食物中酚類抗氧化成分的色譜法篩選研究進(jìn)展

張清安，范學(xué)輝，張志琪

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062; 2.陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西西安 710062; 3.陜西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062)

食物中酚類抗氧化成分的色譜法篩選研究進(jìn)展

張清安1，范學(xué)輝2，張志琪3

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062; 2.陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西西安 710062; 3.陜西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062)

概述了氧化、抗氧化、酚類抗氧化物質(zhì)及其色譜法篩選的研究進(jìn)展，展望了未來該領(lǐng)域研究的發(fā)展趨勢(shì)。

酚類，抗氧化，色譜，篩選

為了從眾多酚類物質(zhì)中快速篩選出具有抗氧化活性的成分，研究者們開展了大量體內(nèi)、外模型篩選研究［1－4］。但這些實(shí)驗(yàn)方法不具備分離功能，僅能評(píng)價(jià)那些單一物質(zhì)的抗氧化性能，或鑒定那些常規(guī)的抗氧化物質(zhì)，或評(píng)價(jià)混合體系總的抗氧化能力，至于要給出體系中某個(gè)單一成分的功能及其對(duì)總抗氧化能力的貢獻(xiàn)卻是一件很難完成的任務(wù)。傳統(tǒng)的解決方法是先對(duì)復(fù)雜體系進(jìn)行物質(zhì)分離，得到單體后再進(jìn)行鑒定和活性評(píng)價(jià)，但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，更重要的是由于物質(zhì)間的相互作用或分離過程中其他作用因素(如降解等)，待分開后它們已失去作用，而且對(duì)微量物質(zhì)制備比較困難。因此，如何利用現(xiàn)代分離、分析和鑒定技術(shù)，快速、有效的從復(fù)雜體系中篩出具有抗氧化活性的成分，即高分辨篩選(Highresolution screening，HRS)或在線同時(shí)評(píng)價(jià)復(fù)雜體系中各組分抗氧化活性，已成為開發(fā)研究抗氧化成分及產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)。本文就色譜法篩選酚類抗氧化成分的研究進(jìn)展做一綜述。

1 酚類抗氧化物質(zhì)

添加抗氧化劑被認(rèn)為是有效解決氧化或氧化應(yīng)激作用較為有效的手段。因此，抗氧化劑和抗氧化(生物)化學(xué)成了當(dāng)今的熱門話題，尤其尋找合適有效的外源抗氧化劑更成了科技工作者研究興趣所在。外源抗氧化劑的獲取途徑有合成法和從生物體內(nèi)提取法。與天然抗氧化劑相比，雖然合成抗氧化劑有易得、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但由于存在安全性問題，人們還是對(duì)天然抗氧化劑寄予了厚望。天然抗氧化劑也稱為生物抗氧化劑，主要是指在生物體內(nèi)合成的具有抗氧化作用或誘導(dǎo)抗氧化產(chǎn)生的一類物質(zhì)，可以來自植物、動(dòng)物或微生物。其中植物多酚就是一類廣泛存在于自然界，且來源豐富的天然抗氧化劑。

多酚(Polyphenols)，又名單寧、鞣質(zhì)，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)(Secondary metabolic compounds)的混合物，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，含量?jī)H次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。將其用于鞣制皮革是人類最初對(duì)植物中所含多酚類化合物的利用，并將這類化合物稱為植物單寧(vegetable tannins)［9］。1981年，Haslam提出了植物多酚這一術(shù)語，指那些植物整體或某一部分的存活非必需的化合物，包括單寧及相關(guān)化合物［10］。多酚類化合物結(jié)構(gòu)中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)，基本骨架是由丙二酰輔酶A和桂皮酰輔酶A生物合成，此外還與單糖、雙糖、三糖和酰化糖等結(jié)合，以苷的形式存在。正是由于多酚的獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予了它獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，以及在維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、對(duì)某些疾病的預(yù)防和治療方面的獨(dú)特作用，因而受到了世人的關(guān)注，成為目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一。

