油菜蜂花粉油亞臨界萃取及其HPLC分析

江赟博，張高揚(yáng)，韓 玲，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070; 2.天水西聯(lián)蜂業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅天水 741000)

油菜蜂花粉油亞臨界萃取及其HPLC分析

江赟博1，張高揚(yáng)2，韓 玲1，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070; 2.天水西聯(lián)蜂業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅天水 741000)

采用亞臨界萃取油菜蜂花粉油，探討了萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間對提取率的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳工藝條件。結(jié)果表明:在萃取壓力0.9MPa，萃取溫度30℃，萃取時(shí)間3h下，效果最佳，測得提取率為73.667%。經(jīng)HPLC分析，共鑒定出16種脂肪酸和2種維生素，測定其相對含量:不飽和脂肪酸占63.83%，亞麻酸等n－3系列不飽和脂肪酸為24%，亞油酸、花生四烯酸等n－6系列不飽和脂肪酸的含量為20.87%，維生素A 53mg/100g，維生素E 780mg/100g。

亞臨界萃取，油菜蜂花粉，高效液相色譜

亞臨界流體萃取(SFE，sub－critical fluid extraction)，利用亞臨界流體(在溫度高于其沸點(diǎn)但低于臨界溫度，且壓力低于其臨界壓力的條件下，以流體形式存在的物質(zhì))作為萃取劑，在密閉、無氧、低壓的壓力容器內(nèi)，通過萃取物料與萃取劑在浸泡過程中的分子擴(kuò)散過程，使固體物料中的脂溶性成分轉(zhuǎn)移到液態(tài)的萃取劑中，再通過減壓蒸發(fā)過程將萃取劑與目的產(chǎn)物分離，最終得到目的產(chǎn)物的一種新型萃取與分離技術(shù)［1］;相對于超臨界而言，其具有提取壓力度低、生產(chǎn)能力高及成本低的特點(diǎn);而相對于傳統(tǒng)溶劑提取而言，具有提取時(shí)間短，提取溫度低，萃余物清潔、不變性，生產(chǎn)過程綠色環(huán)保的特點(diǎn)。油菜蜂花粉(Rape Bee Pollen)是工蜂利用自身的特殊構(gòu)造從油菜花的花藥內(nèi)采集的花粉粒，經(jīng)過蜜蜂向其混入花蜜和唾液，加工成不規(guī)則的橢球形，由蜜蜂后肢上的花粉筐攜帶回蜂巢的團(tuán)狀物［2］。由于其營養(yǎng)豐富全面，而且配比平衡，被譽(yù)稱為“微型營養(yǎng)庫”［3］。油菜蜂花粉中脂肪類化合物豐富，約占8.34%［4］，而且飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例合理，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)前景。油菜蜂花粉的研究主要集中于營養(yǎng)成分的分析，而對油菜蜂花粉油的研究不多，且主要集中在石油醚萃取和超臨界CO2萃取。本實(shí)驗(yàn)利用亞臨界萃取技術(shù)萃取油菜蜂花粉油，并對其進(jìn)行HPLC分析。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

油菜蜂花粉由天水西聯(lián)蜂業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)高壓氣流破壁處理后備用;亞臨界流體萃取劑HFC－134A(1，1，1，2－四氟乙烷) 甘肅天工生物科技有限公司;石油醚 天津化學(xué)試劑有限公司。

亞臨界萃取裝置 甘肅天工生物科技有限公司;5056型高效液相色譜儀 美國Varian公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞臨界萃取技術(shù)萃取油菜蜂花粉油

1.2.1.1 工藝流程

1.2.1.2工藝過程 原料處理∶油菜破壁花粉經(jīng)壓坯機(jī)壓坯，稱量后放入萃取釜。

萃取∶將亞臨界流體萃取劑在溫度＜35℃，壓力＜0.8MPa的狀態(tài)下壓縮為液態(tài)，注入萃取釜中與花粉坯攪拌混合;保持萃取溶劑與花粉坯的體積比大于2∶1，控制溶劑溫度低于35℃、系統(tǒng)壓力0.6～1.1MPa、萃取時(shí)間為30min，過濾分離固液相，將液相混合溶液輸送進(jìn)入暫存釜罐，完成一次浸泡提取。

