微生物合成共軛亞油酸機(jī)理的研究進(jìn)展

周 倩，劉 佩，李海霞，阮 暉，何國(guó)慶

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310029)

微生物合成共軛亞油酸機(jī)理的研究進(jìn)展

周 倩，劉 佩，李海霞，阮 暉，何國(guó)慶*

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310029)

相比于共軛亞油酸(CLA)的化學(xué)合成，微生物合成CLA與化學(xué)法具有培養(yǎng)靈活、對(duì)設(shè)備要求低、產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。主要討論了微生物合成CLA的研究進(jìn)展，亞油酸(LA)能被微生物轉(zhuǎn)化的原因，以及微生物合成CLA的機(jī)理。CLA的合成機(jī)理從微生物在動(dòng)物瘤胃內(nèi)混合發(fā)酵代謝LA和單一微生物在體外合成CLA兩方面進(jìn)行闡述。

共軛亞油酸，亞油酸，蓖麻油酸，微生物合成機(jī)理

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)CLA)是人體必需脂肪酸亞油酸(Linoleic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)LA)的一組位置和構(gòu)象異構(gòu)體的總稱(chēng)，是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸。其中，具有生理活性的只有順9，反11－CLA(c9，t11－CLA)和反10，順12－CLA(t10，c12－CLA)兩種［1］。c9，t11－CLA又被命名為瘤胃酸，廣泛存在于人類(lèi)和動(dòng)物體內(nèi)。隨著大量動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，對(duì)CLA的研究日漸深入，人們發(fā)現(xiàn)CLA具有抗癌、抗心血管疾病、抗糖尿病、減肥、免疫調(diào)節(jié)等［2］諸多生理功能。

1 微生物合成CLA

CLA的合成主要有化學(xué)法和微生物法兩種。根據(jù)反應(yīng)機(jī)理的不同，化學(xué)法可分為∶碳負(fù)離子歷程、碳正離子歷程、自由基歷程、加成消除歷程、Ⅷ族金屬或其化合物催化的共軛化等［3］。但是，化學(xué)合成法會(huì)不可避免地產(chǎn)生一系列CLA異構(gòu)體混合物、飽和或不飽和脂肪酸;雖操作成本較低，但分離效率差，需要多次反復(fù)操作，活性CLA提純工藝繁瑣［2］。

微生物合成CLA相比具有很多優(yōu)勢(shì)，微生物培養(yǎng)靈活、不需要高溫高壓環(huán)境;產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單，通常微生物只專(zhuān)一合成特定的具有生理活性的CLA異構(gòu)體［4－5］。

1.1 菌株

合成CLA的微生物包括瘤胃菌、乳酸菌、丙酸菌等三大類(lèi)。瘤胃菌主要是溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)，可以將LA轉(zhuǎn)化為以c9，t11－CLA異構(gòu)體為主的混合物［3，6］。但溶纖維丁酸弧菌需要嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)，且合成的異構(gòu)體種類(lèi)復(fù)雜，限制了在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。

乳酸 菌 包 括 嗜 酸 乳 桿 菌 (Lactobacillus acidophilus)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、綠色乳桿菌(Lactobacillus viridescens)、乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)和短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)等。乳酸菌是比較理想的菌種，它含有的亞油酸異構(gòu)酶(Linoleic acid isomerase，簡(jiǎn)稱(chēng)LAI)可以將LA轉(zhuǎn)化為具有生物活性的CLA異構(gòu)體，且產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單，已得到廣泛應(yīng)用。Lin等［7］認(rèn)為在培養(yǎng)液中添加適量乳糖和果糖有利于促進(jìn)乳酸菌CLA的合成。Yoon－Seok Song等［8］通過(guò)逐步增加LA濃度，提高短雙歧桿菌(B.breve)的LA耐受性，從而達(dá)到提高CLA產(chǎn)量的目的。

費(fèi)氏丙酸菌(Propionibacterium freudenreichii)是主要的CLA合成丙酸菌菌株。Li－Min Wang等［9］發(fā)現(xiàn)，費(fèi)氏丙酸菌(P.freudenreichii ssp.shermanii和P.freudenreichii ssp.freudenrei－chii)在SLM、MRS、脫脂乳培養(yǎng)基中均能合成CLA。梁新樂(lè)等［10］對(duì)費(fèi)氏丙酸菌HZ－P－35進(jìn)行細(xì)胞高密度培養(yǎng)，極大地提高了CLA產(chǎn)量。

