蕓豆蛋白酶解物不同脫鹽工藝的比較研究

張 飛，任海偉，唐學慧，李 雪，袁亞蘭，高瑜璟，蘇雪艷

(蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730050)

蕓豆蛋白酶解物不同脫鹽工藝的比較研究

張 飛，任海偉*，唐學慧，李 雪，袁亞蘭，高瑜璟，蘇雪艷

(蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730050)

分別將離子交換樹脂法和大孔吸附樹脂法用于對蕓豆蛋白酶解物(KBPHs)的脫鹽工藝，并對其進行比較研究，分析脫鹽前后KBPHs的理化成分和DPPH·清除活性。結果表明，大孔吸附樹脂對KBPHs的脫鹽效果優(yōu)于離子交換樹脂。靜態(tài)吸附和解吸實驗表明，H103樹脂的吸附性能優(yōu)于其他3種樹脂。動態(tài)脫鹽的最佳條件為:pH4.5、濃度45.5mg/mL的KBPHs液以1BV/h的流速上樣、1BV/h的流速水洗、2mL/min的80%乙醇解吸。該條件下，H103大孔樹脂對KBPHs的脫鹽率為87.31%，回收率達82.37%。脫鹽后KBPHs中灰分含量僅為1.81%，DPPH·清除活性的HSC50值為0.53mg/mL。

蕓豆蛋白酶解物，離子交換樹脂，大孔吸附樹脂，脫鹽，DPPH·清除活性

蕓豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp)學名菜豆，是普通菜豆和多花菜豆之總稱，屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus L.)的小宗雜糧作物。蕓豆不僅蛋白含量高，而且必需氨基酸組成與FAO/WHO模式相近，具有很高的營養(yǎng)價值。蕓豆蛋白酶解制備的抗氧化肽具有安全性高、消化吸收快等特點，但由于酶解過程中不斷加入酸堿溶液來調節(jié)反應體系的pH，導致產品中殘留大量無機鹽。這些無機鹽成分不僅影響最終產品的口感，而且影響其生物活性的進一步研究，因此必須進行脫鹽處理。目前的脫鹽方法有多種，如超濾、大孔吸附樹脂、凝膠層析和離子交換樹脂等，其中超濾適宜工業(yè)化生產，但由于多肽分子量較低，可能會造成低分子量多肽的損失，影響回收率;凝膠層析可用于實驗室分析;離子交換樹脂脫鹽本質上是利用離子交換樹脂與溶液中的離子發(fā)生交換反應進行分離純化，分離效率高，適用于組份的富集和高純物質的制備。大孔吸附樹脂主要通過分子間作用力如范德華力或氫鍵等進行吸附，由于樹脂與被分離成分間的吸附為物理吸附，被吸附的物質較易洗脫，所以成本低、效率高、穩(wěn)定性好［1］。本文將離子交換樹脂和大孔吸附樹脂用于蕓豆蛋白酶解物(KBPHs)的脫鹽工藝，并對其進行比較研究，以期探尋一種適于KBPHs脫鹽的新方法，分離得到活性強、純度高的產品，從而為產業(yè)化開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕓豆蛋白粉 以干基計，蛋白質含量95.47%，實驗室自制;Alcalase堿性蛋白酶 酶活力2.4× 105U/mL，Novo公司;2，2－二苯基－1－苦味肼基自由基(DPPH·，C18H12N5O6) Sigma公司;001×7(732)強酸性苯乙烯型陽離子交換樹脂、201×7(717)強堿性苯乙烯型陰離子交換樹脂 上海樹脂廠;D3520、H103、AB－8、S－8大孔吸附樹脂 南開大學化工廠;其余試劑 均為分析純。

ORION818pH計 美國奧立龍公司;FD－1型臺式冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司; WFJ2000紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;DDS電導率儀 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕓豆蛋白酶解物(KBPHs)的制備 將5%的蕓豆蛋白溶液(w/v)于90℃預處理10min，冷卻后調節(jié)pH為9. 0;然后加入Alcalase堿性蛋白酶(加酶量為2000U/g蛋白底物)，50℃恒溫水浴酶解6h，酶解過程中用1mol/L NaOH維持pH恒定。酶解結束后沸水浴10min鈍化酶，冷卻后調節(jié)pH為4.4，4000r/min離心10min，收集上清液備用。

