖維化病人肺中病原菌產(chǎn)生的褐藻膠，使病原菌細胞壁通透性增強，利于抗生素發(fā)揮抑制作用［28］。

8 展望

褐藻膠裂解酶具有廣泛的應用前景，由于褐藻膠及其寡糖所具有的生理活性，酶選擇性降解褐藻膠的性質(zhì)使其成為寡糖工業(yè)生產(chǎn)中潛在的重要工具酶。除了可以利用酸解法、化學氧化法等方法獲得褐藻膠單體產(chǎn)物，也可以利用褐藻膠裂解酶與D－甘露糖醛酸C5異構酶，以不同褐藻膠為原料生產(chǎn)預期結構的新型褐藻膠片段。通過紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等手段獲得酶切產(chǎn)物的結構信息，如M/G比值、聚合度、單糖連接順序、糖苷鍵位置等，從而推斷出每種褐藻膠裂解酶的酶切方式。同時，通過對每種特定結構寡糖的抗腫瘤、促進根系生長等生理活性的分析，進而確定要生產(chǎn)某種特定用途的寡糖可以利用何種褐藻膠裂解酶以何種方式生產(chǎn)。

雖然目前對于褐藻膠裂解酶的作用方式和酶切產(chǎn)物的研究十分廣泛，但對于某一種菌株及其褐藻膠裂解酶進行持續(xù)深入的系統(tǒng)化研究比較少。因此，通過深入研究達到定向利用褐藻膠裂解酶的目的是未來重要的研究趨勢。

此外，褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)中普遍存在酶活性較低，酶與產(chǎn)物結合緊密、分離困難的問題，因此酶產(chǎn)率低，限制了酶的推廣應用，迄今沒有一種褐藻膠裂解酶用于工業(yè)化生產(chǎn)。所以探索新型的酶制備生產(chǎn)技術，提高酶的產(chǎn)量，創(chuàng)新酶的應用模式也成為必要。基因工程是解決這一問題的重要工程手段，目前已有20多種褐藻膠裂解酶基因被克隆。Sphingomonas sp.A1的 A1－IV，Klebsiella pneumoniae的褐藻膠裂解酶，Pseudomonas sp.OS－ALG－9和P.elyakovii IAM在Escherichia coli細胞中表達。A1－IV在E.coli中的表達酶活是在A1細胞中的270倍。純化出的酶的最適pH、最適溫度和耐熱性與純化自A1的酶相似［29］。而在工程化生產(chǎn)的過程中，可以嘗試利用新的高效表達系統(tǒng)進行重組表達和純化，使用多種突變技術，進行基因改造等進一步提高酶的產(chǎn)出率。

一些褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌是病原菌，如Vibrio sp.QY101，因此不適合大規(guī)模生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。Liu等［30］利用微生物細胞表面展示技術(microbial cell surface disp lay，MCSD)，將褐藻膠裂解酶定位表達在酵母菌Yarrowia lipolytica表面，無需對褐藻膠裂解酶進行分離純化，可以直接利用細胞懸浮液進行酶解。這些基因工程、細胞工程的手段突破了酶的應用限制，提高了酶的產(chǎn)量、利用率，對于未來酶的廣泛應用奠定了堅實的技術基礎，預示著未來酶應用中的技術革新，會越來越多地應用于褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)。

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The latest progress of alginate lyase

CHEN Jun－fan1，SHIBo2，F(xiàn)AN Hong－ling1，ZHAO Cong－cong1，CHENG Yong－qiang1，*
(1.College of Food Science ＆ Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;
2.Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China)

Alginate lyases catalyze the degradation of alginate，a complex copolymer of L－guluronate and its C5 epimer D－mannuronate with β－elimination mechanism，yielding oligosaccharides with special bioactivities.Characterization of alginate lyases will expand the potentialuse of novel oligosaccharides in various industrial and agricultural fields.The methods for analyzing these enzymes，the structure－function relationship of these lyases，as well as their biological roles were cataloged.The applications and future prospects of this important enzyme were also explored.

alginate;alginate lyase;alginate oligosaccharides

TS254.1

A

1002－0306(2011)08－0428－04

2010－07－05 *通訊聯(lián)系人

陳俊帆(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學。

國家自然科學基金(30972286);“十一五”科技支撐計劃項目(2007BAD83B03);教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”。