1.2 底物

已發(fā)現(xiàn)可用于微生物合成 CLA的底物包括∶LA、蓖麻油酸(Ricinoleic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)RA)、蓖麻油、葵花籽油、豆油、紫花苜蓿種籽油、紅花籽油等。其中，以LA為底物最常見(jiàn)，也是研究得較深入的。

研究表明，含羥基脂肪酸是LA轉(zhuǎn)化合成CLA的中間產(chǎn)物。因此，蓖麻油酸(帶有C12羥基)也可以被乳酸菌利用，轉(zhuǎn)化為CLA［11］。蓖麻油中含有豐富的蓖麻油酸(約占總脂肪酸含量的88%)，但主要以甘油三酰形式存在，不能被直接利用，需要通過(guò)脂酶水解成游離蓖麻油酸［12］。

李有超［13］等研究了植物乳桿菌(L.plantarumANCLA 01)體外發(fā)酵添加葵花籽油的瘤胃液，優(yōu)化提高了CLA產(chǎn)量。Li－Min Wang［9］等研究表明，費(fèi)氏丙酸菌(P.freudenreichii)具有轉(zhuǎn)化葵花籽油為CLA的能力。

在脂酶水解甘油三酰鍵后，植物乳桿菌(L.plantarumLT2－6)洗滌細(xì)胞能將豆油(LA約占總脂肪酸含量的54%)轉(zhuǎn)化為CLA［14］。董明等［15］利用植物乳桿菌(L.plantarum6026)催化鹽生植物紫花苜蓿的種籽油(LA占總脂肪酸含量的30～35%)轉(zhuǎn)化為CLA，取得了較好的效果。郭焱等［16］以德氏乳桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線及硫酸二乙酯誘變后，獲得一株能將紅花籽油轉(zhuǎn)化為CLA的菌株。

1.3 方式

目前，大部分CLA的微生物合成都采用生長(zhǎng)細(xì)胞，即將活化后的菌株直接接種到培養(yǎng)液中，使微生物細(xì)胞邊生長(zhǎng)邊轉(zhuǎn)化合成 CLA［17－18］。此法操作簡(jiǎn)單，CLA合成所需周期通常較短。但存在不足之處——高濃度LA會(huì)抑制微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)，降低CLA 產(chǎn)率［19－20］。

靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成CLA專(zhuān)一性好，且能添加高濃度底物，從而獲得CLA的高產(chǎn)量。但是，離心獲得靜息細(xì)胞需要在4℃條件下進(jìn)行，操作步驟多，易導(dǎo)致LAI失活，限制了在工業(yè)上的應(yīng)用。鈕曉燕等［21］優(yōu)化了植物乳桿菌ZS2058靜息細(xì)胞產(chǎn)CLA條件，發(fā)現(xiàn)該菌具有很強(qiáng)的專(zhuān)一性∶c9，t11－CLA占總CLA的96.4%。Shigenobu Kishino等［22］從14株乳酸菌中篩選出的植物乳桿菌(L.plantarumAKU 1009a)靜息細(xì)胞具有高產(chǎn)CLA能力;培養(yǎng)96h后，t9，c11－CLA含量占總CLA的98%。

Lin 等［23］破 碎 嗜 酸 乳 桿 菌 (L.acidophilusCCRC14079)以及費(fèi)氏丙酸菌(P.freudenreichii ssp.ShermaniiCCRC11076)細(xì)胞，直接用粗酶液轉(zhuǎn)化LA，產(chǎn)物以t10，c12－CLA、c11，t13－CLA和c9，t11－CLA三種異構(gòu)體為主，表明LAI可直接用于合成CLA。隨后，Lin［24］研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌保加利亞亞種(L.delbrueckii ssp.bulgaricusCCRC14009)靜息細(xì)胞和粗酶液均可以轉(zhuǎn)化LA為CLA。

