酶法交聯(lián)對食物蛋白的改性作用研究進展

吳進菊，湯尚文，黃升謀，豁銀強

(襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄樊 441053)

酶法交聯(lián)對食物蛋白的改性作用研究進展

吳進菊，湯尚文，黃升謀，豁銀強

(襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北襄樊 441053)

食物蛋白通過分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)作用，可有效地改善功能特性，有利于在食品加工中的應(yīng)用。可用于蛋白交聯(lián)的酶主要有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等。主要闡述了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶交聯(lián)蛋白的作用機理及最新研究進展。

交聯(lián)，食物蛋白，多酚氧化酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

蛋白質(zhì)是人體必需的六大營養(yǎng)素之一，是影響食品質(zhì)地的重要組分。然而，天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)無法滿足食品加工的需要，蛋白質(zhì)改性研究已引起了廣大學(xué)者的廣泛重視。蛋白質(zhì)的改性是指通過物理、化學(xué)和生物(酶)的方法改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而改善它們的功能特性，使之達到食品所需要的品質(zhì)特性，以擴大蛋白質(zhì)在不同類型食品體系中的應(yīng)用范圍［1］。蛋白質(zhì)的功能特性，與其化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子大小、表面疏水性等密切相關(guān)。蛋白質(zhì)通過分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)作用，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，分子量大大提高，可有效地改善功能特性，如保水性、乳化性、起泡性、流變學(xué)特性及凝膠特性等，減少食品添加劑的使用，有利于在食品加工中的應(yīng)用。蛋白交聯(lián)的方法有化學(xué)法、物理法和酶法。利用酶進行蛋白交聯(lián)以改良食品的功能特性，比化學(xué)法更好，因為酶所需條件溫和，具有較高的特異性，不會產(chǎn)生有毒物質(zhì)，并且消費者感覺酶比化學(xué)劑更“天然”［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)，可用于蛋白交聯(lián)的酶有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等，它們可催化蛋白質(zhì)形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，從而改善蛋白質(zhì)的功能特性。

1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對食物蛋白的交聯(lián)作用

轉(zhuǎn) 谷 氨 酰 胺 酶 (Transglutaminase，TG，E.C.2.3.2.13，全稱為蛋白質(zhì)－谷氨酰胺－γ谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶)可催化轉(zhuǎn)酰胺基反應(yīng)，形成ε－(γ－谷氨酰胺基)賴氨酸鍵的交聯(lián)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用機理如下［3］∶a.它可催化肽鍵中谷氨酰胺殘基γ－羰基和伯胺之間酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(圖1a)，利用該反應(yīng)可共價導(dǎo)入蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽至同種或異種蛋白，或?qū)被穷?、磷脂?dǎo)入蛋白質(zhì)形成多相共軛蛋白質(zhì)，從而改善蛋白質(zhì)營養(yǎng)特性［4］。b.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中賴氨酸殘基γ－氨基作為酰基受體時，蛋白質(zhì)在分子之內(nèi)或分子之間形成ε－(γ－谷氨酰胺基)賴氨酸共價鍵(圖1b)。通過該反應(yīng)蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，使食品或其他制品發(fā)生質(zhì)構(gòu)變化，從而賦予產(chǎn)品特有的質(zhì)構(gòu)特性和粘合性能。c.當(dāng)不存在伯胺時，水會成為?；荏w，則谷氨酰胺殘基脫去胺基(圖1c)，該反應(yīng)可用于改變蛋白質(zhì)等電點及溶解性。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最初是從哺乳動物的組織中提取得來的，由于提取純化困難，價格較高，從而制約了其在食品加工中的應(yīng)用。直到1989年，日本人采用微生物發(fā)酵的方法大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的來源得到充分保障，從而推動了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)蛋白的進一步研究。采用TG對食物蛋白進行交聯(lián)，可改良蛋白質(zhì)的功能特性，如熱穩(wěn)定性、乳化性、凝膠特性、保水性、流變學(xué)特性等。目前，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是蛋白質(zhì)酶法交聯(lián)中研究最多、應(yīng)用最廣的一種酶，已廣泛應(yīng)用于乳制品、植物蛋白制品、肉制品和焙烤制品中。