1.2.2 離子交換樹脂脫鹽

1.2.2.1 樹脂的預處理 樹脂用酒精浸泡去除少量有機物質，再用超純水將樹脂中異物漂洗干凈，浸泡12h充分吸水膨脹。732陽離子交換樹脂采用酸－堿－酸方法處理，717陰離子交換樹脂采用堿－酸－堿方法處理［2］，處理后水洗至中性，濕法裝柱(3.6× 50cm)，待用。

1.2.2.2 離子交換樹脂最佳裝填量的確定 陰陽離子樹脂初始裝柱量各為300mL。將1L濃度為2% (w/v)酶解液先進入732陽離子柱，隨時測定流出液pH，由于交換了H+在溶液里面，從陽離子柱流出的溶液呈酸性，記錄陽離子交換樹脂飽和(流出液與原液pH相當)時的進樣量;同樣由717陰離子柱交換下來的OH－進入溶液，使流出液pH升高，記錄陰離子交換樹脂飽和時的進樣量，確定樹脂的最佳裝填量。

1.2.2.3 洗脫流速的確定 取1L濃度為2%(w/v)的酶解液在15℃條件下分別以1、3、5、8、10BV/h的流速依次通過陽、陰離子交換柱，并用少量超純水淋洗后收集流出液，測其氮回收率和脫鹽率。1

1

式中∶C1－原液鹽濃度(g/100mL);C2－流出液鹽濃度(g/100mL);V1－原液體積(mL);V2－流出液體積(mL)。

1.2.3 大孔吸附樹脂脫鹽

式中∶C1－原液含氮量(g/100mL);C2－回收液氮含量(g/100mL);V1－原液體積(mL);V2－回收液體積(mL)。

1.2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理 將一定量不同型號的大孔吸附樹脂先用無水乙醇浸泡24h，使樹脂充分溶脹后用無水乙醇洗至220nm處無吸收，再用超純水充分漂洗，洗凈乙醇，65℃下真空干燥，備用。

1.2.3.2 大孔吸附樹脂的篩選 在選定的實驗條件下對4種大孔吸附樹脂分別進行靜態(tài)吸附和解吸實驗。向250mL錐形瓶中加入2g預處理后的干樹脂，無水乙醇充分溶脹，用超純水洗凈乙醇。接著，加入濃度為30mg/mL的酶解液20mL，將錐形瓶放入搖床中室溫振蕩24h(振蕩速度200r/min)。振蕩結束后將樹脂與樣品溶液過濾分離，測定溶液中的肽濃度，并計算4種大孔吸附樹脂對KBPHs的吸附率、吸附量。然后選擇80%乙醇作為洗脫劑，對已經吸附酶解液的樹脂進行解吸，計算解吸率。

1.2.3.3 H103樹脂動態(tài)吸附及解吸特性的研究 將處理后的H103樹脂裝滿層析柱(2.5cm×60cm)備用。首先進行預實驗，確定H103樹脂脫鹽的部分參數，即標準上樣溶液的最佳pH為4.5，KBPHs濃度為45.5mg/mL，解吸劑為80%乙醇。

動態(tài)吸附實驗∶室溫條件下，將上述標準上樣溶液分別以1、1.5、2BV/h的流速流經層析柱，用紫外檢測器檢測流出液的 A220nm，以 A220nm=0.05為透過點。比較不同吸附流速時的穿透體積，確定最佳吸附流速［3］。

動態(tài)解吸實驗∶將上述標準上樣溶液以1BV/h流速流經層析柱，直至動態(tài)吸附平衡;然后用超純水以1BV/h的流速洗滌層析柱，每5mL收集1管，測定電導率。當電導率與超純水接近一致且流出液A220nm=0.05時，再用80%乙醇以2.0mL/min流速經過層析柱，每5mL收集一管，測定A220nm，直至吸光度接近0.01為止，繪制動態(tài)解吸曲線。將解吸液合并后測定其肽濃度，計算脫鹽率和回收率［4］。

1.3 DPPH·自由基清除活性的研究

DPPH·自由基清除活性的測定方法參考文獻［5］。HSC50為半清除濃度，即自由基清除率為50%時所需的肽濃度。HSC50值越小，表明達到半清除率所需濃度越低，自由基清除能力越強。