2 微生物利用亞油酸的原因

LA對(duì)費(fèi)氏丙酸菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等產(chǎn)CLA乳酸菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。胡國(guó)慶［19］等發(fā)現(xiàn)，在脫脂奶、豆奶、番茄三種培養(yǎng)基中，LA對(duì)植物乳桿菌ZS2058都有抑制作用。且隨著LA濃度的增大，抑制作用越來(lái)越明顯。張中義［25］也認(rèn)為，低濃度LA對(duì)植物乳桿菌LT2－6的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。當(dāng)LA增至0.1%時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)以及CLA的合成均受到抑制。Lin等［20］采用嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種以及德氏乳桿菌乳球菌亞種，LA添加量由1000mg/mL增至5000mg/mL時(shí)，CLA的產(chǎn)量反而降低，這與 Boyaval等［26］和 Jiang等［27］的報(bào)道一致。Li－Ming Wang［9］等發(fā)現(xiàn)底物濃度過(guò)高時(shí)，在 SLM、MRS、脫脂乳三種培養(yǎng)基中，費(fèi)氏丙酸桿菌的生長(zhǎng)均受到明顯抑制。此外MRS是合成CLA的最佳培養(yǎng)基，主要是因?yàn)镸RS中的吐溫－80不僅可以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，還可以改變細(xì)胞膜通透性，緩解LA的抑制作用。

早在1954年，Nieman C［28］曾報(bào)道，游離脂肪酸易改變革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞膜的通透性，LA在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化為CLA可能是細(xì)菌的一種自我解毒作用。Dawson等［29］認(rèn)為，瘤胃菌為了消除LA對(duì)細(xì)胞的毒害作用，而將其轉(zhuǎn)化為CLA。但是，LA濃度過(guò)高時(shí)，這一過(guò)程反而受到抑制，無(wú)法完全進(jìn)行，細(xì)菌也因此而停止生長(zhǎng)［19］。Kepler［30］等認(rèn)為，LA可能會(huì)誘發(fā)乳酸菌對(duì)于多不飽和脂肪酸的解毒機(jī)制。一種途徑就是通過(guò)氫化作用，將LA轉(zhuǎn)變?yōu)槭颂家幌┧?，而CLA是這一氫化過(guò)程的中間產(chǎn)物［11］。

3 CLA的合成機(jī)理

CLA的合成最初是在瘤胃中發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)人們從動(dòng)物瘤胃液、土壤、泡菜等原材料中分離出單一的具有CLA合成能力的微生物，并在體外模擬瘤胃液中CLA的合成或直接把分離的微生物加入MRS、脫脂乳等培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)化其產(chǎn)CLA能力。由于分離獲得的原始菌株CLA合成能力較低，人們通過(guò)紫外誘變、離子對(duì)注入、硫酸二乙酯、亞硝基胍等誘變處理，獲得了CLA高產(chǎn)菌株。

CLA在瘤胃中的合成是一系列黏附在胃壁上或從食物中獲得的瘤胃微生物協(xié)同作用的結(jié)果。CLA合成后，可進(jìn)入細(xì)胞或通過(guò)分泌乳汁的形式排出體外。CLA的體外合成由單一微生物即可完成，因此，CLA的提取工藝也較簡(jiǎn)單。

3.1 CLA在瘤胃中的合成機(jī)理

瘤胃中存在多種CLA合成微生物。Uniya等［31］從牛的瘤胃中分離到幾種乳酸菌，其中短乳桿菌(L.brevis)、綠色乳桿菌(L.viridescens)和乳酸桿菌(L.lactis)還可用于體外合成CLA。Choi等［32］認(rèn)為，瘤胃中CLA的合成主要是瘤胃微生物的氫化還原作用。采用瘤胃微生物混合發(fā)酵得到的CLA以c9，t11－CLA和t10，c12－CLA為主，不同的喂料方式所產(chǎn)生的CLA異構(gòu)體也不同;酸性和有氧氣存在的條件，有利于合成t10，c12－CLA。Kepler［6］等發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸的氫化作用是在瘤胃微生物的酶結(jié)合蛋白作用下完成的。不同的喂料方式、碳水化合物的種類(lèi)等可以改變瘤胃微生物菌群構(gòu)造，從而影響脂肪酸的代謝［32－33］。