圖1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用機理

Kuraishi等報道采用TG處理乳制作的凝固型酸奶的凝膠強度和攪拌型酸奶的粘性具有更易被人們接受的感官性，因為TG能增加凝膠強度，提高蛋白溶液的粘性，從而提高保水性［4］。Chambi等采用TG催化交聯(lián)不同配比濃度的酪蛋白和明膠制備可食用膜，當(dāng)酪蛋白和明膠配比為75∶25時，可食用膜的延展性能大大提高，而透水性卻大幅度降低［5］。采用TG催化交聯(lián)β－乳球蛋白，可以顯著提高其熱穩(wěn)定性，如聚合度為1%的β－乳球蛋白在100℃下可保持30min不變性，而未交聯(lián)的β－乳球蛋白在70℃下就會發(fā)生變性［6］。同樣地，脫脂乳經(jīng) TG交聯(lián)后，在pH6.3～7.1范圍內(nèi)比未處理乳的熱穩(wěn)定性更高［7］。Marton等研究發(fā)現(xiàn)采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)和谷胱甘肽(GSH)的共同作用對乳蛋白進行共價交聯(lián)，可使乳在不需要預(yù)熱處理的情況下就能進行交聯(lián)，從而增加外觀粘性，比單獨采用TG處理的乳具有更高的蛋白聚合度［8］。Ozer等建議 TG的使用濃度在9～14U/g蛋白質(zhì)，以提高凝固型脫脂酸奶的物理、化學(xué)和感官特性。而當(dāng)采用TG+GSH共同作用時，所需的酶濃度較低，只需0.6～1.0U/g蛋白質(zhì)［25］。莊瑋婧等研究發(fā)現(xiàn)TG酶的添加可以明顯提高鰱魚魚丸的持水性、質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)，但對色澤無明顯影響［9］。

2 多酚氧化酶對食物蛋白的交聯(lián)作用

多酚氧化酶 (Polyphenoloxidase，PPO，EC 1.14.18.1)，是由核編碼的含銅金屬酶，廣泛存在于各種動物、植物和微生物中。根據(jù)作用底物的不同，多酚氧化酶又被習(xí)慣地稱為單酚氧化酶、酪氨酸酶、甲酚酶、兒茶酚酶等。近些年來，多酚氧化酶催化蛋白交聯(lián)反應(yīng)引起了學(xué)者的廣泛重視。

目前，用于蛋白交聯(lián)研究的PPO多是從雙孢蘑菇子實體提取得來的。Onwulata等采用經(jīng)蘑菇多酚氧化酶交聯(lián)的乳蛋白制作凝膠，凝膠粘度顯著增加，將凝膠放置于4℃冰箱保存10d后，凝膠狀態(tài)穩(wěn)定，且粘彈性更高［10］。Burzio等采用蘑菇PPO對棱紋貽貝、智利貽貝和合唱殼菜蛤三種蚌類中的多酚類蛋白質(zhì)進行交聯(lián)，研究發(fā)現(xiàn)智利貽貝和合唱殼菜蛤中蛋白質(zhì)的交聯(lián)效果不如棱紋貽貝中好。對交聯(lián)蛋白的氨基酸分析表明∶只有多巴含量明顯減少，而其它氨基酸含量變化不大，這說明交聯(lián)的形成可能只限于蛋白質(zhì)分子中多巴衍生物的氧化［11］。Takasaki等研究發(fā)現(xiàn)小麥醇溶蛋白經(jīng)蘑菇PPO交聯(lián)后，分子量為20～60ku的峰面積顯著減少，而分子量為300～1000ku的峰面積顯著增加，他們通過進一步的研究表明小麥醇溶蛋白發(fā)生了分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)［12］。Thalmann等在研究蘑菇PPO對α－乳白蛋白、β－乳球蛋白和溶菌酶的交聯(lián)作用時發(fā)現(xiàn)，α－乳白蛋白和β－乳球蛋白產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)的最適pH為4～5，而溶菌酶的最適pH為7.0，其中，α－乳白蛋白經(jīng)交聯(lián)后能產(chǎn)生分子量大于300ku的聚合體［13］。經(jīng)雙孢蘑菇PPO交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性與形成的聚合物含量有著密切的關(guān)系，當(dāng)PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應(yīng)4h時，交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性分別為18.3m2/g和19.8min，較未交聯(lián)的酪蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了17.3%和37.5%［14］。另外，蘑菇PPO也能催化膠原蛋白發(fā)生分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)［15］。