1.4 成分分析

氮含量測定∶參照GB/T5009.5－ 2003;多肽含量測定∶Folin－酚法;灰分含量測定∶參照GB/T5009.4－2003。

表2 不同大孔吸附樹脂對KBPHs的靜態(tài)吸附和解吸性能

2 結果與討論

2.1 離子交換樹脂脫鹽工藝的確定

2.1.1 離子交換樹脂裝柱量的確定 實驗表明，當進樣量為7.5倍柱體積(BV)時，陽離子樹脂達到飽和;當進樣量為5BV時，陰離子交換樹脂達到飽和，故確定陰陽離子交換樹脂裝添量以2∶3裝柱，即732陽離子裝添量200mL，711陰離子交換樹脂裝添量為300mL。

2.1.2 流速的確定 酶解液的脫鹽率與流速、柱長、柱徑及溫度有很大關系，當柱長較長、柱徑較細時，脫鹽率較高，因為柱徑/柱高越小，柱的塔板數越高，離子在柱中達到交換平衡的次數越多。蛋白酶解液以不同流速通過離子交換柱后，其脫鹽率和氮回收率變化情況如表1所示。

表1 離子交換樹脂脫鹽后的氮回收率和脫鹽率

由表1可知，當洗脫流速從5BV/h增加到8BV/h時，總氮回收率從60.61%升高至69.42%，而脫鹽率則由72.77%降低至61.24%，進一步增大流速至10BV/h時，總氮回收率雖然增加(83.58%)，但脫鹽率則進一步降至57.15%。這是由于當洗脫流速較小時，酶解液與樹脂之間有較長的傳質交換時間，部分離子化的肽可較大程度上被交換到樹脂上造成蛋白回收率較低;當流速過大時，又有部分鹽離子來不及交換到樹脂上就被洗脫下來，導致脫鹽效果不理想;綜合考慮脫鹽率和氮回收率兩方面因素，選擇5BV/h的洗脫流速進行脫鹽較為合理。

2.2 大孔吸附樹脂脫鹽工藝的確定

2.2.1 大孔吸附樹脂的篩選 本文考察了4種非極性大孔吸附樹脂對KBPHs的靜態(tài)吸附和解吸性能。結果見表2。

由表2可知，H103大孔吸附樹脂的吸附性能最好，比較樹脂的物理結構參數，發(fā)現其比表面積最大，這可能是影響樹脂吸附效果的重要因素。因為比表面積決定了吸附劑的飽和吸附量，而孔徑等其它物理結構特性對樹脂的吸附效果影響不大［3］，同時H103大孔樹脂對KBPHs具有較強的選擇吸附性。從靜態(tài)吸附與解吸特性來看，H103樹脂不僅具有較高的吸附率和較大的吸附量，而且解吸率較高，故選擇該樹脂對KBPHs進行脫鹽研究。

2.2.2 不同吸附流速對H103大孔樹脂吸附性能的影響 對于相同濃度的樣品溶液，若吸附流速過大，被吸附物質來不及擴散到樹脂內表面就提前泄露而造成樣品流失，導致樹脂吸附量下降;反之，吸附流速過小則吸附時間就會延長。所以確定最佳的吸附流速常常綜合考慮樹脂的吸附效果和工作效率。不同吸附流速下H103大孔吸附樹脂對KBPHs的穿透曲線如圖1所示。由圖1可知，流速對吸附性能有明顯的影響。隨著吸附流速由1BV/h提高到2BV/h，穿透曲線斜率增大，說明吸附速度增大，穿透點明顯提前，流出液的穿透點通液量減小了38.65%，因而本實驗將吸附流速確定為1BV/h。

圖1 不同吸附流速條件下穿透曲線

2.2.3 H103動態(tài)解吸特性 用80%乙醇以2.0mL/min的流速流經層析柱，對大孔吸附樹脂吸附的KBPHs進行解吸，繪制動態(tài)解吸曲線，結果見圖2。由圖2可知，80%乙醇對H103樹脂進行動態(tài)解吸時，隨著解吸的進行，解吸液中多肽濃度逐漸增加，大約31min時出現洗脫峰。35min后解吸曲線趨于平緩，洗脫速度緩慢，可能是酶解液中相對分子質量較大的少量未水解蛋白組分在80%乙醇中的溶解度較低而不易洗脫下來所致。當解吸時間為100min時，KBPHs的回收率達82.37%。