食物中的脂類(lèi)化合物進(jìn)入瘤胃后，首先在瘤胃微生物分泌的脂酶作用下，水解甘油三酰、磷脂、糖脂等形式的脂質(zhì)，形成游離脂肪酸。然后游離多不飽和脂肪酸再通過(guò)氫化作用進(jìn)一步被還原。由于合成CLA的酶只作用于游離多不飽和脂肪酸，影響脂質(zhì)水解程度的因素都會(huì)限制脂肪酸的轉(zhuǎn)化。這一過(guò)程是瘤胃中許多定植微生物、從食物中獲得的外源微生物及其酶的綜合作用結(jié)果［34］。

1984年，Kemp等［35］根據(jù)代謝途徑的不同，將瘤胃中氫化還原作用涉及的微生物分為兩類(lèi)∶第一類(lèi)，將18碳的多不飽和脂肪酸逐步還原為十八碳一烯酸;第二類(lèi)，將十八碳一烯酸進(jìn)一步還原為硬脂酸?？梢?jiàn)，CLA等十八碳二烯酸是這一氫化過(guò)程的中間產(chǎn)物。后來(lái)，人們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些瘤胃菌可以直接將18碳的多不飽和脂肪酸氫化為硬脂酸［36］。

圖1 瘤胃內(nèi)脂類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟

游離脂肪酸(以LA為例)被釋放出來(lái)后，瘤胃內(nèi)的微生物通過(guò)異構(gòu)化作用，將C12的順式雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)镃11的反式共軛雙鍵，生成瘤胃酸。然后，在還原酶的作用下，瘤胃酸的C9雙鍵被氫化為反式十八碳一烯酸。最后，C11雙鍵也被氫化還原形成硬脂酸。硬脂酸的形成是限速步驟，因此，瘤胃中能檢測(cè)到瘤胃酸和反式十八碳一烯酸的存在。瘤胃酸和反式十八碳一烯酸是游離脂肪酸氫化還原過(guò)程的中間產(chǎn)物［34，37－38］。

3.2 CLA的體外合成機(jī)理

根據(jù)底物的不同，從兩方面闡述CLA的體外合成機(jī)理∶以LA為底物，包括以豆油等富含LA的油脂進(jìn)行的CLA合成;以RA為底物，包括以富含RA的蓖麻油等的CLA合成。

3.2.1 亞油酸 2001年，Jun Ogawa等［12，39］對(duì)嗜酸乳桿菌(L.acidophilusAKU 1137)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化LA為CLA的機(jī)理進(jìn)行了研究，首次對(duì)微生物催化合成CLA原理進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)中，Jun Ogawa等檢測(cè)到10－羥基－順－12－十八碳一烯酸、10－羥基－反－12－十八碳一烯酸和c9，t11－CLA、t9，t11－CLA的存在。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，10－羥基－順－12－十八碳一烯酸和10－羥基－反－12－十八碳一烯酸的含量逐漸降低，而c9，t11－CLA和t9，t11－CLA的含量逐漸增加。表明10－羥基－順－12－十八碳一烯酸和10－羥基－反－12－十八碳一烯酸可能是LA轉(zhuǎn)化為CLA過(guò)程的中間產(chǎn)物，CLA的合成并不是直接由非共軛雙鍵異構(gòu)化為共軛雙鍵的。此外，Jun Ogawa的研究還發(fā)現(xiàn)，合成CLA的酶是誘導(dǎo)酶，必須在LA的存在下才能產(chǎn)生，但具體作用機(jī)制尚不清楚。

圖2 微生物催化LA轉(zhuǎn)化合成CLA步驟

但是，鈕曉燕等［21］以植物乳桿菌 ZS2058轉(zhuǎn)化LA時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，伴隨著大量羥基脂肪酸的產(chǎn)生，c9，t11－CLA含量逐漸減少;以CLA (c9，t11－CLA和t10，c12－CLA的混合樣品)為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，c9，t11－CLA被轉(zhuǎn)化為羥基脂肪酸。因此他們認(rèn)為，c9，t11－CLA可能是該菌株合成羥基脂肪酸過(guò)程的中間產(chǎn)物。