盡管對(duì)多酚類的研究開發(fā)方興未艾，且大量研究也表明多酚類(尤其黃酮類)化合物在抗氧化、抗誘變、抗輻射、抗腫瘤、抑菌、酶抑制等方面具有良好的作用，但一般都是以混合物的形式進(jìn)行研究，且多在體外評(píng)價(jià)，其具體起作用的成分、作用的分子藥理機(jī)理、作用靶點(diǎn)等尚不太清楚，在體內(nèi)能否真正起這些作用也還不確定。因此，有必要先篩選出具有抗氧化作用的成分，然后再對(duì)其進(jìn)行深入系統(tǒng)研究。

2 酚類抗氧化物質(zhì)的色譜法篩選研究現(xiàn)狀

色譜技術(shù)是目前分離復(fù)雜體系最為有效的常用工具之一，它包含高速逆流色譜、超臨界流體色譜、氣相色譜、毛細(xì)管電泳色譜、凝膠色譜、高效液相色譜、快速液相色譜和超高壓液相色譜。它們能提供保留時(shí)間、成分含量等方面的信息(尤其有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí))，因此得到了廣泛應(yīng)用。

Winston等［11］和Soliman等［12］分別就氣相色譜法篩選抗氧化物質(zhì)進(jìn)行了研究。Shi et等［13］報(bào)道了高速逆流色譜耦合DPPH自由基反應(yīng)體系從植物提取物中篩選抗氧化物的研究方法。Magalh?es等［14］對(duì)近年來基于清除自由基或測(cè)定總還原能力原理而建立的流動(dòng)注射篩選抗氧化成分方法的應(yīng)用情況進(jìn)行了詳細(xì)綜述?？傊?，目前已有不少篩選方法報(bào)道，而且就色譜尤其高效液相色譜及其耦合技術(shù)用于從混合體系中篩選活性成分報(bào)道最多［15－16］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，截至2010年10月國(guó)內(nèi)外共有近60篇相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。目前色譜(尤其液相色譜)及其耦合技術(shù)篩選抗氧化成分主要有兩種形式∶離線法篩選和在線法篩選。

2.1 離線篩選法

離線法也稱柱前反應(yīng)法，其基本原理是將酚類提取物先與某些特定自由基(如DPPH·和ABTS+·)反應(yīng)，然后將提取物原液及其與自由基的反應(yīng)液分別進(jìn)樣進(jìn)行液相色譜分離測(cè)定，由于混合物中那些具有清除自由基的成分在反應(yīng)后含量減少，因此在色譜圖上主要表現(xiàn)在峰高或面積的變小，最后通過比較兩個(gè)色譜圖中峰高或峰面積的變化即可確定具有抗氧化活性的峰(成分)，從而篩選出抗氧化成分。Shui等［17］最先報(bào)道了HPLC－DAD(UV)離線法從星果中篩選抗氧化活性物質(zhì)，但由于這種方法對(duì)那些紫外吸收不敏感的抗氧化活性峰不太有效，所以他們又對(duì)該法進(jìn)行了改進(jìn)，并提出以反應(yīng)前后離子信號(hào)強(qiáng)度的變化來篩選抗氧化活性物質(zhì)［18－20］。Toshiya等［21］、Yao等［22］和符軍放［23］也分別報(bào)道了用離線法從番石榴、臺(tái)灣香檬、金絲桃、蕎麥和蜂膠中篩選抗氧化活性物質(zhì)的研究。但由于該方法易出現(xiàn)假陽性，因此應(yīng)用較少。

2.2 在線篩選法

在線篩選法又可分為∶TLC(ThinLayer Chromatography)生物自顯影篩選法和HPLC耦合在線篩選法。

TLC與生物活性測(cè)定相結(jié)合的自顯影篩選法具有操作簡(jiǎn)單、耗費(fèi)低、靈敏度和專屬性高的特點(diǎn)，是一種快速測(cè)定生物活性的方法。TLC生物自顯影技術(shù)在篩選抗氧化劑時(shí)往往采用清除自由基法，由于活性氧自由基都不穩(wěn)定，因此穩(wěn)定的DPPH·成為首選。