解析∶待多次浸泡提取后，暫存釜的混合溶液經(jīng)高壓隔膜泵輸送注入一級解析釜;在1×104～5× 105Pa的壓力范圍，始終保持混合溶液溫度高于其沸點(diǎn)，經(jīng)噴射器在解析釜噴射擴(kuò)散后解析蒸發(fā)，完成溶劑與溶質(zhì)的初步分離。

真空脫溶∶一級解析并初步分離的混合溶液經(jīng)隔膜泵輸送注入二級解析釜，在1×104～5×10－2Pa真空度，溫度為10～50℃的狀態(tài)下，溶劑進(jìn)一步解析蒸發(fā)，完成溶劑與溶質(zhì)的完全分離。平壓至0.1MPa，關(guān)閉閥門，放出油菜花粉油。

溶劑回收∶解析蒸發(fā)呈氣態(tài)的溶劑，經(jīng)真空泵組抽提、壓縮機(jī)組壓縮后進(jìn)入緩沖罐;解析蒸發(fā)呈氣態(tài)的溶劑蒸汽在高壓區(qū)和低壓區(qū)的壓差作用下進(jìn)入列管式主冷凝器進(jìn)行熱交換，循環(huán)水帶走壓縮產(chǎn)生的熱能，氣態(tài)溶劑轉(zhuǎn)化為飽和液體后返回溶劑儲罐。解析釜中的溶劑分階段壓縮、冷卻、回收溶媒。

1.2.1.3 提取率的計(jì)算 油菜蜂花粉油的提取率與出油率的計(jì)算公式。如下所示∶

1.2.2 傳統(tǒng)溶劑法 采用索氏抽提法回流12h，提取油菜蜂花粉油。與亞臨界萃取相比較。

1.2.3 HPLC分析 色譜條件∶色譜柱∶Diamonsil C18(5μm，4.6mm×250mm)，柱溫30℃;二級管陣列檢測器∶波長215nm;流動(dòng)相∶pH3.0，0.3甲醇+0.05mol/L磷酸二氫鈉緩沖溶液;流速∶1mL/min;進(jìn)料量∶20μL。

分析方法∶精確移取各種脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)液配制成不同濃度的混標(biāo)液，用混標(biāo)液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限的確定。根據(jù)保留時(shí)間和二級管陣列檢測器所得紫外吸收譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對比，對各種脂肪酸極性定性分析，用峰面積按外標(biāo)法定量分析含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞臨界萃取技術(shù)萃取油菜蜂花粉油

2.1.1 萃取壓力對提取率的影響 在萃取溫度28℃，選擇萃取壓力為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0MPa五個(gè)水平，進(jìn)行萃取3h，研究不同萃取壓力對提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 萃取壓力對提取率的影響

結(jié)果表明，在恒定的溫度條件下，隨著壓力的升高，油菜蜂花粉油在亞臨界溶劑中的溶解度不斷提高，提取率上升。這是由于壓力的提高，增大了亞臨界溶劑的密度，其溶解能力也隨之增大［5］。但隨著壓力的繼續(xù)增大，這種提高趨于平緩。如圖1所示，在萃取壓力0.6MPa提高到0.7MPa時(shí)，提取率顯著增加，但進(jìn)一步提高壓力，提取率變化不大。可見0.8MPa是最佳的萃取壓力，僅僅是超臨界壓力的1/35。

2.1.2 萃取溫度對提取率的影響 分別設(shè)置24、26、28、30、32、34℃六個(gè)萃取溫度梯度，在萃取壓力0.8MPa進(jìn)行萃取3h，研究不同萃取溫度對提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取溫度對提取率的影響

由圖2可知，隨著萃取溫度的升高，提取率逐漸提高。而當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，提取率增加的比較平緩。在亞臨界萃取過程中，隨著溫度升高，萃取劑擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)都會(huì)增大，有利于透過物料表層進(jìn)入深層，加速待取成分的溶解，有利于萃?。?］。但是，提高溫度一方面會(huì)加快萃取劑的汽化，增加體系的壓力;另一方面，溫度過高，不利于油脂抗氧化。這樣不僅提高了生產(chǎn)成本，而且增大了體系的危險(xiǎn)性。結(jié)合這兩方面的考慮，將油菜蜂花粉油的萃取溫度定為28℃。

