酶法水解紅豆粉特性的研究

李 楊，江連洲，*，劉 琪，齊寶坤，王勝男，王 梅

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

酶法水解紅豆粉特性的研究

李 楊1，2，江連洲1，2，*，劉 琪1，齊寶坤1，王勝男1，王 梅1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

采用酶法提取紅豆蛋白，篩選出5種蛋白酶，確定所選用的堿性蛋白酶作為水解酶;得出堿性蛋白酶提取紅豆蛋白的最佳條件:pH為8.8，加酶量為3.5%，溫度為56℃，時(shí)間為3.5h，料液比為1∶6.8，經(jīng)過驗(yàn)證與對比實(shí)驗(yàn)可知在最優(yōu)酶解工藝條件下蛋白得率可達(dá)到73.34%。

酶法，紅豆蛋白，紅豆

紅豆(Phaseolus angularis)，菜豆屬，豆科，為一年生草本植物。紅豆，又稱為小豆、紅小豆、赤豆、赤小豆、飯豆、金豆［1］。紅豆原產(chǎn)于我國，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，紅豆的栽培和利用技術(shù)在我國已有2000多年的歷史。紅豆除有較高的營養(yǎng)價(jià)值外還有較高的藥用價(jià)值，《本草綱目》亦將紅豆列為“本經(jīng)中品”，稱紅豆能“下水腫，排癰腫膿血，療寒熱熱中消渴，止泄痢，利小便，下腹脹滿，吐逆卒僻，治熱毒，散惡血，除煩滿，通氣，健脾胃，令人美食［2］。赤豆種子中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)代研究表明，每100g赤豆中約含蛋白質(zhì)20.09g、脂肪0.59g、糖類58.59g、粗纖維4.99g、總膳食纖維23.59g及微量維生素［3－4］。此外，還含有三菇皂貳、植物奮醇、色素、無機(jī)鹽等有效成分，紅豆除直接食用外，主要用于提取蛋白質(zhì)和淀粉。我國對紅豆蛋白的開發(fā)和利用很有限，隨著人民生活水平的提高和健康意識的加強(qiáng)，逐步開展對紅豆蛋白的研究，開發(fā)和利用紅豆蛋白資源，對于改善人們的膳食結(jié)構(gòu)具有重要意義。由于酶制劑工業(yè)的發(fā)展，張強(qiáng)等［5］利用2709堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制備抗氧化肽并利用sephadexG－25、DEAE52纖維素分離純化玉米抗氧化肽，并用幾種不同的實(shí)驗(yàn)體系研究其體外抗氧化活性。代卉等［6］研究了Alcalase水解小麥蛋白制備的肽的抗氧化活性。任海偉等［7］利用堿性蛋白酶與中性蛋白酶對黑豆蛋白進(jìn)行酶解制備抗氧化肽。采用酶法水解蛋白質(zhì)，不僅水解度(DH)容易控制，而且組成蛋白質(zhì)的氨基酸不容易被破壞;此外由于蛋白酶具有底物特異性，采用不同蛋白酶水解蛋白質(zhì)能釋放不同活性的酶解物［8－9］。酶法水解進(jìn)程一般通過水解參數(shù)來控制，最主要的是溫度、水解時(shí)間、pH和酶與底物比(E/S)。水解時(shí)間與DH有關(guān)，水解時(shí)間越長，DH越高［10］。本文就酶法水解紅豆，選出了最佳用酶，并得出protest 6L酶提取紅豆蛋白的最佳參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆 市售;protex 6L堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、AS1398中性蛋白酶 丹麥Novo公司。

粉粹機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠上海申鹿均質(zhì)機(jī)廠;精密電動攪拌機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;電子分析天平 梅勒特－托利多儀器(上海)有限公司;pHS－25型酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠;HYP消化爐、半自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 紅豆→清理→研磨→水分調(diào)節(jié)→粉碎60目過篩→調(diào)節(jié)溫度和pH→加酶水解→滅菌→離心分離→殘?jiān)稍铩⒎鬯椤ǖ?/p>

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 原料基本成分的測定方法 粗蛋白含量的測定參照GB/T5009.5－ 2003;水分含量的測定參照GB/T5009.3－ 2003;粗脂肪含量的測定參照 GB/ T5009.6－ 2003;灰分的測定參照GB/T5009.4－ 2003;淀粉含量測定參照GB/T5009.9－2003。