其原理如下∶首先使樣品(混合物)在薄層板上進(jìn)行分離，然后在薄層板上噴灑DPPH·溶液(紫色)，經(jīng)過一定時(shí)間后，如果樣品中某組分具有抗氧化活性，則它會(huì)清除DPPH·而顯黃色，其余不具有抗氧化活性的組分依舊顯紫色，這樣就可以判斷哪些組分具有抗氧化活性，根據(jù)顏色的深淺不同，還能判斷抗氧化活性的大?。?4－25］。除了TLC－DPPH·方法外，還可用β－胡蘿卜素進(jìn)行檢測(cè)。如Torres［26］和Silva［27］等將0.05%β－胡蘿卜素氯仿溶液噴灑到待測(cè)薄層板上顯色，用UV254nm光或自然光照射后，背景色褪去呈白色，而活性位點(diǎn)呈黃色。

與其它色譜分離技術(shù)相比，TLC生物自顯影技術(shù)的不足之處是TLC的分辨率與分離能力不是很強(qiáng)，此外，它的檢測(cè)方式也限制了其靈敏度。

HPLC耦合在線色譜篩選即柱后反應(yīng)或柱后衍生篩選，其基本原理是先利用色譜柱對(duì)混合物進(jìn)行分離并用自配檢測(cè)器記錄信號(hào)，或者也可先對(duì)柱后流出液進(jìn)行適當(dāng)分流，然后將流出液或分流液與適當(dāng)自由基試劑在反應(yīng)環(huán)中進(jìn)行反應(yīng)或衍生，最后進(jìn)入另外一個(gè)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，通過兩個(gè)檢測(cè)器記錄信號(hào)的比較(凡是有抗氧化活性的峰在第二個(gè)檢測(cè)器上有一對(duì)應(yīng)的負(fù)峰或倒峰)即可篩出有活性的成分。根據(jù)衍生裝置、衍生試劑(化學(xué)發(fā)光試劑或自由基)和第二個(gè)檢測(cè)器的差異，通常又可分為∶HPLCCL耦合在線篩選法和HPLC－DPPH·(ABTS+·)耦合在線篩選法。

HPLC－CL耦合篩選法中所用的衍生物質(zhì)是魯咪諾和雙氧水，所用外加檢測(cè)器為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀。HPLC－CL法最早被報(bào)道用來在線分離和測(cè)定微量金屬元素，通過魯咪諾氧化實(shí)驗(yàn)，該法現(xiàn)常被用來測(cè)定脂質(zhì)初級(jí)氧化產(chǎn)物和具有抗氧化能力的物質(zhì)。

Dapkevicius等［28］最先報(bào)道了HPLC－CL從植物粗提物中直接測(cè)定抗氧劑的方法(所用裝置見圖1)，并對(duì)柱后魯咪諾反應(yīng)條件和試劑順序進(jìn)行了優(yōu)化研究。利用該法還成功從百里香和鼠尾草提取物中篩選出了抗氧化物質(zhì)。

圖1 HPLC－CL在線法篩選抗氧化物質(zhì)示意圖

HPLC－CL耦合在線篩選法的局限［29］∶對(duì)流動(dòng)相有特殊要求，不能和甲醇－水洗脫溶劑有效相溶;需要復(fù)雜、昂貴的發(fā)光及檢測(cè)設(shè)備和試劑;對(duì)待測(cè)物也有一定要求，這也許是該法未被普及和廣泛應(yīng)用的主要原因。