由于雙孢蘑菇的栽培具有明顯的季節(jié)性，鮮菇不易貯存，且PPO分離純化困難，近年來，少數(shù)學(xué)者將PPO的來源投向了微生物，采用里氏木霉PPO交聯(lián)蛋白。研究表明，里氏木霉 PPO在3h內(nèi)可使β－酪蛋白產(chǎn)生交聯(lián)，但牛血清白蛋白在24h內(nèi)都不能產(chǎn)生交聯(lián)［16］。另外，Monogioudi等研究發(fā)現(xiàn)β－酪蛋白經(jīng)里氏木霉PPO交聯(lián)后形成的聚合物分子量大小與酶的加入量和作用時間有關(guān)，聚合物分子量在500～1700ku之間，交聯(lián)度在21～71之間［17］。

3 過氧化物酶對食物蛋白的交聯(lián)作用

過氧化物酶(Peroxidase，POD，E.C.1.11.1.7)是由微生物或植物所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，廣泛地分布于自然界中，是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，該酶也可以催化蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。過氧化物酶可氧化酪氨酸殘基，在蛋白質(zhì)中形成分子間和分子內(nèi)的二酪氨酸和三酪氨酸結(jié)構(gòu)，從而使蛋白發(fā)生交聯(lián)作用［18］。

Steffensen等采用灰蓋鬼傘過氧化物酶和 H2O2交聯(lián)酪蛋白，經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，天然酪蛋白的量明顯減少，而形成了高分子量的聚合物［19］。在H2O2存在的情況下，采用辣根過氧化物酶對酪蛋白進行交聯(lián)作用，酪蛋白的最佳交聯(lián)條件是酶加入量4.73μkat/g，酪蛋白濃度5%，pH9.5，37℃反應(yīng)2.9h;交聯(lián)后酪蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了10%和6%，制作的凝膠微觀結(jié)構(gòu)更緊密、一致［20］。

4 展望

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是蛋白交聯(lián)中研究最深入、應(yīng)用最廣的一種酶，已進行商業(yè)化生產(chǎn)。相比而言，多酚氧化酶由于來源得不到保障，對蛋白交聯(lián)方面的研究相對較少，但也取得了一定的成績，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。而過氧化物酶交聯(lián)蛋白方面的報道較少。

目前，酶法交聯(lián)食物蛋白方面的研究主要集中在交聯(lián)后蛋白功能特性的改變，而對蛋白的營養(yǎng)特性研究較少，交聯(lián)后蛋白在體內(nèi)的消化吸收情況有待于進一步深入的研究。另外，交聯(lián)后蛋白功能特性改變的機理尚不明確，交聯(lián)后蛋白結(jié)構(gòu)的改變與功能特性的關(guān)系有待于進一步研究。

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Research progress on modification of food proteins by enzymatic cross linking

WU Jin－ju，TANG Shang－wen，HUANG Sheng－mou，HUO Yin－qiang
(College of Chemical Engineering and Food Science，Xiangfan University，Xiangfan 441053，China)

Inter－and intramolecular cross－linking of food proteins can modify their functional properties，which are useful to application in food processing.The enzymes which can be used for protein cross linking are transglutaminase，polyphenol oxidase and peroxidase.Reaction principle of transglutaminase，polyphenol oxidase and peroxidase generated cross－linking of proteins，as well as the latest progresses，were Illustrated.

cross－linking;food proteins;polyphenol oxidase;transglutaminase

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)11－0511－03

2011－03－23

吳進菊(1983－)，女，講師，研究方向:食品生物技術(shù)。