1.2.2.2 蛋白得率的計(jì)算公式 總蛋白提取率(%) =(大豆含總蛋白質(zhì)量－酶解提取后殘?jiān)鞍踪|(zhì)量)/大豆含總蛋白質(zhì)量×100%

1.2.3 protex 6L酶提取紅豆肽的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 pH對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個(gè)四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調(diào)節(jié)pH分別為7、8、9、10、11，溫度60℃，加入1.5mLprotest 6L酶，攪拌浸取3.5h，溶液離心30min(4000r/min)，沉淀干燥后稱量，沉淀超微粉碎，消化及定氮。

1.2.3.2 酶用量對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個(gè)四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調(diào)節(jié)pH至8.5，保持溫度60℃，分別加入0.5、1、1.5、2、2.5 protest 6L酶，其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 料液比對紅豆肽得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個(gè)四頸瓶中，分別按1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8固液比加蒸餾水浸泡，調(diào)節(jié)pH至9，溫度60℃，加入1.5mLprotest 6L酶，其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.4 溫度對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個(gè)四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調(diào)節(jié)pH至9，分別保持溫度50、55、60、65、70℃，加入1.5mLprotest 6L酶，其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.5 酶反應(yīng)時(shí)間對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于7個(gè)四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調(diào)節(jié)pH至9，溫度60℃，加入1.5mLprotest 6L酶，分別攪拌浸取2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h，溶液離心30min(4000r/min)，沉淀干燥后稱量，沉淀超微粉碎，消化及定氮。

1.2.4 酶解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素研究的基礎(chǔ)上，選取酶解pH、加酶量、料液比、酶解溫度和酶解時(shí)間5個(gè)因素為自變量，以蛋白得率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其因素水平編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 原料的基本成分

表2 紅豆主要成分(%)

2.2 酶制劑的篩選

利用1.2.1方法，采用5種不同的酶制劑進(jìn)行酶解其結(jié)果見圖1。由圖1結(jié)果可以看出，堿性蛋白酶優(yōu)勢最大，所以本實(shí)驗(yàn)選擇堿性蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶制劑對蛋白得率的影響

2.3 堿性蛋白酶提取大豆蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

圖2 各單因素對蛋白得率的影響

由圖2(A)結(jié)果可以看出，當(dāng)加酶量大于3%時(shí)蛋白得率明顯增加，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中加酶量水平選擇2%～4%。由圖2(B)結(jié)果可以看出，酶解溫度在60℃附近蛋白得率有較大值出現(xiàn)，考慮到交互作用，所以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶解溫度選擇在50～70℃。由圖2(C)結(jié)果可以看出，酶解時(shí)間大于3h蛋白得率明顯增加，但當(dāng)酶解時(shí)間大于4h，蛋白得率無明顯變化，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中酶解時(shí)間選擇3～4h。由圖2(D)結(jié)果可以看出，料液比在1∶6處蛋白得率達(dá)到最大值，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中料液比選擇1∶6～1∶8。由圖2(E)結(jié)果可以看出，pH在8.5～9.5附近有較大值出現(xiàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中pH選擇8～10。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行過程優(yōu)化。以x1、x2、x3、x4、x5為自變量，以蛋白得率為響應(yīng)值y，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)號1～26為析因?qū)嶒?yàn)，27～36為10個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS9.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下∶

回歸分析與方差分析結(jié)果見表4，響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果見表5，降維分析見圖3，交互相顯著的響應(yīng)面分析見圖4。

表4 回歸與方差分析結(jié)果

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著并且該模型R2=92.39%，R2Adj=82.24%，說明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測。由F檢驗(yàn)可以得到各因素貢獻(xiàn)率為x4＞x2＞x1＞x5＞x3，即酶解時(shí)間＞加酶量＞pH＞料液比＞酶解溫度。由圖3可以看出各因素對考察指標(biāo)蛋白得率的影響規(guī)律。

表5 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化分析方法對回歸模型進(jìn)行分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果見表5，由表5可知，當(dāng)酶解pH為8.8，加酶量為3.5%，溫度為56℃，時(shí)間為3.5h，料液比為1∶6.8，響應(yīng)面有最優(yōu)值為73.34%±0.99%。