3.2.2 蓖麻油酸 以蓖麻油酸為底物合成CLA可能存在兩種機(jī)制∶C12上的羥基鍵斷裂，脫去一分子水，形成C11雙鍵，直接一步反應(yīng)合成CLA;分為三步，首先是C12的羥基鍵斷裂，脫水形成C12雙鍵，即先合成LA;然后LA再通過(guò)兩步異構(gòu)化為CLA。研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌(L.plantarumAKU 1009a)在添加α－亞麻酸誘導(dǎo)培養(yǎng)后獲得的靜息細(xì)胞具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)化RA為CLA的能力;以LA為底物時(shí)，CLA產(chǎn)量很低，表明第一種轉(zhuǎn)化機(jī)制的存在。在產(chǎn)物中可以檢測(cè)出LA和羥基脂肪酸，表明第二種轉(zhuǎn)化機(jī)制也同樣存在［12］。

蓖麻油必須通過(guò)脂酶作用，水解甘油三酰鍵使蓖麻油酸游離出來(lái)后，才能被乳酸菌利用。Akinori Ando等［40］研究了14種脂酶的作用效果，發(fā)現(xiàn)脂酶M“Amano”10的加入最有利于CLA的合成。同時(shí)，采用植物乳桿菌(L.plantarumJCM1551)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化蓖麻油時(shí)，添加適量去垢劑Lubrol PX(聚氧化乙烯乙醚W－1)可以增加CLA產(chǎn)量。

目前，關(guān)于CLA合成機(jī)理的研究相對(duì)較少，人們主要關(guān)注的仍是如何提高微生物合成CLA的產(chǎn)量以及CLA的生理功能。微生物合成CLA是通過(guò)LAI的催化作用，但是，該酶是只作用于CLA合成中的某一步，還是整個(gè)過(guò)程，目前仍不清楚，需要更多的后續(xù)研究。

圖3 微生物催化RA轉(zhuǎn)化合成CLA步驟

4 展望

由于化學(xué)法合成CLA產(chǎn)物分離復(fù)雜、繁瑣、合成條件苛刻，利用CLA高產(chǎn)菌株進(jìn)行微生物合成不失為更好地選擇。微生物法反應(yīng)條件溫和、設(shè)備要求低、產(chǎn)物分離簡(jiǎn)單。其中，以乳酸菌最為合適——大多數(shù)產(chǎn)CLA乳酸菌是人體益生菌，發(fā)酵成本低廉，發(fā)酵條件易控制，產(chǎn)物對(duì)人體安全，用來(lái)生產(chǎn)CLA可以直接應(yīng)用于食品或精制成藥品。但是，關(guān)于CLA的微生物合成機(jī)理研究得還不夠透徹，存在諸多未解之處。

CLA的生理功能及健康意義已得到廣泛認(rèn)同?；诖耍珻LA已被應(yīng)用于藥品、保健品、功能食品、化妝品等領(lǐng)域。關(guān)于CLA應(yīng)用于藥品的臨床報(bào)道較少，但CLA具有減肥、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用已被證實(shí)，相信不久后CLA一定會(huì)是治療這類(lèi)疾病的良藥。目前，市場(chǎng)上已出現(xiàn)多種CLA保健品，作為營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑或減肥食品吸引了大量顧客。聯(lián)合利華公司也曾推出過(guò)添加CLA的“歲月奇跡”系列護(hù)膚品。由此可見(jiàn)，CLA對(duì)人類(lèi)健康意義重大，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Research progress in the mechanism of conjugated linoleic acid producing by microorganisms

ZHOU Qian，LIU Pei，LI Hai－xia，RUAN Hui，HE Guo－qing*
(School of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Compared withthevariouschemicalmethods，conjugated linoleic acid(CLA)producing by microorganisms has predominant advantages.For example，it’s convenience to be cultured and easy to be isolated.This paper gave a review of current bio－production of CLA，comprehensively discusses the reason why linoleic acid(LA)can be converted by microorganisms and the mechanism of CLA’s bio－production.Plus，the last one was divided into two parts:how CLA was formed in rumen by the co－operation of several microorganisms，and the mechanism of CLA’s transformation by only one bacterium in vitro.

conjugated linoleic acid;linoleic acid;ricinoleic acid;mechanism of producing conjugated linoleic acid

TS201.1

A

1002－0306(2011)11－0468－05

2010－09－14 *通訊聯(lián)系人

周倩(1986－)，女，碩士，研究方向:食品科學(xué)。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA100402)。