圖2 80%乙醇對H103樹脂動態(tài)解吸曲線

2.3 脫鹽效果分析

從脫鹽率、DPPH·清除活性以及理化成分等指標綜合考察2種脫鹽方法對KBPHs的脫鹽效果，分析結果見表3。從表3可知，大孔吸附樹脂法比離子交換樹脂法脫鹽更加有效，脫鹽率達到87.31%，遠高于離子交換樹脂法(72.77%);同時大孔樹脂脫鹽后KBPHs的DPPH·清除活性有所提高，HSC50從脫鹽前的1.58mg/mL降低到脫鹽后的0.53mg/mL，也高于離子交換樹脂法(0.74mg/mL)，說明經大孔吸附樹脂純化脫鹽后，相對分子質量較小的抗氧化活性肽得到了有效的富集。從脫鹽前后產品的理化成分來看，脫鹽后KBPHs的蛋白質和多肽相對含量都有所提高，灰分含量顯著下降，尤其經過大孔樹脂脫鹽后，蛋白含量達到91.25%，符合一級大豆肽粉國家標準(GB/T22492－2008)的要求。

表3 不同方法對KBPHs脫鹽的效果分析

3 小結

與離子交換樹脂脫鹽相比，采用大孔吸附樹脂對蕓豆蛋白酶解物進行脫鹽純化處理更加有效，產品純度高，適宜于工業(yè)化生產。H103大孔吸附樹脂脫鹽最佳條件為pH4.5、濃度45.5mg/mL的KBPHs液以1BV/h的流速上樣、1BV/h的流速水洗、2mL/min的80%乙醇解吸。該條件下，H103大孔樹脂對KBPHs的脫鹽率為87.31%，回收率達82.37%。脫鹽后KBPHs中灰分含量僅為1.81%，DPPH·清除活性的HSC50值為0.53mg/mL。

［1］趙一明，王璋，許時嬰.大孔吸附樹脂對酪蛋白非磷膚脫鹽效果的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(11):22－25.

［2］國家技術監(jiān)督局.GB/T5476－1996離子交換樹脂預處理方法［S］.北京:中國標準出版社，1996.

［3］袁曉晴，顧小紅，湯堅.采用大孔吸附樹脂對癲葡萄酶解物進行脫鹽［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(6):57－61.

［4］任清，張曉平，趙世鋒.利用大孔吸附樹脂DA201－CⅡ對燕麥蛋白水解液脫鹽的研究［J］.食品科學，2009，30(10): 118－122.

［5］王玉麗，任海偉，李志忠.用清除DPPH自由基法評價藥黑豆色素的抗氧化能力［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(8): 102－105.

Comparative study on desalinization process of kidney bean protein hydrolysates

ZHANG Fei，REN Hai－wei*，TANG Xue－h(huán)ui，LI Xue，YUAN Ya－lan，GAO Yu－jing，SU Xue－yan
(College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China)

In order to obtain optimal technological processing for desalinization of kidney bean protein hydrolysates (KBPHs)，comparison between ion exchange resin(IER)and macroporous adsorption resin(MAR)was conducted and the optimal conditions of the two methods was determined.Physicochemical compositions and DPPH· scavenging activities of KBPHs using both desalinization methods were also compared.The results showed that the desalinization effect of MAR was better than that of IER.The experiments of static adsorption and desorption showed that MAR H103 had the highest adsorption－desorption capability to KBPHs among 4 resins.In further study，the optimal desalination conditions of KBPHs with the resin H103 were confirmed as follows:pH of KBPHs 4.5，concentration of KBPHs 45.5mg/mL，flow rate of water washing 1BV/h，and desorption rate of 80%ethanol 2.0mL/min.Under these conditions，the desaltion rate reached about 87.31%，and the recovery of KBPHs was about 82.37%.In the optimization of condition，KBPHs had a remarkable DPPH· scavenging activities，HSC50was 0.53mg/mL.

kidney bean protein hydrolysate(KBPH);ion exchange resin;macroporous adsorption resin; desalination;DPPH·scavenging activities

TS210.1

B

1002－0306(2011)11－0309－04

2010－01－04 *通訊聯系人

張飛(1981－)，男，助理研究員，研究方向:生物學。

2009年國家大學生創(chuàng)新計劃項目;甘肅省青年科技基金(1107RJYA065)。