2.1.3 萃取時(shí)間與提取率的關(guān)系 在萃取溫度28℃，萃取壓力0.8MPa的條件下，選擇萃取時(shí)間為1、2、3、4、5h五個(gè)水平，進(jìn)行萃取，研究不同萃取時(shí)間對提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取時(shí)間對提取率的影響

萃取時(shí)間是影響油菜蜂花粉油提取率的另一個(gè)重要因素。由圖3可見，花粉油的提取率隨提取時(shí)間的延長而提高，但是，3h后再延長時(shí)間，提取率進(jìn)一步提高的程度比較小。這是由于提取時(shí)間的進(jìn)一步延長，花粉油在萃取釜內(nèi)溶解度趨于飽和，提取率變化平緩，這說明萃取時(shí)間并不是越長越好［7］。出于能耗和生產(chǎn)成本的考慮，將3h確定為最佳萃取時(shí)間。

2.1.4 亞臨界萃取工藝優(yōu)化 根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合設(shè)備條件和工業(yè)化可行性，進(jìn)行工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，采用L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，研究萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間對花粉油提取率的影響。因素水平選取見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2以及方差分析表3所示。

表1 亞臨界萃取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 亞臨界萃取工藝條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，a.RA、RB、RC均＞Re值，說明三種因素都不同程度影響著提取效果，結(jié)果是可靠的。b.從RA＞RB＞RC可知，萃取壓力是決定提取率的主要因素，其次是萃取溫度，萃取時(shí)間影響較小。方差分析進(jìn)一步表明，萃取壓力對提取率影響極顯著(Sig＜0.05)。c.從各因素水平對膨化度的影響看，在萃取壓力中，KA3＞KA2＞KA1，說明壓力越大，提取率越高，但在單因素實(shí)驗(yàn)中，壓力在1.0MPa時(shí)的提取率與0.9MPa時(shí)無明顯差異，故本研究選用的萃取壓力為0.9MPa;在萃取溫度中，KB3＞KB2＞KB1，表明提取率與溫度成正比，但KB3與KB2基本相等，即30℃與32℃時(shí)的提取率基本相同。d.綜合各因子的影響，本研究最終確定最佳提取參數(shù)組合為A3B2C1，即萃取壓力0.9MPa，萃取溫度30℃，萃取時(shí)間3h。

2.1.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照上面所得出的油菜蜂花粉油提取的最佳工藝條件，分別進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其提取率分別為 73.5%、73.6%和 73.9%，平均值為73.667%，符合正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

2.2 亞臨界萃取油菜蜂花粉油與傳統(tǒng)溶劑法萃取的比較

亞臨界萃取油菜蜂花粉油與傳統(tǒng)溶劑法萃取的比較，如表4所示。

表4 亞臨界萃取油菜蜂花粉油與傳統(tǒng)溶劑法萃取的比較

亞臨界萃取類似于傳統(tǒng)溶劑萃取，與傳統(tǒng)溶劑萃取工藝相比，出油率低于傳統(tǒng)溶劑法，但在同等提取率指標(biāo)下，可縮短提取時(shí)間200%左右，溶媒存在于閉路系統(tǒng)而使其損耗和排放污染均顯著低于溶劑萃取，由于萃取溫度低，并避免了傳統(tǒng)溶劑依靠較高溫度實(shí)現(xiàn)脫除和回收的高耗能工序，因而綜合能耗可降低40%左右，而且保證了制品的生物活性。絕大多數(shù)有機(jī)溶劑易燃易爆，而“HFC－134a”卻無此危險(xiǎn)。此外，“HFC－134a”亞臨界萃余物不受溶劑污染，原有的水溶性成分以及蛋白等物質(zhì)不變性，仍可用做飼料或繼續(xù)提取剩余的極性成分［8］。

2.3 油菜蜂花粉脂肪油HPLC分析

由表5可見，花粉油中飽和脂肪酸為33.31%，單不飽和脂肪酸10.40%，多不飽和脂肪酸53.43%，不飽和脂肪酸占63.83%，幾乎占總脂肪的2/3，亞麻酸等n－3系列不飽和脂肪酸為24%，亞油酸、花生四烯酸等n－6系列不飽和脂肪酸的含量為20.87%。還含有780mg/100g的維生素E和53mg/100g的維生素A。