HPLC－DPPH·(ABTS+·)法是目前應(yīng)用最廣的用來篩選抗氧化物質(zhì)的方法。其基本思路是使色譜柱分離出的物質(zhì)與DPPH·(ABTS+·)自由基在反應(yīng)環(huán)中衍生，根據(jù)反應(yīng)后色譜圖中倒峰的數(shù)量和大小，即可篩選出提取物中的活性抗氧化成分。由于DPPH·(ABTS+·)自由基相對(duì)穩(wěn)定，而且它們的原溶液分別在517nm和734nm左右具有強(qiáng)吸收，當(dāng)有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)這些自由基會(huì)與之發(fā)生反應(yīng)，并最終使其吸光度降低，因此在柱后反應(yīng)篩選抗氧化物質(zhì)中得到了廣泛應(yīng)用。

Koleva等［30－31］最先報(bào)道了從混合物中在線選擇性測(cè)定DPPH·和ABTS+·兩種自由基清除物的方法(見圖2)，并對(duì)影響吸光度的參數(shù)(自由基溶液濃度、反應(yīng)時(shí)間、流動(dòng)相的組成和酸度、抗氧化物質(zhì)的化學(xué)特性和濃度等)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

圖2 HPLC－DPPH·(ABTS+·)在線法篩選抗氧化物質(zhì)典型示意圖

由于DPPH孤對(duì)電子的存在，在有機(jī)溶劑中較為穩(wěn)定，517nm處有深紫色強(qiáng)吸收，有現(xiàn)成的商品且配制簡(jiǎn)單方便，所以在抗氧化研究中使用最多。

與HPLC－CL在線篩選法相比，HPLC－DPPH·法的優(yōu)點(diǎn)在于所需設(shè)備簡(jiǎn)單(僅需一注射泵或蠕動(dòng)泵，不需熒光檢測(cè)器)、基線穩(wěn)定、試劑穩(wěn)定便宜、操作簡(jiǎn)單、流動(dòng)相既可進(jìn)行梯度洗脫也可進(jìn)行等度洗脫、流動(dòng)相酸度可調(diào)。因此，自Koleva首次將HPLC－DPPH·(ABTS+·)法用于從混合物中在線篩選自由基清除劑或抗氧化物質(zhì)以來，關(guān)于該方法或由其所改進(jìn)方法的應(yīng)用已有較多報(bào)道。

3 展望

總之，與傳統(tǒng)的不具備分離功能且以混合物的總抗氧化能力為基礎(chǔ)的化學(xué)評(píng)價(jià)法相比，雖然HPLC－DPPH·(ABTS+·)耦合篩選法有很大的改進(jìn)和優(yōu)勢(shì)。但由于這些抗氧化實(shí)驗(yàn)是在體外進(jìn)行，因此其結(jié)果并不能真正反映細(xì)胞生理狀況，也沒有考慮生理活性和代謝問題。另外，在疾病預(yù)防和健康促進(jìn)方面，清除自由基也遠(yuǎn)不是抗氧化劑的活性作用機(jī)制;同時(shí)，動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)法代價(jià)過高也不太適合用于食品和膳食補(bǔ)劑中抗氧化劑的初級(jí)篩選。因此，有必要在動(dòng)物研究和人體臨床實(shí)驗(yàn)之前用培養(yǎng)細(xì)胞模型來開展抗氧化研究，但該方法的局限是不能評(píng)價(jià)混合物中的單個(gè)成分。所以，如果能將該方法和HPLC－DPPH·(ABTS+·)耦合在線篩選法有效結(jié)合在一起從而對(duì)活性成分進(jìn)行篩選和表征，將具有重要的科學(xué)理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

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Progress of chromatography screening for phenolic antioxidants from foods

ZHANG Qing－an1，F(xiàn)AN Xue－h(huán)ui2，ZHANG Zhi－qi3
(1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Xi’an 710062，China; 2.College of physical education，Xi’an 710062，China; 3.School of Chemistry and Materials Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

The oxidation，anti－oxidation，phenolic antioxidants and its research developmentofLiquid Chromatography screening were reviewed.The view for the research in this field was also taken.

phenol;antioxidantion;chromatography;screening

TS201.1

A

1002－0306(2011)11－0480－04

2010－10－18

張清安(1976－)，男，博士，講師，研究方向:食品功能成分色譜篩選與開發(fā)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20875060)。