由圖3各酶解參數(shù)對蛋白得率的降維分析可知，蛋白得率隨酶解pH的增加先增加后減小，在pH為8.8時(shí)蛋白得率達(dá)到最大值;蛋白得率隨加酶量的增加而增加，但當(dāng)?shù)鞍椎寐蔬_(dá)到最大值時(shí)將不再增加，而繼續(xù)增加加酶量會增加生產(chǎn)成本;蛋白得率隨酶解溫度變化先增加后減小，這說明堿性蛋白酶在酶解蛋白質(zhì)的時(shí)候受溫度影響;蛋白得率隨酶解時(shí)間的增加而增加，但達(dá)到一定時(shí)間后蛋白得率將不再增大;蛋白得率隨料液比的增加而增大，但達(dá)到一定值后繼續(xù)增加料液比會稀釋底物濃度，所以蛋白得率減小。

圖3 各因素對考察指標(biāo)的降維分析圖

由圖4的分析結(jié)果可明顯看出pH(x1)與酶解溫度(x3)、pH(x1)與酶解時(shí)間(x4)、酶解時(shí)間(x4)與料液比(x5)的交互作用對多肽得率的影響。由此可知酶解pH和酶解時(shí)間與其他因素的交互作用對水解度地影響較大。

圖4 各酶解參數(shù)對總蛋白提取率的降維分析

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下，即酶解pH為8.8，加酶量為3.5%，溫度為56℃，時(shí)間為3.5h，料液比為6.8條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，蛋白得率3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值為73.34%。蛋白得率預(yù)測值為73.1%±0.99%。說明響應(yīng)面分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與回歸方程預(yù)測值吻合良好。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析方法對水酶法提取大豆蛋白的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型為以后的中試以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，并且得到了最優(yōu)酶解工藝條件為酶解 pH8.8、加酶量3.5%、酶解溫度56℃、酶解時(shí)間3.5h、料液比1∶6.8。經(jīng)過驗(yàn)證與對比實(shí)驗(yàn)可知在最優(yōu)酶解工藝條件下蛋白得率可達(dá)到73.34%。

［1］余文慧.食藥兼優(yōu)赤小豆［J］.藥膳食療，2004:43.

［2］韓濤，孫獻(xiàn)軍，李麗萍，等.紅小豆蛋白與淀粉的提取和分離初探團(tuán)［J］.食品工業(yè)科技，1997(5):41－43.

［3］C－F Chau，P C K Cheung，Y－S Wong.Chemical composition of three underutilized tegume seeds grown in China［J］.Food Chemistry，1998:505－509.

［4］中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所，食物成分表［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1992.

［5］張強(qiáng)，闡國仕，陳紅漫.玉米抗氧化肽的分離制備及其體外抗氧化活性的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2005，20(5):36－39.

［6］代卉，施用暉，韓芳，等.小麥肽免疫活性及抗氧化作用的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21:473－476.

［7］任海偉，王常青.黑豆低聚肽的抗氧化活性評價(jià)及其氨基酸組成分析［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(9):46－50.

［8］Guangtao Meng，Ching Yung Ma，David Lee Phillips.Raman spectroscopic study of globulin from Phaseolus angularis(red bean)［J］.Food Chemistry，2003，81:411－420.

［9］Meng G T，Ma C Y.Flow property of globulin from red bean (Phaseolus angularis)［J］.Food Research International，2001，34: 401－407.

［10］Meng G T，Ma C Y.Fourier－transform infrared spectroscopic study of globulin from Phaseolus angularis［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2001，29: 287－294.

Study on the enzymatic hydrolysis of protein from red bean

LI Yang1，2，JIANG Lian－zhou1，2，*，LIU Qi1，QI Bao－kun1，WANG Sheng－Nan1，WANG Mei1
(1.Food College，North East Agriculture University，Harbin 150030，China; 2.Soy Bean Engineering Technique Research Center，Harbin 150030，China)

The aqueous enzymatic process of red beans protein from red beans was introduced.An alkaline proteinase had been screened from 5 proteinases.The optimal condition for red bean protein extraction by alkaline proteinase was 3.5%proteinase，reaction at 56℃，3.5h of hydrolysis，1∶6.8 of material and water ratio，and pH 8.8.The total protein extraction rate reached 73.34%under this optimal condition.

enzymatic hydrolysis method;red bean protein;red bean

TS210.1

A

1002－0306(2011)11－0177－04

2011－08－22 *通訊聯(lián)系人

李楊(1981－)，男，研究生，講師，研究方向:糧油加工。