我國DRIS推薦，膳食脂肪中SFA(飽和脂肪酸)∶MUFA(單不飽和脂肪酸)∶PUFA(多不飽和脂肪酸)之間比例宜為1∶1∶1，n－6∶n－3宜為4∶1［9］。由于植物油工業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展，普通膳食中飽和脂肪酸占比過高(高于不飽和脂肪酸2～3倍)，n－6占比過高(高于n－3系列10～20倍)，人類膳食脂肪結(jié)構(gòu)惡化，與心血管疾病、癌癥、免疫應(yīng)答下降、肥胖等慢性病增加有密切關(guān)系。

表5 油菜蜂花粉油脂肪酸與脂溶性維生素組成及含量

花粉脂肪萃取物中PUFA、n－3系列和維生素A、維生素E較高，是人體自身不能合成的、不可缺少的營養(yǎng)成分。大量資料表明，花粉脂肪酸和維生素A、維生素E，對維持機(jī)體免疫平衡、清除自由基、延緩機(jī)體衰老、促進(jìn)心血管健康、抑制癌癥、保護(hù)大腦和視網(wǎng)膜有重要作用。并且亞臨界－超臨界萃取得到的花粉油沒有有機(jī)溶劑殘留，食用安全可靠。

3 結(jié)論

利用亞臨界萃取法提取油菜蜂花粉油的最佳工藝為∶萃取溫度30℃，萃取壓力0.8MPa，萃取時(shí)間3h。在此工藝下的提取率為73.667%。

亞臨界萃取的花粉油為橘紅色油狀液，不飽和脂肪酸占63.83%，亞麻酸等n－3系列不飽和脂肪酸為24%，亞油酸、花生四烯酸等n－6系列不飽和脂肪酸的含量為20.87%。維生素 A 53mg/100g，維生素 E 780mg/100g。花粉油含豐富的多不飽和脂肪酸特別是n－3系列，脂肪酸營養(yǎng)結(jié)構(gòu)優(yōu)越，保健價(jià)值高。

亞臨界萃取類似于傳統(tǒng)溶劑萃取，與傳統(tǒng)溶劑萃取工藝相比，具有提取時(shí)間短、提取溫度低、萃余物清潔、不變性、生產(chǎn)過程綠色環(huán)保的特點(diǎn);與超臨界萃取工藝相比，具有提取壓力低、系統(tǒng)安全性高、生產(chǎn)能力大、設(shè)備投資少的特點(diǎn)。作為一種高新分離提取技術(shù)，在功能油脂提取中有著廣泛的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步探討。

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［3］葉振生，蜂產(chǎn)品深加工技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2003:164－165.

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Study on the sub－critical fluid extraction of rape bee pollen oil and its HPLC analysis

JIANG Yun－bo1，ZHANG Gao－yang2，HAN Ling1，*
(1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China; 2.Tianshui Western Union Bee Co.，Ltd.，Tianshui 741000，China)

The extraction of fatty oils from rape bee pollen with sub－critical fluid extraction technology was studied. The effects of extraction pressure，extraction temperature and extraction time were discussed.The optimal condition of this method was extraction pressure 0.9MPa，extraction temperature 30℃ and extraction time 3h，the highest extraction rate reached 73.667%.With a HPLC analysis，16 fatty acids and 2 vitamins were identified and their relative contents were determined by normalization method of area.The analyzed results exhibited that polyunsaturated acids accounted for 63.83%，n－3 polyunsaturated fatty acids for 24%，n－6 polyunsaturated fatty acids for 20.87%，Vitamin A for 53mg/100g and Vitamin E for 780mg/100g.

sub－critical fluid extraction;rape bee pollen;HPLC

TS225.1+9

B

1002－0306(2011)11－0328－04

2011－01－04 *通訊聯(lián)系人

江赟博(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:動(dòng)物性食品加工及貯藏保鮮。

鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)(1006NCXE017);甘肅省科技廳甘肅省星火計(jì)劃項(xiàng)目。